Un In Vitro Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

Summary

Nous décrivons ici une méthode de dialyse à l'équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison du médicament à la caséine à partir de lésions et cavités de la tuberculose pulmonaire. Le protocole est également utilisé avec une matrice dérivée de macrophages en mousse qui est un substitut efficace à la casée.

Abstract

L'éradication de la maladie de la tuberculose nécessite des schémas thérapeutiques qui peuvent pénétrer dans les couches multiples de lésions pulmonaires complexes. La distribution des médicaments dans les noyaux caséeuses des cavités et des lésions est particulièrement crucial car ils abritent des bactéries sous-populations tolérantes médicaments communément appelés persisters. Les procédés existants pour la mesure de la pénétration du médicament dans les lésions de la tuberculose comportent in vivo coûteuses et longues études pharmacocinétiques couplés à des techniques de bioanalyse ou d' imagerie. A été proposé La mesure in vitro du médicament se liant à des macromolécules caseum comme une alternative à ces techniques étant donné que cette liaison entrave la diffusion passive de molécules de médicament à travers caseum. dialyse d'équilibre rapide est un système rapide et fiable pour effectuer des protéines plasmatiques et des études de liaison de tissus. Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif de dialyse d'équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison à la drogue broyats de caseum qui est EXCISDes lésions et des caries des lapins infectés par la tuberculose. Le protocole décrit également comment générer une matrice de substitution à partir de macrophages THP-1 chargés de lipides à utiliser à la place du caséum. Cet essai de liaison caseum / substitution est un outil important dans la découverte de médicaments contre la tuberculose et peut être adapté pour aider à étudier la distribution de médicaments dans des lésions ou des abcès causés par d'autres maladies.

Introduction

Le traitement de la maladie de la tuberculose pulmonaire exige une distribution efficace des médicaments dans différents types de lésions. des lésions nécrotiques et les cavités contiennent des centres caséeux qui abritent des sous-populations de bactéries tolérantes à la drogue ou « persistant ». ^{1, 2} La maladie cavitaire est associée à des taux de guérison inférieurs et un mauvais pronostic. ^{3, 4} études antérieures ont montré, en utilisant des techniques quantitatives et d' imagerie, que la capacité de pénétrer caseum varie considérablement d....

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé avec l'approbation du Comité de soins et de soins pour animaux institutionnels du NIAID (NIH), Bethesda, MD. Toutes les études impliquant M. tuberculosis ont été effectuées dans un laboratoire avec un niveau de confinement de biosécurité 3 (BSL-3).

1. Modèle d'infection de lapin et collection Caseum

1. Infecte les lapins blancs de Nouvelle-Zélande avec M. tuberculosis en utilisant un système d'exposition aux aérosols sans ....

Results

À l'aide de ce protocole, nous avons testé des centaines de composés de développement de médicaments contre la tuberculose pour leur efficacité prédite à la casée pénétrante. La figure 1 permet de visualiser les concepts de base du dosage RED. La membrane de dialyse des inserts RED permet aux petites molécules non liées de se diffuser du puits du donneur au bien récepteur, atteignant finalement un équilibre entre les deux compartiments. Les petites molécules liées à des .......

Discussion

Les lésions et les cavités nécrotiques pulmonaires chez les patients infectés par la tuberculose contiennent des sous-populations de bactéries qui sont récalcitrantes au traitement médicamenteux. Les carottes caséoises de ces structures sont particulièrement responsables d'abriter ces persisters dans un environnement extracellulaire. ^{16 La} répartition favorable des agents anti-bactériens dans ces endroits éloignés est considérée comme un déterminant important de l'efficacité du médicament.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lapins blancs de Nouvelle-Zélande
Mycobacterium tuberculosis	BEI Ressources	NR-13647  ;
Cétathésie (kétamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Santé animale	56344
Anased (xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Santé animale	33198
Euthasol (pentobarbital sodique et phénytoïne sodique) Solution  ;	Virbac	710101
THP-1 lignée cellulaire monocytaire	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² ; Fiole traitée TC (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 média sans glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Sérum fœtal bovin, irradié aux rayons gamma.	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC parabole, 145 mm x 20 mm, ventilée	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma	E6758
Acide oléique  ;	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Plaque de base réutilisable	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/boîte  ;	Fisher Scientific	PI-89809
Outil de retrait d’insert Pierce RED  ;	Fisher Scientific	89812
Joint adhésif	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)  ;	Technologies de la vie  ;	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acétonitrile	Sigma	34998
Méthanol	Sigma	34860
Chlorhydrate de vérapamil	Sigma	V4629
Sel de sodium de diclofénac	Sigma	93484
Solution de bleu de trypan, 0,4 %	Fisher Scientific	15-250-061
Éthanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Accessoire d’homogénéisateur de broyeur à billes, billes métalliques en vrac	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiateur	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO  ; Hémantimètres jetables à puce C	Fisher Scientific	22-600-100
Microscope optique droit	Leica	DM1000
Système de chromatographie liquide binaire	Agilent	1260	de masse multi-composants
	AB Sciex	4000