Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

Résumé

L’électroporation de nouvelle génération est une méthode efficace pour transfecter des cellules Th17 humaines avec de petits ARN afin de modifier l’expression des gènes et le comportement cellulaire.

Résumé

Les lymphocytes T CD4⁺ peuvent se différencier en plusieurs sous-ensembles de lymphocytes T auxiliaires effecteurs en fonction du milieu cytokinique environnant. Les lymphocytes Th17 peuvent être générés à partir de lymphocytes T CD4⁺ naïfs in vitro en les activant en présence des cytokines polarisantes IL-1β, IL-6, IL-23 et TGFβ. Les cellules Th17 orchestrent l’immunité contre les bactéries et les champignons extracellulaires, mais leur activité aberrante a également été associée à plusieurs maladies auto-immunes et inflammatoires. Les cellules Th17 sont identifiées par le récepteur des chimiokines CCR6 et définies par leur facteur de transcription maître, RORγt, et leur cytokine effectrice caractéristique, IL-17A. Les conditions de culture optimisées pour la différenciation des cellules Th17 facilitent les études mécanistes de la biologie des cellules T humaines dans un environnement contrôlé. Ils fournissent également un cadre pour étudier l’importance de gènes spécifiques et de programmes d’expression génique par l’interférence ARN ou l’introduction de micro-ARN (miARN) imitant ou inhibiteurs. Ce protocole fournit une méthode facile à utiliser, reproductible et très efficace pour la transfection transitoire de cellules Th17 humaines primaires différenciées avec de petits ARN à l’aide d’un dispositif d’électroporation de nouvelle génération.

Introduction

Cellules T CD4 ⁺ sont orchestrateurs essentiels de la réponse immunitaire adaptative. Naïf cellules T CD4 ⁺ sont capables de se développer en plusieurs différentes cellules T effectrices (par exemple , Th1, Th2, Th17, etc.), chacun avec son propre ensemble de cytokines caractéristiques et des facteurs de transcription, en fonction du micro - environnement local ^1. Les décisions de la lignée que les cellules T font sont essentielles tant pour l'immunité protectrice et la tolérance à l'auto. Les cellules Th17 sont un sous - ensemble de cellules T connues pour lutter contre les bactéries extracellul....

Protocole

Ce protocole est conforme aux directives de l'UCSF pour l'éthique de la recherche humaine.

1. Préparation de T culture cellulaire, l' isolement des cellules T CD4 ^+, et Th17 Polarisation

1. Le jour 0, le manteau 6 puits des plaques de culture de tissu avec 1,5 ml par puits d'anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C.
   1. En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper....

Résultats

La première étape pour l' élaboration d' un système fiable de électroporation avec succès les cellules Th17 humaines était de générer in vitro robuste différenciées des cultures de cellules Th17 humaines. Les cellules T cultivées dans des conditions de polarisation de Th17 ont exprimé le récepteur de chimiokine CCR6 et le facteur de transcription RORγt (figure 1A, gauche). Ces marqueurs ne sont pas exprimés lorsque les lymphocytes T ont été cultivées dan.......

Discussion

Ce protocole fournit un procédé amélioré pour la livraison de petits ARN dans des cellules Th17 humains. Bien que les cellules Th17 humains ont été utilisés ici, cette méthode de électroporation avec de petits ARN peut être utilisé avec d'autres sous-ensembles T auxiliaires humain primaire, comme Th1, Th2 et Treg. Il n'a pas bien fonctionné pour naïfs cellules T CD4 ⁺ de sorte que les cellules doivent être activées dans la culture avant la transfection. Pour ce protocole, nous avons optimisé le systèm.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42  ;	Clone : eBio64DEC17
anti-humain IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone : 4S. B3
anti-humain CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone : souris SK3
anti-humain CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone : 11A9
anti-humain RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone : Q21-559
anti-humain CD45 eFluor450 ebioscience		48-9459-42	Clone : 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer	Set ebioscience	00-5523-00	Pour la coloration par cytométrie en flux du facteur de transcription intracellulaire
Hu FcR Inhibiteur de liaison Ebioscience purifié		14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, humain	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
Noyau d’anticorps monoclonal	UCSF purifié CD3 Clone	N/A	: OKT-3
LEAF IL-4 IL-4 biolegend purifié		500815 :	MP4-25D2
IFNg anti-humain,	ebioscience	16-7318-85	Clone : NIB42
IL-23 humain recombinant	Peprotech  ;	200-23
IL-1 humaine recombinante ;	Peprotech  ;	200-01B
TGF-&bêta humain recombinant ; 1	Peprotech  ;	100-21C
IL-6 humaine recombinante	Peprotech  ;	200-06
siGENOME Control Pool, non-ciblage #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Humain RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Humain PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ Lymphocytes T Kit d’isolation
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Instrument d’électroporation de nouvelle génération
Neon Tranfection System 10 &mu ; L Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tampon de suspension T	ThermoFisher Scientific	Fourni dans le kit (MPK1096)	"Tampon de résuspension de transfection"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Gradient de densité
Moyen costar Plaques traitées pour la culture tissulaire à 6 puits	Corning	3516	Plaques
à fond platPlaques traitées pour la culture tissulaire costar 48 puits	Corning	3548	Plaques à fond plat
BD Pharm Lyse tampon de lyse, 10x	BD biosciences	555899	Doit préparer 1x solution avec de l’eau distillée avant utilisation

Clone purifié de qualité fonctionnelle