Article de méthode

préparation et In vitro Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

DOI :

10.3791/55567

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2 mai 2017

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1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit décrit l'efficacité, la livraison non virale de miR aux cellules endothéliales par un vecteur PEI / MNP et leur aimantation. Ainsi, en plus de la modification génétique, cette approche permet d'orientation magnétique des cellules et l'IRM détectabilité. La technique peut être utilisée pour améliorer les caractéristiques des produits thérapeutiques cellulaires.

Résumé

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À ce jour, les traitements chirurgicaux et pharmacologiques disponibles pour les maladies cardiovasculaires (MCV) sont limitées et souvent palliative. En même temps, les thérapies géniques et cellulaires sont des approches alternatives très prometteuses pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cependant, la large application clinique de la thérapie génique est fortement limitée par l'absence de systèmes de délivrance de gènes appropriés. Le développement des vecteurs de transfert de gènes appropriés peut fournir une solution aux défis actuels en thérapie cellulaire. En particulier, les inconvénients existants, tels que l' efficacité limitée et une faible rétention cellulaire dans l'organe blessé, pourrait être surmontée par l' ingénierie cellulaire appropriée (c. -à- génétique) avant la transplantation. Le protocole présenté décrit la modification transitoire efficace et sûr des cellules endotheliales en utilisant une nanoparticule magnétique superparamagnétique polyéthylèneimine (PEI / MNP) de vecteur de délivrance à base de. En outre, l'algorithme et les méthodes de caractérisation des cellules sont définies. Le succès intracellulivraison lar de microARN (miR) dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a été atteint sans affecter la viabilité des cellules, la fonctionnalité ou la communication intercellulaire. De plus, cette approche a été prouvée pour provoquer un effet fonctionnel dans miR de exogène introduite. Fait important, l'application de ce vecteur à base de MNP assure aimantation cellulaire, offrant des possibilités de ciblage magnétique et le suivi IRM non-invasive. Cela peut servir de base à guidés magnétiquement, de la thérapeutique de cellules génétiquement modifiées qui peuvent être contrôlés de façon non invasive avec l'IRM.

Introduction

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Thérapie génique et cellulaire sont des outils puissants qui ont le potentiel pour résoudre les défis actuels dans le traitement CVD. Malgré le fait que ces deux approches sont actuellement testées dans les essais cliniques, ils ne sont pas encore prêts pour l' application clinique large 1. En particulier, une approche commune pour faire face aux défis de la thérapie génique et cellulaire est de développer des vecteurs de transfert de gènes multifonctionnels appropriés pour l'application clinique. L'absence de systèmes d'administration de gènes sûrs et efficaces est la principale préoccupation de la thérapie génique. En même temps, le génie génétique des produits cellulaires avant la transplantation pourrait surmonter les graves défis de la thérapie cellulaire, tels que la faible efficacité (par exemple, dans le domaine cardiaque, seulement ~ 5% d'amélioration fonctionnelle est réalisée une transplantation de cellules post-tige 1 ) et une mauvaise rétention / au greffe site de la lésion (c. -à- rétention cellulaire tombe en dessous de 5 - 10% en quelques minutes à quelques heures post application, quelle que soit la voie d'administration 2, 3, 4).

À ce jour, les vecteurs viraux dépassent largement les systèmes non viraux en termes d'efficacité, ce qui a donné lieu à une plus large application dans les essais cliniques (~ 67%) 5. Toutefois, les véhicules viraux comportent des risques graves, telles que l' immunogénicité (et la réponse inflammatoire subséquente, avec des complications graves), l' oncogénicité et les limites de la taille du matériel génétique porté 6. En raison de ces problèmes de sécurité et les coûts élevés de production de vecteurs viraux, l'utilisation de systèmes non viraux est préférable dans certains cas , 7, 8. Il est particulièrement adapté pour des troubles qui nécessitent une correction génétique transitoire, tels que l'expression de facteurs de croissance qui contrôlent l' angiogenèse (par exemple, pour le traitement CVD) ou la delivery des vaccins.

Dans notre groupe, un système de délivrance a été conçue en combinant ramifié de 25 kDa de la polyéthylèneimine (PEI) et de nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (MNP) liés ensemble par une interaction biotine-streptavidine 9. Ce vecteur est un outil potentiel pour le génie génétique des cellules, ce qui permet de leur aimantation simultanée avant la transplantation. Ce dernier constitue une base pour le guidage magnétique / rétention, ce qui est particulièrement prometteuse de nos jours, comme les techniques de ciblage magnétique avancées sont en cours d' élaboration avec succès 10. En outre, les cellules résultantes magnétiquement sensibles sont susceptibles d'être contrôlés de manière non invasive par imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l' imagerie de particules magnétiques 11, 12.

Dans le cas du vecteur PEI / MNP, polyamine assure la condensation de l'acide nucléique et ainsi la protection de facteur dégradant s, intériorisation de vecteur dans les cellules, et endosomes échapper 5. Les MNP complètent les propriétés de PEI, non seulement en termes de guidage magnétique, mais aussi en réduisant la toxicité connue PEI 7, 13, 14. Auparavant, les propriétés vectorielles PEI / MNP ont été ajustés en termes d'efficacité d'administration ( à savoir, ADNp et miARN) et de la sécurité en utilisant des fibroblastes et des cellules souches mésenchymateuses humaines 15, 16.

Dans ce manuscrit, un protocole détaillé sur l'application de PEI / MNP pour la génération de cellules modifiées miRNA-17 est décrite. A cet effet, les HUVEC sont utilisés et représentent un modèle établi pour l' angiogenèse in vitro. Ils sont difficiles à transfecter et sont sensibles à l' influence toxique 18, 19,ass = "xref"> 20. De plus, nous fournissons un algorithme pour évaluer ces cellules in vitro, y compris leur ciblage, la communication intercellulaire, et la détection IRM.

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Protocole

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Cordons ombilicaux humains pour l' isolement des cellules ont été obtenues après l' accouchement des femmes bien informées, en bonne santé qui ont donné leur consentement écrit à l'utilisation de ce matériau pour la recherche conformément à la Déclaration d'Helsinki. Le comité d'éthique de l'Université de Rostock a approuvé l'étude présentée (reg. N ° A 2011 06, prolongé 23 Septembre 2013).

1. Préparation des complexes Transfection

  1. La biotinylation de la polyéthylèneimine (PEI).
    1. Dissoudre ramifié PEI dans de l'eau ultrapure sous agitation magnétique à 300 - 400 tours par minute pendant 24 heures à la température ambiante (RT) et protégé de la lumière pour obtenir une solution de 0,18 mM. Conserver la solution à 4 ° C.
    2. Mesurer la concentration de groupes amino primaires dans la solution obtenue 21, 22.
      1. Utiliser 2% de solution de réactif à la ninhydrine comme réactif de détection d'amine 23 en mélangeant 100 ul de prediluted échantillon (1: 200 avec de l'eau ultrapure) et 75 ul de réactif ninhydrine. Incuber pendant 30 min à 80 ° C. Refroidir et ajouter 100 pi de 50% d'éthanol pour la stabilisation. Mesurer l'absorbance à 550 nm sur le spectrophotomètre d'absorption.
      2. Créer une courbe standard en utilisant la glycine.
        1. Préparer une solution 0,1 M de valeurs amino-N (0,75 g de glycine dans 100 ml d'eau désionisée) et ses dilutions 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 et 1: 400, 1: 600. Mesurer ces solutions comme à l'étape 1.1.2.1 et créer un terrain avec la concentration et l'absorbance sur les axes.
        2. Sur la base de la courbe obtenue et l'absorbance mesurée de la solution de PEI, définir la concentration des groupes a-amino de PEI.
          REMARQUE: Attention. solution de réactif ninhydrine doit exclusivement être utilisé sous le capot et doit être stocké sous atmosphère d'azote. Il n'est pas utilisable lorsque la couleur de la solution change due à l'oxydation.
    3. Dissoudre 100 mg de liaison de la biotine dans l'eau ultrapure immédiatement avant l'utilisation pour obtenir une solution de 0,01 mM. Calculer la quantité requise de la biotine pour ajouter à la PEI en multipliant la concentration de groupes a-amino en PEI (mesurée à l'étape 1.1.2) par 20 pour obtenir la quantité nécessaire (en mole) de réactif de biotinylation.
      1. Ajouter la solution de biotine à la solution de PEI à un pH de 8-9 et incuber pendant 16 h sous agitation magnétique à température ambiante.
    4. Supprimer la biotine qui n'a pas réagi par Chromatographie d'exclusion de taille 23. Utiliser des colonnes disponibles dans le commerce contenant un milieu approprié de filtration sur gel pour la purification de la 25-kDA PEI et suivre les instructions du fabricant. Prendre des aliquotes après purification pour mesurer la concentration d'amine en utilisant un réactif de détection d'amine (étape 1.1.2), et de déterminer l'efficacité de conjugaison de la biotine (étape 1.2.2). Stocker le biotinylé obtenu PEI à 4 ° C.
  2. Personnagesation de PEI biotinylé.
    1. Déterminer la concentration de groupes a-amino de la PEI après biotinylation, tel que décrit dans l'étape 1.1.2.
    2. Déterminer le degré de PEI biotinylation de vérifier la procédure de conjugaison. Pour la quantification, en utilisant un kit disponible dans le commerce, qui est basé sur l'application du colorant HABA (acide 4'-hydroxyazobenzène-2-carboxylique), afin d' assurer la détermination colorimétrique correcte des niveaux de biotinylation 24, 25. Suivez les instructions fournies par le fabricant.
  3. Filtration de MNP et leur caractérisation.
    1. Filtre MNP revêtue de streptavidine disponible dans le commerce à travers un filtre à seringue de 0,45 um 16 afin d'exclure les plus gros agrégats toxiques. Mesurer la concentration finale en fer en utilisant un essai photométrique norme 26.
    2. Examiner la qualité des MNP filtrés par l'enregistrementla courbe d'aimantation et par imagerie TEM conformément aux protocoles standards 27, 28.
      1. Diluer la suspension MNP avec de l'eau distillée et placer 3 ul de la suspension obtenue sur une grille de cuivre revêtue de carbone Formvar 300 mesh pour l'analyse TEM. , Par la suite placer cette grille sur une lame de verre sur une plaque chauffante et laisser sécher.
      2. Analyser l'échantillon avec un microscope électronique à transmission à 120 kV et à vérifier la teneur élémentaire en utilisant un détecteur de rayons X 27.
  4. étiquetage 3 couleurs des complexes de transfection pour la microscopie de super-résolution.
    1. Étiqueter 0,5% des groupes amino primaires mesurées dans PEI avec colorant NHS-Ester Atto 488 en suivant les instructions du fabricant. Éliminer l'excès de colorant non lié par une Chromatographie d'exclusion de taille, telle que décrite ci-dessus (étape 1.1.4). Mesurer la concentration résultante de groupes amino en utilisant un assa ninhydriney (étape 1.1.2).
    2. D' étiquetage miR (scr-miR) brouillés disponibles dans le commerce avec un colorant Cyanine5 en utilisant un kit de marquage approprié 15 (indiqué dans la liste des matériaux). Mesurer la concentration fluorophore-miR résultant spectrophotométrie.
    3. Étiqueter fraîchement le MNP chaque fois avec un colorant conjugué à la biotine (par exemple, 565 atto-biotine) à un rapport 1: 1000 poids / poids ratio. Appliquer directement le colorant après avoir ajouté le MNP au miR / PEI pendant la formation des complexes de transfection, par les détails dans Delyangina et al. 16.

2. Préparation cellulaire

  1. l'isolement HUVEC.
    1. Isoler les cellules du cordon ombilical directement après l'obtention des cordes à l'aide de digestion à la collagénase de l'intérieur de la veine du cordon; suivre un protocole déjà mis au point 29.
      1. Incuber chaque cordon avec ~ 60 unités / ml de collagénase de type IV de solution dans du tampon - chargés dans til veine ombilicale - à 37 ° C pendant 13 min.
    2. Pour toutes les expériences, mutualiser les HUVEC d'un minimum de 5 patients.
      NOTE: La culture ne doit pas dépasser 4-5 passages. Ne pas utiliser les cellules contaminées par des mycoplasmes, car cela provoque une diminution de l'efficacité de la transfection. contamination par des mycoplasmes doit être testé pour avant de commencer le protocole en utilisant un kit PCR pour la détection très sensible des mycoplasmes.
      1. Test de la présence de mycoplasmes.
        1. Centrifugeuse de 1 ml de surnageant de culture cellulaire pendant 10 min (13 000 xg). Suspension le culot dans 17 ul de dH 2 O et faire bouillir (93 ° C) pendant 3 min. Utiliser 2 ul de la suspension pour amplifier la région d'ADN codant pour des ARN ribosomiques 16S hautement conservées (ARNr) de différentes espèces de mycoplasmes.
        2. Effectuer la PCR en utilisant 10 pmol de chaque amorce (amorce sens: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; amorce inverse: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') en peigneination avec un kit PCR commercial dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 3 min; 45 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 50 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
        3. Analyser le produit de PCR (292 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose.
    3. Soit stocker les cellules obtenues à long terme dans de l' azote liquide , ou les culture dans le milieu de croissance de l' endothélium supplémenté avec 100 U de pénicilline / ml et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidi fi ée contenant 5% de CO 2.
  2. la caractérisation HUVEC.
    1. Caractériser HUVEC isolées en fonction de leur capacité fonctionnelle pour construire des tubes dans la matrice de la membrane basale (par exemple, matrigel) et leur expression du CD31 marqueur endothelial (molécule d'adhésion cellulaire endotheliale des plaquettes, PECAM-1) suivant des protocoles standard 30, 31.

3. transfection

  1. Trypsiniser la culture stock de cellules HUVEC (voir étape 4.1.2.) Et compter manuellement les cellules en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer le HUVEC sur des plaques de puits de culture cellulaire en plastique de taille appropriée, avec une densité de cellules de départ d'environ 13 000 cellules / cm2 de surface de croissance, 48 h avant la transfection jusqu'à 70-80% de confluence est atteinte.
  2. Préparer frais miR / PEI / MNP complexes à chaque fois.
    NOTE: Tout d'abord, les complexes miR / PEI doivent être obtenus (étapes 3.2.1 - 3.2.3); par la suite, les MNP doivent être ajoutés à la solution miR / PEI (étape 3.2.4) afin d'obtenir la dernière miR / PEI / MNP formulation utilisée pour la transfection (étape 3.3).
    1. Calculer la quantité de miR disponible dans le commerce approprié (brouillés, étiqueté ou fonctionnel, voir l'étape 4) en utilisant la concentration du stock fourni par le fabricant. Utiliser 2,5 pmol de miR / cm 2 de surface de croissance de cellules. Diluer le miR dans 5% de solution de glucose à obtenir une concentration finale de 0,125 pmol de miR / uL.
    2. Sur la base de la quantité de miR étape 3.2.1 et le rapport optimal NP de 25 32, de calculer la quantité nécessaire de PEI en utilisant sa concentration mesurée (étape 1.1.2). Diluer le PEI (selon le volume requis calculé) dans un volume égal de solution à 5% de glucose. Ajouter la PEI obtenu préalablement dilué à la solution miR (étape 3.2.1) et vortexer le mélange obtenu pendant 30 s.
    3. Incuber le mélange obtenu miR / PEI pendant 30 min à température ambiante.
    4. Soniquer l'MNP à 35 kHz pour moins 20 min dans le bain d'eau sonication (voir la liste des matériaux) à la température ambiante, ajouter la quantité appropriée de la solution MNP au miR / PEI (5-25 pg de fer / mL de préparé miR / PEI / mélange MNP 16), vortex pendant 30 s, et incuber pendant 30 min à température ambiante avant d' être prêt.
  3. Ajouter le mélange préparé goutte à goutte miR / PEI / MNP directement au milieu de culture sur les cellules. Utilisation du mélange résultant de cul de cellulesmilieu ture avec miR / PEI / MNP dilué dans du glucose comme solution de transfection. Remplacer ce mélange avec du milieu de culture frais 6 h post-transfection.

4. Analyse de la sécurité Vecteur

  1. Examen de la viabilité cellulaire.
    1. Transfecter les cellules HUVEC ensemencées dans une plaque de culture à 24 puits (étapes 3.1 et 3.2); utiliser Cy3-miR que les sondes d'essai et de miR brouillés (scr-miR) que les sondes de déclenchement de commande pour la cytométrie de flux. Incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidi fi ée contenant 5% de CO2 pendant 24 h.
    2. Récupérer le surnageant et les cellules transfectées par trypsinisation à l'aide de trypsine-EDTA 1x dilué dans du PBS ajouté aux cellules pendant 4 min à 37 ° C. Centrifuger à 300 g pendant 10 min et à utiliser pour l'analyse.
    3. Examiner la viabilité cellulaire et de l'efficacité d'absorption miR 24 h après la transfection en utilisant la cytométrie de flux en appliquant un colorant disponible dans le commerce pour distinguer entre les cellules vivantes / mortes; utiliser des protocoles standard 15 . Appliquer les cellules non transfectées comme témoin positif pour la viabilité.
  2. Examiner la sûreté des complexes miR / PEI / MNP pour les cellules dans des essais fonctionnels.
    1. Évaluer l'activité de prolifération des cellules transfectées.
      1. Transfecter des cellules HUVEC ensemencées dans un 12 puits d'une plaque de culture (étapes 3.1 et 3.2) avec anti - sens fonctionnel miR (par exemple, anti-miR92a pour HUVEC 31) et incuber à 37 ° C dans une atmosphère fi ée humidifié contenant 5% de CO2 pendant 24 h.
      2. Utilisation d'un kit disponible dans le commerce pour définir le nombre de cellules en prolifération par coloration avec EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) et la numérisation avec la microscopie confocale à laser. Utilisez les paramètres de microscopie suivants: objectif 40X avec immersion dans l'huile; laser d'excitation 633 nm (pour un colorant 647 nm); 5 champs aléatoires devant être enregistrées dans chaque échantillon. Calculer le taux de cellules en prolifération en divisant le nombre de noyaux colorés EdU par le nombre total de noyaux (Hoechst-teinté).
    2. Évaluer la capacité des cellules transfectées pour former des structures en forme de tube, comme décrit précédemment 17, 31.
      1. Transfecter les cellules HUVEC ensemencées dans une atmosphère de 24 puits d'une plaque de culture (étapes 3.1 et 3.2) avec scr-miR et incuber pendant 48 h à 37 ° C dans une fi humidi é contenant 5% de CO 2. Recueillir les cellules transfectées (comme dans l'étape 4.1.1).
      2. Graine 3,5 x 10 4 cellules HUVEC modifiés dans des plaques à 24 puits revêtues de 140 ul de matrice de membrane basale. Incuber pendant 18 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidi fi ée contenant 5% de CO 2.
      3. Enregistrement des images de 10 champs aléatoires dans chaque puits en utilisant la microscopie confocale à balayage laser (contraste d'interférence différentiel) et analyser en utilisant le logiciel ImageJ avec le plugin « Analyseur angiogénèse ». Inclure des paramètres tels que la longueur totale des branches, le nombre de branches, et le nombre de junctions dans l'évaluation. Comparez cela au témoin non traité.
  3. Examiner l'influence possible de la toxicité des complexes de transfection sur la jonction lacunaire (GJ) médiée communication intercellulaire (GJIC) en testant la récupération de fluorescence après photoblanchiment 3D (FRAP) 33 en 3D.
    1. Ensemencer les cellules sur des lames de verre revêtues de gélatine avec un fond mince adapté pour l'imagerie des cellules vivantes (immersion dans l'huile). Transfecter les cellules comme décrit ci-dessus à l'étape 3.2 de non-marqué, miR non fonctionnel (scr-miR) et incuber pendant 24 h.
    2. Préparer les cellules pour l'imagerie en les chargeant avec calcéine directement avant la microscopie. En particulier, remplacer le milieu de culture avec du milieu frais contenant 5 uM de calcéine, incuber pendant 20 min, on lave avec du PBS, et ajouter du milieu de culture frais. Pré-réchauffer l'incubateur du microscope à 37 ° C et régler la concentration de CO 2 à 5%.
      REMARQUE: Tous les réactifs doivent être chaud pour éviter Contrac cellulairetion avant la mesure.
    3. Utiliser un laser d'excitation 561 nm pour la visualisation des cellules et l'expérience FRAP. Tout d'abord, sélectionner manuellement des cellules de mesure en tant que régions d'intérêt (ROI); les cellules d'essai doivent avoir au moins 3 cellules voisines. Définir une cellule de référence avec la fluorescence brillante, stable qui ne sera pas blanchi. Définir les limites d'un z-stack. Enregistrer la fluorescence de la partie supérieure des cellules vers le bas pour inclure 10 - 15 couches.
    4. Blanchir les cellules d'essai en utilisant une puissance laser de 100% et enregistrer la récupération subséquente de la fluorescence (en raison du transfert de colorant par GJ-spécifique des cellules voisines) au cours de la 15 min suivantes. Enregistrer les données brutes dans les piles z toutes les 60 s. Au total, effectuer les mesures FRAP avec pas moins de 5 - 10 cellules d'essai par expérience. Comparer les résultats aux cellules non transfectées.

5. Test de l'efficacité Transfection

  1. Examen de l'absorption miR.
    1. Préparer les sondes comme décrit dans step 4.1 et les utiliser simultanément pour définir l'absorption miR avec cytométrie en flux.
  2. Confirmer et décrire la localisation intracellulaire des complexes de transfection par microscopie confocale et éclairage structuré à hyper-résolution (SIM).
    1. Ensemencer le HUVEC sur des lamelles de verre revêtues de gélatine placées dans les puits de plaques de culture à 24 puits, comme décrit précédemment (étape 3.1). Transfecter les cellules avec 3 couleurs marqué miR / PEI / MNP (étape 1.4) et incuber pendant 24 h à 37 ° C dans une atmosphère humidi fi ée contenant 5% de CO 2.
    2. Laver les lamelles d'abord avec 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis avec du PBS seulement. Fixer les cellules par incubation dans 4% de paraformaldehyde (PFA) à 37 ° C pendant 15 min et les noyaux tache avec DAPI suivant des protocoles standard 16. Laver 3 fois sur l'agitateur (15 min chacun) pour éliminer l'excès de colorant.
      NOTE: PFA est cancérigène et doit être manipulé avec précaution.
    3. Placez le prepared sur des lames de lamelles microscope en utilisant un milieu de montage approprié, laissez-les sécher au moins pendant 1 h, et de les utiliser pour la microscopie, comme décrit ci-dessous.
    4. Acquérir des images en utilisant un objectif à immersion dans l'huile 63X et les paramètres SIM suivants: 405-, 488-, 561-, et des lignes laser 633 nm pour l'excitation; Mode z-pile avec une profondeur de 32 bits à 5 angles, 5 phases, avec une moyenne de 4; grille G2 avec une ligne de laser 405, G3 avec 488, G4 avec 561, et avec un G5 633.
  3. Évaluer la fonctionnalité du miR délivrée par RT-qPCR dans miR / PEI / MNP-HUVEC par rapport non traitées.
    1. Transfecter les cellules HUVEC ensemencées dans un (3.1 et 3.2) avec miR fonctionnelle antisens (par exemple, anti-miR92a pour HUVEC 31) les étapes de la plaque de culture de 12 puits et incuber pendant 48 h à 37 ° C dans une atmosphère fi ée humidifié contenant 5% de CO 2.
    2. Évaluer la prestation anti-miR92a et le traitement avec RT-qPCR en utilisant des kits disponibles dans le commerce (voir les matériaux); suivez til les instructions du fabricant, comme décrit ailleurs 17, 31. En parallèle, examiner l'expression du gène cible (par exemple, ITGA5 31).
      REMARQUE: livraison antagomir contre miR endogène est préféré sur imitateurs car il assure la mesure du résultat réel de la miR et non pas seulement son accumulation intracellulaire.

6. ciblage cellulaire d'évaluation et de séparation magnétique des cellules

  1. Ciblage cellulaire dans des conditions statiques in vitro.
    1. Transfecter les cellules HUVEC dans une plaque à 24 puits (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, et 15 à 25 ug / mL MNP), incuber pendant 24 h, le lavage, et de recueillir comme décrit ci - dessus (étape 4).
    2. Mélanger le culot cellulaire obtenu à partir de 1 puits avec 1 ml de milieu de culture frais et le placer dans les puits d'une plaque de 12 puits. Fixer un petit aimant localement (sur le côté) au bas de la plaque en utilisant du ruban adhésif.
    3. Incuber la suspension cellulaire pendant 24 h et observer la fixation des cellules et la croissance dans la zone au-dessus de l'aimant et dans la région sans un aimant. Pour une évaluation qualitative, utiliser un microscope inversé classique.
  2. Ciblage cellulaire dans des conditions dynamiques simulées in vitro.
    1. Transfecter les cellules HUVEC dans une plaque à 24 puits par étapes 3.1 et 3.2 (2,5 pmol / cm 2 Cy3-miR, NP 25, et 15 à 25 ug / mL MNP), incuber pendant 24 h, laver, et recueillir par trypsinisation en utilisant 1x trypsine-EDTA dilué dans du PBS ajouté aux cellules pendant 4 min à 37 ° C. Centrifuger à 300 g pendant 10 min.
    2. Mélanger le culot cellulaire obtenu à partir de 1 puits avec 1 ml de milieu de culture frais et la placer dans le puits d'une plaque de 12 puits. Fixer un petit aimant localement (sur le côté d'un puits) en utilisant du ruban adhésif. Placer la plaque de culture sur l'agitateur et on incube la suspension cellulaire pendant 12 heures à 150 tours par minute afin de simuler des conditions dynamiques 34.
    3. Laver les cellules et fixerles utiliser 4% PFA. Colorer les noyaux avec DAPI 16. Enregistrer la fixation des cellules en utilisant la microscopie confocale à balayage laser avec un laser d'excitation 514 nm, le mode z-empilement (5 - 12 tranches) pour obtenir des données brutes, et un maximum de traitement d'image de projection d'intensité pour créer des images pour l'analyse.
  3. L'analyse quantitative des cellules sensibles au champ magnétique et non sensibles.
    1. Transfecter les cellules HUVEC dans un 24 puits d'une plaque (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, et 15 à 25 ug / mL MNP), incuber pendant 24 h, le lavage, et la collecte comme décrit précédemment (étape 6.2.1) . tampon de tri PBS pré-chaud et cellulaire (stérilisé par filtration, voir la liste des matériaux) à 37 ° C. Remettre en suspension le culot cellulaire obtenu à partir de chaque puits avec 500 uL de tampon de tri cellulaire.
    2. Appliquer cette suspension de cellules à une des colonnes de tri magnétique par l'aimant fixe fourni, laver les colonnes sur l'aimant 3 fois avec du tampon de tri cellulaire frais, et de recueillir l'écoulement comme la magnetiquement fraction qui ne répond pas (de magné-).
    3. Retirer les colonnes de l'aimant et de recueillir immédiatement la fraction de cellules magnétiquement sensible (mag +) en poussant le tampon de tri de cellules fraîches à travers la colonne en utilisant un piston.
    4. Centrifugeuse à la fois + mag- et mag à 300 xg pendant 10 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS, compter les cellules et évaluer la viabilité des cellules avec un test d'exclusion au bleu Trypan 35. Utiliser le culot cellulaire obtenu soit pour l' analyse à long terme ( par exemple, re-graines et d' évaluer au bout de 24, 48 et 72 h en culture 17) ou directement par cytométrie de flux (étape 4.1.).
  4. Définir le chargement de fer des cellules transfectées.
    REMARQUE: Au cours de la préparation, tout contact des sondes cellulaires avec des matériaux d'oxyde de fer et les instruments doivent être évités.
    1. Recueillir les cellules HUVEC transfectées et non transfectées contrôle (comme dans l'étape 4.1.1). Laver les cellules deux fois collectés dans 2% de BSA dans du PBS 36 b y mélangeant soigneusement les cellules avec 1 ml de ce tampon de lavage, puis centrifugation à 300 xg pendant 10 min. Remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans 250 ul de PBS, ajouter 100 pl de 4% de PFA, et incuber pendant 20 min pour fixer les cellules. Laver 3 fois avec du PBS, comme décrit ci-dessus.
    2. Remettre en suspension le culot cellulaire résultant fixée dans 110 ul de PBS et transférer dans des tubes de PCR de 100 ul.
      1. Prenons, par comptage des cellules des aliquotes de 10 uL et en utilisant l'échantillon restant pour la spectroscopie de particules magnétiques (MPS).
    3. Effectuer la mesure sur un dispositif MPS disponible dans le commerce. Pendant la mesure, appliquer les paramètres suivants: champ magnétique B = 25 mT entraînement et la fréquence f 0 = 25 kHz. Pour la quantification de fer des échantillons, normaliser la troisième harmonique A 3 de la MPS-spectre correspondant à l'A 3, ref d'un échantillon de référence MNP avec une quantité connue de fer de 2,1 pgxref "> 37. Utiliser des cellules non traitées comme témoins.

7. Définition des limites de détection IRM

  1. Préparation des cellules.
    1. HUVEC à graines dans une plaque à 6 puits et transfecter (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, et 15 à 25 ug / mL MNP) en double ou en triple conformément à la quantité requise de cellules (pour la préparation fantôme). Incuber les cellules pendant 24 h et se laver, recueillir, et les fixer avec 4% PFA, comme décrit précédemment (étape 4).
    2. Compter les cellules obtenues, préparer des aliquotes avec le nombre de cellules appropriées (par exemple, 10 3, 10 4, 10 5, etc.), et ajuster le volume à 50 ul.
  2. préparation fantôme Agarose
    1. Préparer plusieurs couches de 2% d' agarose dans des tubes de 50 ml avec des quantités différentes de cellules transfectées incorporés entre les couches 38. Pendant la préparation, sonication et centrifugation de l'agarose à chaud 38détruire les bulles d'air qui provoquent des artefacts.
      NOTE: Il est important, fantômes contenant 5,5 x 10 5 cellules HUVEC traitées avec des complexes miR / PEI non magnétiques doivent être préparés de la même manière pour servir de témoins.
  3. Numériser l'obtenu dans des fantômes in vitro avec un 7,1 T animale Système d'IRM après avoir placé le fantôme au centre de la bobine, parallèlement à l'axe z du champ magnétique.
    1. Appliquer les paramètres de la séquence ci-après pour l'acquisition d'une séquence en écho de gradient: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4/5 TE / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; angle de bascule = 3 °; matrice = 128 × 128, interpolée à 256 x 256; champ de vision = 42 mm; 100%; moyenne = 1, la longueur du train d'échos = 1; épaisseur de coupe = 1,5 mm; et 16 tranches.
    2. Évaluer la décroissance de signal de tous les quatre temps d' écho et de calculer des cartes R2 * (R2 * = 1 / T2 *) en utilisant un logiciel approprié, comme décrit ailleurs 39.

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Résultats

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L'objectif principal du protocole proposé est de produire sensibles au champ magnétique des cellules modifiées miR et de procéder à leur caractérisation précise (Figure 1). En conséquence, les cellules transfectées efficacement, en réponse à la sélection et l'orientation magnétique et détectables avec l'IRM, doivent être obtenus.

Tout d' abord, l'identité des HUVEC isolées ont été confirmées par coloration typ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La production de cellules génétiquement modifiées chargées de nanoparticules superparamagnétiques pour leur orientations supplémentaires à commande magnétique est présentée dans le protocole actuel. L'application réussie de cette stratégie permet la résolution de certaines difficultés de la thérapie cellulaire, comme une faible rétention et pauvres dans la région prise de greffe blessés 2, 3, 4, en fournissant un produit de...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons pas d'intérêts financiers concurrents à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier G. Fulda (Electron Microscopy Center, Université de Rostock, Allemagne) pour le soutien technique à l'acquisition d'images TEM de nanoparticules superparamagnétiques filtrées et à effectuer leur analyse aux rayons X. Les travaux effectués au RTC Rostock a été soutenu par le Ministère fédéral de l'éducation et de la recherche en Allemagne (FKZ 0312138A, FKZ 316159 et VIP + 03VP00241) et l'État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les Fonds structurels de l'UE (FSE / IV-WM-B34- 0030/10 et FSE / IV-BM-B35-0010 / 12) et par le DFG (DA 1296-1), le Damp-Foundation, et la base de coeur allemand (F / 01/12). Frank Wiekhorst a été soutenu par le programme de recherche de l'UE 7e PC "Nanomag" FP7-NMP-2013-GRAND-7.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotineThermo Scientific21335
-10 Colonnes de dessalageGE Healthcare17085101Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Solution réactive 2 %Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Pierce Biotine Quantitation Kit ThermoScientific28005
Lecteur de microplaques Modèle 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Particules paramagnétiquesPromegaZ5481
Millex-HV Filtre PVDFMerckSLHV013SL0.45 µ ; m
Libra 120 microscope électronique à transmissionZeissAcceleration Voltage 120  ; kV
Sapphire Détecteur de rayons XEDAX-Amatek
Culture cellulaire plastiqueTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ;ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit MirusBio MIR9650
Biotine Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagénse Type IV GibcoThermo Scientific17104019
Milieu de croissance endothéliale, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Pénicilline/StreptomycineThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µ ; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anticorps anti-PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACS colonnesMiltenyi Biotec  ;130-042-201
Kit de coloration à cellules vivantes/mortes dans le proche infrarougeThermo ScientificL10119
Cy3 Controle négatif Pre-miR marqué par colorantThermo Scientific Thermo ScientificAM17120"Cy3-miR » ou « Cyanine-miR3 » dans le manuscrit
Molécules précurseurs de miARN Pre-miR - Contrôle négatif  ;Thermo ScientificAM17110"scr-miR » dans le manuscrit
Inhibiteur synthétique Anti-has-miR92a-3p  ;Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA Système PS.1Zeiss
ParaformaldéhydeSigma Aldrich158127 solution à 4 % dans coloration nucléaire PBS
DAPIThermo ScientificD1306
NucleoSpin Kit d’isolement d’ARNMachery-Nagel740955
mirVana Kit d’isolement de miARNThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA Reverse TranscriptionThermo Scientific4366596
StepOnePlus Système de PCR en temps réelApplied Biosystems
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacitéThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan ThermoScientific000431Mature miRNA Sequence : UAUUGCACUUGUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan testThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan testThermo Scientific001093
18S rRNA EndogeneControl Thermo Scientific4333760F
GelatinSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Rouge-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS bufferMiltenyi Biotec  ;130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
Système d’IRM animale 7,1 TeslaBruker CorporationA7906
Logiciel ImageJInstitutes of Healthmis à niveau avec un dispositif AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSBruker Biospin
Logiciel MatlabMathworks
Anneau Aimant Néodyme  ;magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø ; 10 mm ; la rémanescence est de ~ 1,3  ; T, coercivité &ge ; 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit d’imagerieThermo ScientificC10340
FluorSave RéactifMerck345789
Bain à ultrasonsBandelin electronicType : RK 100 SH
Kit National

Références

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Mots-clés

MicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

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