Ce protocole décrit la comparaison in vitro de deux caractéristiques fonctionnelles principales du rituximab: liant cible et l'induction de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Les méthodes ont été utilisées pour une comparaison côte-à-côte entre le rituximab de référence et un rituximab biosimilaire. Ces tests peuvent être utilisés pendant le développement biosimilaire ou comme un contrôle de qualité dans leur production.
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Article de méthode
Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l' analyse biosimilarité
Dans cet article
Résumé
Résumé
des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) sont pertinentes pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers. Le développement d'anticorps monoclonaux biosimilaires par les entreprises pharmaceutiques est une opportunité de marché, mais il est aussi une stratégie pour accroître l'accès aux médicaments et de réduire les coûts associés à la thérapie. Les protocoles détaillés ici décrivent l'évaluation de la liaison cible et induction CDC par rituximab dans les cellules Daudi. Ces deux fonctions nécessitent différentes régions structurelles de l'anticorps et sont pertinents à l'effet clinique induite par le rituximab. Les protocoles permettent la comparaison côte à côte d'un rituximab de référence et un biosimilaire rituximab commercialisé. Les produits évalués ont montré des différences à la fois dans la liaison cible et l'induction CDC, ce qui suggère qu'il existe des différences physico-chimiques sous-jacentes et en soulignant la nécessité d'analyser l'impact de ces différences dans le cadre clinique. Les méthodes signalées constituent ici simples et peu coûteuses in vitro </ Em> modèles pour l'évaluation de l'activité des biosimilaires rituximab. Ainsi, ils peuvent être utiles au cours du développement de biosimilaires, ainsi que pour le contrôle de la qualité dans la production biosimilaire. En outre, les méthodes présentées peuvent être extrapolés à d'autres anticorps monoclonaux thérapeutiques.
Introduction
Les anticorps thérapeutiques sont des anticorps monoclonaux recombinants (mAbs) développés pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes et chroniques, les troubles neurologiques et autres 1 . À l'heure actuelle, la FDA a accordé l'approbation à plus de 40 hypothèses thérapeutiques, et d'autres devraient atteindre le marché au cours des années suivantes.
Le Rituximab est un anticorps IgG1 monoclonal chimère hautement affinité approuvé pour le traitement du lymphome non Hodgkinien (LNH) CD20 + , NHL folliculaire CD20 + , leucémie lym....
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Protocole
1. Evaluation de la liaison cible par cytométrie de flux
- Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
- Faire 500 ml de milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (H-IFBS).
- Culture des cellules Daudi lymphome de Burkitt (Daudi) et Daudi cellules GFP + à l' aide de RPMI et 2 flacons de culture de 75 cm. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO 2 atmosphère humidifiée jusqu'à ce qu'ils atteignent 6 - 9 x 10 5 cellules / mL.
- Ajouter 50 ml de tampon de coloration par dilution de 1/100 ....
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Résultats
En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, la cible de liaison et l'induction CDC du rituximab de référence ont été comparés en parallèle avec celles d'un biosimilaire rituximab produit et disponible dans le commerce en Asie.
Dans les cellules de Daudi, les deux mAb CD20 liés d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1D). Régressions non linéaires des données de liaison affichent un .......
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Discussion
L'expiration du brevet d'un mAb thérapeutique favorise le développement de biosimilaires. Ainsi, il y a un besoin de méthodes simples qui permettent d'identifier les différences dans les activités cliniques pertinentes de ces produits. Les cellules CD20 + cultivées ont été utilisées pour l'évaluation de deux caractéristiques fonctionnelles clés du rituximab: cible de liaison et l' induction CDC. L'ancienne activité nécessite la reconnaissance de CD20 par la région Fab de mAb, alors que.......
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Déclarations de divulgation
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, et SM Pérez-Tapia sont des employés de UDIBI, qui effectue des études de biosimilarité pour plusieurs sociétés pharmaceutiques.
Remerciements
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 milieu | ATCC | 30-2001 | Modifier la culture en fonction de la lignée cellulaire |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0,4 %, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaire |
| Daudi Burkitt’s Lymphome Cells | ATCC | CCL-213 | Vous pouvez modifier la lignée cellulaire en fonction de l’anticorps d’intérêt |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | GIBCO | 16000-044 | Vous pouvez modifier la source du sérum en fonction des exigences de la lignée cellulaire |
| Complément sérique humain normal | Quidel | A113 | Il est donc approprié pour une utilisation dans des expériences de biocompatibilité, y compris le développement de médicaments, l’analyse de biomatériaux et d’autres applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | Vous pouvez utiliser une large gamme d’options de couleur, compatible avec la plupart des configurations d’instruments pour analyser la viabilité. |
| PECy5 Souris Anti-IgG humaines | BDPharmigen | 551497 | Changer fluorochrome en fonction du filtre et du laser de votre cytomètre en flux Contrôle de l’isotype |
| des IgG humaines | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Changer en fonction de mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Tampon de fixation de cytométrie en flux (1 - 4 % de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Tampon phosphate saline) | GIBCO | 70011-044 | Tampon phosphate sans Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] et sans endotoxines. |
| Plaques de culture cellulaire 96 puits, fond en V | Corning | 29442-068 | Tubes à essai à fond rond de 12 x 75 mm ou plaques de microtitration à fond en V ou en U à 96 puits |
| MabThera (Rituximab) | Roche | &mdash ; | Produit de référence |
| Rituximab | Indien | &mdash ; | Produit biosimilaire |
| Tubes de centrifugation coniques de 15 ou 50 mL | Corning | 430290 ou 430052 | &mdash ; |
| Pointes de pipette | Eppendorf | &mdash ; | Plusieurs configurations de volume sont nécessaires |
| Pipettes | Eppendorf | &mdash ; | Des pipettes à volume réglable sont nécessaires |
| Centrifugeuse 5430/ 5430R modèle | Eppendorf | &mdash ; | Centrifugeuse réfrigérée à vitesse variable (4 à 25 ° C) avec des vitesses allant de 10 à 30 130 & fois ; g |
| Cytomètre en flux | BD Dickinson | &mdash ; | BD FACSAria III ou autre cytomètre en flux |
| Microscope optique et optique Olympus | Olympus | &mdash ; | Quantifier et évaluer la croissance cellulaire |
| Incubateur | SANYO | &mdash ; | Incubateur pour le contrôle de la température et du CO2 aux cellules de culture |
| Enceinte de sécurité biologique | CHC BIOLUS | &mdash ; | Enceinte de sécurité biologique qui sert à protéger le chercheur, le produit et l’environnement. |
Références
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....
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Réimpressions et autorisations
