Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l' analyse biosimilarité

Summary

Ce protocole décrit la comparaison in vitro de deux caractéristiques fonctionnelles principales du rituximab: liant cible et l'induction de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Les méthodes ont été utilisées pour une comparaison côte-à-côte entre le rituximab de référence et un rituximab biosimilaire. Ces tests peuvent être utilisés pendant le développement biosimilaire ou comme un contrôle de qualité dans leur production.

Abstract

des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) sont pertinentes pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers. Le développement d'anticorps monoclonaux biosimilaires par les entreprises pharmaceutiques est une opportunité de marché, mais il est aussi une stratégie pour accroître l'accès aux médicaments et de réduire les coûts associés à la thérapie. Les protocoles détaillés ici décrivent l'évaluation de la liaison cible et induction CDC par rituximab dans les cellules Daudi. Ces deux fonctions nécessitent différentes régions structurelles de l'anticorps et sont pertinents à l'effet clinique induite par le rituximab. Les protocoles permettent la comparaison côte à côte d'un rituximab de référence et un biosimilaire rituximab commercialisé. Les produits évalués ont montré des différences à la fois dans la liaison cible et l'induction CDC, ce qui suggère qu'il existe des différences physico-chimiques sous-jacentes et en soulignant la nécessité d'analyser l'impact de ces différences dans le cadre clinique. Les méthodes signalées constituent ici simples et peu coûteuses in vitro </ Em> modèles pour l'évaluation de l'activité des biosimilaires rituximab. Ainsi, ils peuvent être utiles au cours du développement de biosimilaires, ainsi que pour le contrôle de la qualité dans la production biosimilaire. En outre, les méthodes présentées peuvent être extrapolés à d'autres anticorps monoclonaux thérapeutiques.

Introduction

Les anticorps thérapeutiques sont des anticorps monoclonaux recombinants (mAbs) développés pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes et chroniques, les troubles neurologiques et autres ¹ . À l'heure actuelle, la FDA a accordé l'approbation à plus de 40 hypothèses thérapeutiques, et d'autres devraient atteindre le marché au cours des années suivantes.

Le Rituximab est un anticorps IgG1 monoclonal chimère hautement affinité approuvé pour le traitement du lymphome non Hodgkinien (LNH) CD20 ⁺ , NHL folliculaire CD20 ⁺ , leucémie lym....

Protocol

1. Evaluation de la liaison cible par cytométrie de flux

1. Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
   1. Faire 500 ml de milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (H-IFBS).
   2. Culture des cellules Daudi lymphome de Burkitt (Daudi) et Daudi cellules GFP ⁺ à l' aide de RPMI et ² flacons de culture de 75 cm. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO ₂ atmosphère humidifiée jusqu'à ce qu'ils atteignent 6 - 9 x 10 ⁵ cellules / mL.
   3. Ajouter 50 ml de tampon de coloration par dilution de 1/100 ....

Results

En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, la cible de liaison et l'induction CDC du rituximab de référence ont été comparés en parallèle avec celles d'un biosimilaire rituximab produit et disponible dans le commerce en Asie.

Dans les cellules de Daudi, les deux mAb CD20 liés d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1D). Régressions non linéaires des données de liaison affichent un R ²

Discussion

L'expiration du brevet d'un mAb thérapeutique favorise le développement de biosimilaires. Ainsi, il y a un besoin de méthodes simples qui permettent d'identifier les différences dans les activités cliniques pertinentes de ces produits. Les cellules CD20 ⁺ cultivées ont été utilisées pour l'évaluation de deux caractéristiques fonctionnelles clés du rituximab: cible de liaison et l' induction CDC. L'ancienne activité nécessite la reconnaissance de CD20 par la région Fab de mAb, alors que.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 milieu	ATCC	30-2001	Modifier la culture en fonction de la lignée cellulaire
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0,4 %, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaire
Daudi Burkitt’s Lymphome Cells	ATCC	CCL-213	Vous pouvez modifier la lignée cellulaire en fonction de l’anticorps d’intérêt
Sérum fœtal bovin (FBS)	GIBCO	16000-044	Vous pouvez modifier la source du sérum en fonction des exigences de la lignée cellulaire
Complément sérique humain normal	Quidel	A113	Il est donc approprié pour une utilisation dans des expériences de biocompatibilité, y compris le développement de médicaments, l’analyse de biomatériaux et d’autres applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	Vous pouvez utiliser une large gamme d’options de couleur, compatible avec la plupart des configurations d’instruments pour analyser la viabilité.
PECy5 Souris Anti-IgG humaines	BDPharmigen	551497	Changer fluorochrome en fonction du filtre et du laser de votre cytomètre en flux Contrôle de l’isotype
des IgG humaines	ThermoFisher Scientific	07-7102	Changer en fonction de mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Tampon de fixation de cytométrie en flux (1 - 4 % de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde )
PBS pH 7.4 10x (Tampon phosphate saline)	GIBCO	70011-044	Tampon phosphate sans Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] et sans endotoxines.
Plaques de culture cellulaire 96 puits, fond en V	Corning	29442-068	Tubes à essai à fond rond de 12 x 75 mm ou plaques de microtitration à fond en V ou en U à 96 puits
MabThera (Rituximab)	Roche	&mdash ;	Produit de référence
Rituximab	Indien	&mdash ;	Produit biosimilaire
Tubes de centrifugation coniques de 15 ou 50 mL	Corning	430290 ou 430052	&mdash ;
Pointes de pipette	Eppendorf	&mdash ;	Plusieurs configurations de volume sont nécessaires
Pipettes	Eppendorf	&mdash ;	Des pipettes à volume réglable sont nécessaires
Centrifugeuse 5430/ 5430R modèle	Eppendorf	&mdash ;	Centrifugeuse réfrigérée à vitesse variable (4 à 25 ° C) avec des vitesses allant de 10 à 30 130 & fois ; g
Cytomètre en flux	BD Dickinson	&mdash ;	BD FACSAria III ou autre cytomètre en flux
Microscope optique et optique Olympus	Olympus	&mdash ;	Quantifier et évaluer la croissance cellulaire
Incubateur	SANYO	&mdash ;	Incubateur pour le contrôle de la température et du CO2 aux cellules de culture
Enceinte de sécurité biologique	CHC BIOLUS	&mdash ;	Enceinte de sécurité biologique qui sert à protéger le chercheur, le produit et l’environnement.