Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l' analyse biosimilarité

Summary

Ce protocole décrit la comparaison in vitro de deux caractéristiques fonctionnelles principales du rituximab: liant cible et l'induction de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Les méthodes ont été utilisées pour une comparaison côte-à-côte entre le rituximab de référence et un rituximab biosimilaire. Ces tests peuvent être utilisés pendant le développement biosimilaire ou comme un contrôle de qualité dans leur production.

Abstract

des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) sont pertinentes pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers. Le développement d'anticorps monoclonaux biosimilaires par les entreprises pharmaceutiques est une opportunité de marché, mais il est aussi une stratégie pour accroître l'accès aux médicaments et de réduire les coûts associés à la thérapie. Les protocoles détaillés ici décrivent l'évaluation de la liaison cible et induction CDC par rituximab dans les cellules Daudi. Ces deux fonctions nécessitent différentes régions structurelles de l'anticorps et sont pertinents à l'effet clinique induite par le rituximab. Les protocoles permettent la comparaison côte à côte d'un rituximab de référence et un biosimilaire rituximab commercialisé. Les produits évalués ont montré des différences à la fois dans la liaison cible et l'induction CDC, ce qui suggère qu'il existe des différences physico-chimiques sous-jacentes et en soulignant la nécessité d'analyser l'impact de ces différences dans le cadre clinique. Les méthodes signalées constituent ici simples et peu coûteuses in vitro </ Em> modèles pour l'évaluation de l'activité des biosimilaires rituximab. Ainsi, ils peuvent être utiles au cours du développement de biosimilaires, ainsi que pour le contrôle de la qualité dans la production biosimilaire. En outre, les méthodes présentées peuvent être extrapolés à d'autres anticorps monoclonaux thérapeutiques.

Introduction

Les anticorps thérapeutiques sont des anticorps monoclonaux recombinants (mAbs) développés pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes et chroniques, les troubles neurologiques et autres ¹ . À l'heure actuelle, la FDA a accordé l'approbation à plus de 40 hypothèses thérapeutiques, et d'autres devraient atteindre le marché au cours des années suivantes.

Le Rituximab est un anticorps IgG1 monoclonal chimère hautement affinité approuvé pour le traitement du lymphome non Hodgkinien (LNH) CD20 ⁺ , NHL folliculaire CD20 ⁺ , leucémie lymphocytaire chronique et arthrite rhumatoïde ^{2 , 3} . La reconnaissance du CD20, qui est surexprimé dans les cellules B, par rituximab induit l'apoptose; Activation du complément; Et la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ³ . Les brevets de ce médicament ont expiré en Europe et aux États-Unis en 2013 et 2016, respectivement. Ainsi, les entreprises pharmaceutiques du monde entier développent des biosimilaires de rituximab. Comme dans tout autre médicament destiné à la consommation humaine, les biosimilaires doivent être approuvés par les organismes de réglementation. Les directives internationales indiquent que, pour les anticorps antirétroviraux, la biosimilarité devrait être démontrée en comparant les caractéristiques physico-chimiques, la pharmacocinétique, l'efficacité et la sécurité des produits nouveaux et de référence ⁴ .

En conséquence, les méthodologies utilisées dans ces comparaisons doivent évaluer les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des mAbs, en particulier ceux ayant une pertinence clinique. À cette fin, les essais in vitro présentent plusieurs avantages par rapport aux expériences in vivo (revues dans Chapman et al. ) ⁵ : i) les études in vitro sont plus sensibles aux différences entre le biosimilaire proposé et le produit de référence; Ii) des études in vivo doivent être effectuées dans des espèces pertinentes, qui, pour de nombreux mAbs, sontles primates non humains; et iii) étant donné que le mécanisme d'action, la toxicologie préclinique et les effets cliniques du produit de référence sont bien connues, dans des études in vivo avec biosimilaires ne peuvent pas fournir des informations utiles supplémentaires. En conséquence, l'orientation de l' Union européenne pour les biosimilaires permet aux candidats d'entrer dans des essais cliniques basés sur des données robustes in vitro seuls ^6.

Nous présentons ici deux tests rapides, économiques et simples qui évaluent l'activité biologique du rituximab en utilisant CD20 ⁺ cellules en culture. Ces tests peuvent être inclus dans le cadre de l'exercice de comparabilité pour les candidats biosimilaires rituximab.

Protocol

1. Evaluation de la liaison cible par cytométrie de flux

1. Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
   1. Faire 500 ml de milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (H-IFBS).
   2. Culture des cellules Daudi lymphome de Burkitt (Daudi) et Daudi cellules GFP ⁺ à l' aide de RPMI et ² flacons de culture de 75 cm. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO ₂ atmosphère humidifiée jusqu'à ce qu'ils atteignent 6 - 9 x 10 ⁵ cellules / mL.
   3. Ajouter 50 ml de tampon de coloration par dilution de 1/100 H-IFBS dans du PBS; ce tampon est stable à 2 - 8 ° C pendant au moins un mois.
   4. Préparer les solutions de test pour la référence et les mAb biosimilaires. Faire dix 1: 2 dilutions en série (500 ul chacun) dans du tampon de coloration, à partir de 5 ug / mL.
   5. Utiliser un tampon pour diluer la coloration d'IgG humaine (témoin d'isotype) à 5 ug / mL et PE-Cy5 de souris anti-IgG humaine (anticorps secondaire) à la conQue suggère le fabricant.
   6. Préparer 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (tampon de fixation).
2. Reliure cible
   1. Recueillir les suspensions de cellules Daudi et Daudi GFP ⁺ dans les flacons de culture de 75 cm ² et les transférer dans un tube centrifuge de 15 ml. Centrifuger à 400 xg pendant 5 min.
   2. Lavez les cellules en ajoutant 5 ml de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire à 400 xg pendant 5 min.
   3. Remettre en suspension les cellules dans le PBS et effectuer un bilan cellulaire et une analyse de viabilité avec du bleu trypan. Utilisez des cultures avec des niveaux de viabilité cellulaire ≥ 95% pour l'analyse.
   4. Diluer la suspension cellulaire à 4 x 10 ⁶ cellules / mL avec un tampon de coloration à froid.
   5. Dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml, ajouter 50 μL de suspension cellulaire à 100 μL des différentes concentrations d'essai de la référence ou des mAbs biosimilaires. Inclure des répliques pour chaque condition expérimentale.
   6. Préparez des tubes supplémentaires pourContrôle de l'isotype (IgG1 humain au lieu de rituximab) et contrôle négatif (anticorps secondaire sans anticorps primaire).
   7. Incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 min.
   8. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire à 400 xg pendant 5 min à 10 ° C. Jeter le surnageant.
   9. Suspendre les cellules dans 100 μL de l'anticorps secondaire et incuber pendant 20 à 30 minutes à 4 ° C, protégé de la lumière.
   10. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et suspendez-les dans 200 μL de tampon de fixation.
   11. Analyser les cellules sur un cytomètre de flux.
       NOTE: Le signal reste stable pendant plusieurs jours si les échantillons sont stockés à 4 ° C et protégés de la lumière.
3. L'acquisition des données
   1. Ouvrez deux tableaux de points sur une feuille de calcul du logiciel d'exploitation du cytomètre de flux. Réglez le FSC-A contre le FSC-H dans le premier et le FSC-A contre le SSA-A dans le second. Ouvrez un histogramme pour le canal PE-Cy5.
   2. Dans la trame FSC-A versus FSC-H, faites une porte (R1) en sélectionnant des événements de sondage ( Figure 1A ).
   3. Définissez la population R1 dans le tracé de points FSC-A versus SSA-A, puis créez une nouvelle porte (R2) en sélectionnant des cellules cibles ( Figure 1B ). Réglez la population R2 dans l'histogramme d'intensité PE-Cy5 pour voir la répartition de la fréquence des cellules.
   4. Réglez la limite d'intensité de fluorescence inférieure (FI) pour le canal PE-Cy5 en utilisant le contrôle négatif et isotype ( Figure 1C ).
   5. Acquérir 10 000 événements dans R2 à partir de l'échantillon avec la concentration plus élevée du produit de référence. FI de cet échantillon devrait être le plus élevé attendu ( figure 1C ).
   6. Acquérir le reste des échantillons.
   7. Pour chaque échantillon, obtenir l'intensité médiane de fluorescence (IMF) dans le canal PE-Cy5.
   8. Pour les échantillons avec le mAb de référence ou biosimilaire, calculez la différence entre l'IMF d'échantillon et celle de la commande isotype (ΔMFI).

2. Évaluation de la CDC

1. Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
   1. Préparer des cellules du milieu de culture cellulaire et de culture Daudi et Daudi GFP ⁺ comme décrit ci - dessus (étapes 1.1.1 - 1.1.2).
      NOTE: En outre, le test CDC exige RPMI sans sérum.
   2. Diluer complément normal de sérum humain (LHNC) 1: 2 avec du RPMI sans sérum. Préparer 2,5 mL.
   3. Préparer 1 ml d'inactivé par la chaleur (30 min / 56 ° C) NHSC dilué à 1: 2 avec du milieu RPMI.
   4. Préparer des ensembles de solutions de tests pour la référence et les mAb biosimilaires dans RPMI sans sérum. Faire dix dilutions (200 ul chacun) de 1 à 0,025 ug / mL.
2. essai CDC
   1. Recueillir les cellules Daudi et Daudi GFP ⁺ à partir des cultures et de quantifier la viabilité cellulaire (voir les étapes 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Préparer une suspension de cellules avec 4 x 10 ⁵ cellules / ml dans du RPMI sans sérum.
   3. Ajouter50 μL de suspension de cellules à 50 μL de chaque concentration de test de référence ou de mAb biosimilaire dans des microplaques coniques (V) -bottom à 96 puits. Inclure des répliques pour chaque condition expérimentale.
   4. Préparer des puits supplémentaires pour le contrôle négatif ( c.-à-d. Sans mAb), le contrôle de la mort basale ( c.- à-d. Le NHSC inactivé par la chaleur en présence d'un mAb) et le contrôle positif de coloration ( c'est-à-dire les cellules exposées à 50 μL de 70% d'EtOH).
   5. Incuber les cellules pendant 20 à 30 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO ₂ .
   6. Ajouter 50 μL de NHSC (dilué 1: 2) à chaque puits et incuber les cellules opsonisées pendant 2,5 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO ₂ . Utiliser un NHSC inactivé par la chaleur dans les puits de contrôle de la mort basale.
   7. Centrifuger à 400 xg pendant 5 min à 10 ° C. Jeter le surnageant.
   8. Laver les cellules en ajoutant 150 μL de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire pendant 5 min à 400 xg et 10 ° C. DiScard le surnageant.
   9. Colorer les échantillons avec 7-aminoactinomycine (7-AAD), comme décrit précédemment ^{7, 8.}
   10. Analyser les cellules sur un cytomètre de flux le même jour.
3. L'acquisition des données
   1. Ouvrez deux points-parcelles sur une feuille de calcul du flux cytomètre logiciel d'exploitation. Définir ces parcelles comme dans les étapes 1.3.1 - 1.3.3 (Figure 2A-B). Créer une troisième parcelle qui est un point-parcelle pour GFP contre 7 DAA sur la population R2.
   2. Définir les limites de FI adéquates en utilisant les cellules Daudi, les cellules Daudi GFP ^+, et la mort contrôle positif (figure 2C).
   3. Pour chaque échantillon, mesurer le pourcentage de 7 DAA ⁺ cellules cibles. Acquérir au moins 5000 événements de R2.
   4. Calculer la cytotoxicité spécifique induite par mAb en soustrayant le pourcentage de 7 DAA ⁺ dans le contrôle de la mort de base du pourcentage trouvé dans les échantillons avec différentsLes concentrations ent de mAbs (Figure 2D).

3. Analyse biosimilarité

1. Entrez les valeurs de concentration et de réaction dans un logiciel graphique.
2. Générer des graphiques et calculer des régressions non-linéaires avec les considérations suivantes: i) utiliser le log-transformation de la concentration du mAb comme « X »; ii) utiliser le modèle mathématique pente variable (Y = réponse minimum + (réponse maximale - réponse minimum) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * pente de Hill)); et iii) contraindre les valeurs inférieures à zéro, étant donné que la réponse de base a été soustraite.
   NOTE: Les courbes avec une forme sigmoïde symétrique sont attendus.
3. Comparer les ajustements non-linéaires avec un ajustement global à l'aide d'un test F (de nombreux logiciels graphiques incluent cette fonctionnalité).
   NOTE: Ces tests établissent que l'hypothèse nulle que la réponse maximale, logEC _50, et la pente Hill sont les mêmes pour les deux ensembles de données, qui correspond à laQuestion biologique destinée à être abordée.

Results

En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, la cible de liaison et l'induction CDC du rituximab de référence ont été comparés en parallèle avec celles d'un biosimilaire rituximab produit et disponible dans le commerce en Asie.

Dans les cellules de Daudi, les deux mAb CD20 liés d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1D). Régressions non linéaires des données de liaison affichent un R ²

Discussion

L'expiration du brevet d'un mAb thérapeutique favorise le développement de biosimilaires. Ainsi, il y a un besoin de méthodes simples qui permettent d'identifier les différences dans les activités cliniques pertinentes de ces produits. Les cellules CD20 ⁺ cultivées ont été utilisées pour l'évaluation de deux caractéristiques fonctionnelles clés du rituximab: cible de liaison et l' induction CDC. L'ancienne activité nécessite la reconnaissance de CD20 par la région Fab de mAb, alors que...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 milieu	ATCC	30-2001	Modifier la culture en fonction de la lignée cellulaire
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0,4 %, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaire
Daudi Burkitt’s Lymphome Cells	ATCC	CCL-213	Vous pouvez modifier la lignée cellulaire en fonction de l’anticorps d’intérêt
Sérum fœtal bovin (FBS)	GIBCO	16000-044	Vous pouvez modifier la source du sérum en fonction des exigences de la lignée cellulaire
Complément sérique humain normal	Quidel	A113	Il est donc approprié pour une utilisation dans des expériences de biocompatibilité, y compris le développement de médicaments, l’analyse de biomatériaux et d’autres applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	Vous pouvez utiliser une large gamme d’options de couleur, compatible avec la plupart des configurations d’instruments pour analyser la viabilité.
PECy5 Souris Anti-IgG humaines	BDPharmigen	551497	Changer fluorochrome en fonction du filtre et du laser de votre cytomètre en flux Contrôle de l’isotype
des IgG humaines	ThermoFisher Scientific	07-7102	Changer en fonction de mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Tampon de fixation de cytométrie en flux (1 - 4 % de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde )
PBS pH 7.4 10x (Tampon phosphate saline)	GIBCO	70011-044	Tampon phosphate sans Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] et sans endotoxines.
Plaques de culture cellulaire 96 puits, fond en V	Corning	29442-068	Tubes à essai à fond rond de 12 x 75 mm ou plaques de microtitration à fond en V ou en U à 96 puits
MabThera (Rituximab)	Roche	&mdash ;	Produit de référence
Rituximab	Indien	&mdash ;	Produit biosimilaire
Tubes de centrifugation coniques de 15 ou 50 mL	Corning	430290 ou 430052	&mdash ;
Pointes de pipette	Eppendorf	&mdash ;	Plusieurs configurations de volume sont nécessaires
Pipettes	Eppendorf	&mdash ;	Des pipettes à volume réglable sont nécessaires
Centrifugeuse 5430/ 5430R modèle	Eppendorf	&mdash ;	Centrifugeuse réfrigérée à vitesse variable (4 à 25 ° C) avec des vitesses allant de 10 à 30 130 & fois ; g
Cytomètre en flux	BD Dickinson	&mdash ;	BD FACSAria III ou autre cytomètre en flux
Microscope optique et optique Olympus	Olympus	&mdash ;	Quantifier et évaluer la croissance cellulaire
Incubateur	SANYO	&mdash ;	Incubateur pour le contrôle de la température et du CO2 aux cellules de culture
Enceinte de sécurité biologique	CHC BIOLUS	&mdash ;	Enceinte de sécurité biologique qui sert à protéger le chercheur, le produit et l’environnement.