préparation et In vitro Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

Summary

Ce manuscrit décrit l'efficacité, la livraison non virale de miR aux cellules endothéliales par un vecteur PEI / MNP et leur aimantation. Ainsi, en plus de la modification génétique, cette approche permet d'orientation magnétique des cellules et l'IRM détectabilité. La technique peut être utilisée pour améliorer les caractéristiques des produits thérapeutiques cellulaires.

Abstract

À ce jour, les traitements chirurgicaux et pharmacologiques disponibles pour les maladies cardiovasculaires (MCV) sont limitées et souvent palliative. En même temps, les thérapies géniques et cellulaires sont des approches alternatives très prometteuses pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cependant, la large application clinique de la thérapie génique est fortement limitée par l'absence de systèmes de délivrance de gènes appropriés. Le développement des vecteurs de transfert de gènes appropriés peut fournir une solution aux défis actuels en thérapie cellulaire. En particulier, les inconvénients existants, tels que l' efficacité limitée et une faible rétention cellulaire dans l'organe blessé, pourrait être surmontée par l' ingénierie cellulaire appropriée (c. -à- génétique) avant la transplantation. Le protocole présenté décrit la modification transitoire efficace et sûr des cellules endotheliales en utilisant une nanoparticule magnétique superparamagnétique polyéthylèneimine (PEI / MNP) de vecteur de délivrance à base de. En outre, l'algorithme et les méthodes de caractérisation des cellules sont définies. Le succès intracellulivraison lar de microARN (miR) dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a été atteint sans affecter la viabilité des cellules, la fonctionnalité ou la communication intercellulaire. De plus, cette approche a été prouvée pour provoquer un effet fonctionnel dans miR de exogène introduite. Fait important, l'application de ce vecteur à base de MNP assure aimantation cellulaire, offrant des possibilités de ciblage magnétique et le suivi IRM non-invasive. Cela peut servir de base à guidés magnétiquement, de la thérapeutique de cellules génétiquement modifiées qui peuvent être contrôlés de façon non invasive avec l'IRM.

Introduction

Thérapie génique et cellulaire sont des outils puissants qui ont le potentiel pour résoudre les défis actuels dans le traitement CVD. Malgré le fait que ces deux approches sont actuellement testées dans les essais cliniques, ils ne sont pas encore prêts pour l' application clinique large ^1. En particulier, une approche commune pour faire face aux défis de la thérapie génique et cellulaire est de développer des vecteurs de transfert de gènes multifonctionnels appropriés pour l'application clinique. L'absence de systèmes d'administration de gènes sûrs et efficaces est la principale préoccupation de la thérapie génique. En même te....

Protocol

Cordons ombilicaux humains pour l' isolement des cellules ont été obtenues après l' accouchement des femmes bien informées, en bonne santé qui ont donné leur consentement écrit à l'utilisation de ce matériau pour la recherche conformément à la Déclaration d'Helsinki. Le comité d'éthique de l'Université de Rostock a approuvé l'étude présentée (reg. N ° A 2011 06, prolongé 23 Septembre 2013).

1. Préparation des complexes Transfection

1. La biotinylation de la polyéthylèneimine (PEI).
   1. Dissoudre ramifié PEI dans de l'eau ultrapure sous agitation magnétique à 300 - 400 tours pa....

Results

L'objectif principal du protocole proposé est de produire sensibles au champ magnétique des cellules modifiées miR et de procéder à leur caractérisation précise (Figure 1). En conséquence, les cellules transfectées efficacement, en réponse à la sélection et l'orientation magnétique et détectables avec l'IRM, doivent être obtenus.

Tout d' abord, l'identité des HUVEC isolées ont été confirmées par coloration typ.......

Discussion

La production de cellules génétiquement modifiées chargées de nanoparticules superparamagnétiques pour leur orientations supplémentaires à commande magnétique est présentée dans le protocole actuel. L'application réussie de cette stratégie permet la résolution de certaines difficultés de la thérapie cellulaire, comme une faible rétention et pauvres dans la région prise de greffe blessés ^{2, 3, 4,} en fournissant un produit de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEI 25 kDa	Sigma Aldrich	408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine	Thermo Scientific	21335
-10 Colonnes de dessalage	GE Healthcare	17085101	Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Solution réactive 2 %	Sigma Aldrich	7285
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Pierce Biotine Quantitation Kit Thermo	Scientific	28005
Lecteur de microplaques Modèle 680	Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Particules paramagnétiques	Promega	Z5481
Millex-HV Filtre PVDF	Merck	SLHV013SL	0.45 µ ; m
Libra 120 microscope électronique à transmission	Zeiss		Acceleration Voltage 120  ; kV
Sapphire Détecteur de rayons X	EDAX-Amatek
Culture cellulaire plastique	TPP
NHS-Esther Atto 565	ATTO-TEC GmbH	AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ;	ATTO-TEC GmbH	AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus	Bio MIR	9650
Biotine Atto 565	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
Collagénse Type IV Gibco	Thermo Scientific	17104019
Milieu de croissance endothéliale, EGM-2	Lonza	CC-3156 & CC-4176
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Scientific	15140122	100 U/mL, 100 µ ; g/mL
Matrigel	BD Biosciences	356234
anticorps anti-PECAM-1	Santa Cruz	sc-1506
MS MACS colonnes	Miltenyi Biotec  ;	130-042-201
Kit de coloration à cellules vivantes/mortes dans le proche infrarouge	Thermo Scientific	L10119
Cy3 Controle négatif Pre-miR marqué par colorant	Thermo Scientific Thermo Scientific	AM17120	"Cy3-miR » ou « Cyanine-miR3 » dans le manuscrit
Molécules précurseurs de miARN Pre-miR - Contrôle négatif  ;	Thermo Scientific	AM17110	"scr-miR » dans le manuscrit
Inhibiteur synthétique Anti-has-miR92a-3p  ;	Thermo Scientific	AM10916
LSM 780 ELYRA Système PS.1	Zeiss
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich		158127 solution à 4 % dans coloration nucléaire PBS
DAPI	Thermo Scientific	D1306
NucleoSpin Kit d’isolement d’ARN	Machery-Nagel	740955
mirVana Kit d’isolement de miARN	Thermo Scientific	AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription	Thermo Scientific	4366596
StepOnePlus Système de PCR en temps réel	Applied Biosystems
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité	Thermo Scientific	4368814
has-miR-92a TaqMan Thermo	Scientific	000431	Mature miRNA Sequence : UAUUGCACUUGUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix	Nippon Genetics	LS27
ITGA5 TaqMan test	Thermo Scientific	Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan test	Thermo Scientific	001093
18S rRNA Endogene	Control Thermo Scientific	4333760F
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041
CellTrace Calcein Rouge-Orange	Thermo Scientific	C34851
PBS	Pan Biotech	P04-53500
BSA	Sigma Aldrich
MACS buffer	Miltenyi Biotec  ;	130-091-221
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Système d’IRM animale 7,1 Tesla	Bruker Corporation	A7906
Logiciel ImageJ	Institutes of Health		mis à niveau avec un dispositif AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS	Bruker Biospin
Logiciel Matlab	Mathworks
Anneau Aimant Néodyme  ;	magnets4you GmbH	RM-10x04x05-G	ø ; 10 mm ; la rémanescence est de ~ 1,3  ; T, coercivité &ge ; 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit d’imagerie	Thermo Scientific	C10340
FluorSave Réactif	Merck	345789
Bain à ultrasons	Bandelin electronic	Type : RK 100 SH