Article de méthode

Expression de protéines recombinantes, cristallisation et études biophysiques d'une Bacillus Pyrophosphorylase nucléotidique conservée, BcMazG

DOI :

10.3791/55576

⸱

16 mai 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Dans cet article

Résumé

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Bacillus anthracis est l'agent pathogène obligatoire du charbon inhalatoire fatal, de sorte que les études de ses gènes et de leurs protéines sont strictement réglementées. Une autre approche consiste à étudier les gènes orthologues. Nous décrivons des études biophysicochimiques d'un orthologue de B. anthracis dans B. cereus , bc1531, nécessitant un matériel expérimental minimal et sans problèmes sérieux de sécurité.

Résumé

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Pour surmonter les restrictions et les réglementations de sécurité lors de l'étude des gènes et des protéines à partir de pathogènes vrais, leurs homologues peuvent être étudiés. Bacillus anthracis est un agent pathogène obligatoire qui provoque un inhalation d'anthrax mortel. Bacillus cereus est considéré comme un modèle utile pour étudier B. anthracis en raison de sa relation évolutionniste étroite. Le groupe génétique ba1554 - ba1558 de B. anthracis est fortement conservé avec le groupe bc1531 - bc1535 dans B. cereus , ainsi qu'avec le groupe bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis, indiquant le rôle critique des gènes associés dans le genre Bacillus . Ce manuscrit décrit des méthodes pour préparer et caractériser un produit protéique du premier gène ( ba1554 ) du groupe de gènes de B. anthracis en utilisant une protéine recombinante de son ortholog dans B. cereus , bc1531.

Introduction

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L'expression de protéines recombinantes est largement utilisée pour surmonter les problèmes associés aux sources de protéines naturelles, telles que des quantités limitées de protéines et une contamination nocive. De plus, dans les études sur les gènes et les protéines pathogènes, une souche de laboratoire alternative qui ne nécessite pas de précautions de sécurité supplémentaires peut être utilisée. Par exemple, Bacillus cereus est un modèle utile pour étudier Bacillus anthracis en raison de leur relation évolutive 1 .

B. anthracis est un agent pathogène obligatoire qui provoque un inhalation d'anthraxs mortels chez l'homme et le bétail et peut potentiellement être utilisé comme bioweapon 2 . Ainsi, les études de laboratoire sur B. anthracis sont strictement réglementées par les Centers for Disease Control des États-Unis, nécessitant des pratiques de biosécurité de niveau 3 (BSL-3), qui exigent que la zone de laboratoire soit séparée par une pression ambiante négative. Contrairement à B. anthracis , B. cereus est classé comme un agent BSL-1 et a donc des problèmes de sécurité minimes. B. cereus est un agent pathogène opportuniste qui, lors d'une infection, provoque des intoxications alimentaires qui peuvent être traitées sans assistance médicale. Cependant , parce que B. cereus partage de nombreux gènes critiques avec B. anthracis , les fonctions des protéines de B. anthracis peuvent être étudiées en utilisant les homologues correspondants de B. cereus 1 .

Le groupe de gènes ba1554 - ba1558 de B. anthracis est fortement conservé avec le cluster bc1531 - bc1535 De B. cereus , ainsi qu'avec le groupe bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , en termes d'organisation et de séquence de gènes. En outre, les premiers gènes ( ba1554 , bc1531 et bt1364 ) des grappes respectives sont absolument conservés ( c.-à-d., Identité de séquence à 100% de nucleotide), impieUn rôle critique du produit génique dans les espèces de Bacillus . En raison de son emplacement dans ces grappes de gènes, ba1554 a été mal identifié comme un régulateur de transcription putatif 3 . Cependant, l'analyse de la séquence d'acides aminés du produit ba1554 indique qu'il appartient à la famille MazG, qui a une activité nucléotidique pyrophosphohydrolase et n'est pas associée à l'activité 4 , 5 du facteur de transcription. Bien que les protéines appartenant à la famille MazG soient diverses en ce qui concerne la séquence et la longueur globales, elles partagent un domaine MazG ~ 100 résidus commun caractérisé par un motif EXXE 12-28 EXXD ("X" représente tout résidu d'acide aminé et le nombre Indique le nombre de résidus X).

Le domaine MazG ne reflète pas toujours directement une certaine activité catalytique. Un membre MazG d' Escherichia coli (EcMazG) possède deux domaines MazG, mais surLe domaine C-terminal MazG est enzymatiquement actif 6 . De plus, la spécificité du substrat des enzymes MazG varie en fonction des nucléosides triphosphates non spécifiques (pour EcMazG) vers dCTP / dATP spécifique (pour MazG associée à l'intégrine) et dUTP (pour dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Par conséquent, des analyses bio-physicochimiques de la protéine BA1554 sont nécessaires pour confirmer son activité NTPase et déchiffrer sa spécificité de substrat.

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape que la plupart des laboratoires sans installation de BSL-3 peuvent suivre pour caractériser le produit protéique du gène B. cereus bc1531 , qui est un orthologue de B. anthracis ba1554 , au niveau moléculaire. En bref, BC1531 recombinant (rBC1531) a été exprimé dans E. coli et purifié en utilisant une étiquette d'affinité. Pour les expériences cristallographiques aux rayons X, le cristallisLes conditions de zation de la protéine rBC1531 ont été criblées et optimisées. Pour évaluer l'activité enzymatique du rBC1531, l'activité NTPase a été surveillée colorimétriquement pour éviter les nucléotides marqués par radioactivité qui ont été utilisés classiquement. Enfin, les analyses des données bio-physicochimiques obtenues nous ont permis de déterminer l'état d'oligomérisation et les paramètres catalytiques de RBC1531, ainsi que d'obtenir des données de diffraction des rayons X du cristal RBC1531.

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Protocole

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1. Production de protéines recombinantes et purification de rBC1531

  1. Préparation d'un plasmide d'expression recombinant BC1531 (rBC1531)
    1. Préparer l'ADN génomique de B. cereus 10 .
    2. Amplifier le gène bc1531 à partir d'un modèle d'ADN génomique de B. cereus par réaction en chaîne par polymérase (PCR), en utilisant des amorces avant et inverses (voir la liste des matériaux) pour créer des sites d'enzymes de restriction Bam HI et Sal I, respectivement 10 .
    3. Digérer le produit de PCR et un vecteur pET49b modifié (pET49bm) en utilisant Bam HI et Sal I, comme décrit 11 .
    4. Mélanger le produit de PCR et le vecteur digéré (rapport 3: 1) de l'étape 1.1.3 en utilisant de l'ADN ligase T4 dans une réaction de 10 μL, comme décrit 11 . Incuber à 18 ° C pendant 30 min.
    5. Pipeter 3 μL de la réaction de ligature dans 50 μL de chimieLly compétent E. coli DH5α cellules dans un tube. Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas et placer sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique de 45 s à 42 ° C. Ajouter 1 ml de milieu Luria-Bertani (LB) et faire pousser les cellules en agitant vigoureusement (250 tr / min, 37 ° C, 45 minutes).
    6. Prendre 100 μL des cellules transformées à partir de l'étape 1.1.6 et les étaler sur les plaques LB-agar avec 100 μg / ml de kanamycine (Kan). Incuber pendant ~ 18 h à 37 ° C.
    7. Choisissez des colonies à l'aide d'un bout stérile et développez les cellules dans 3 mL de milieu LB avec 100 μg / mL de Kan; Secouer vigoureusement (250 tr / min, 37 ° C, 18 h).
    8. Préparer l'ADN plasmidique en utilisant un procédé de lyse alcalin-SDS, tel que décrit 10 .
    9. Confirmer la séquence nucléotidique de la construction d'expression rBC1531 en utilisant le séquençage d'ADN 12 .
  2. La surexpression de la protéine rBC1531
    1. Transformer de nouveau la souche E. coli BL21 (DE3) avec rBC1531-expPlasmide de ressaison, comme décrit dans les étapes 1.1.5-1.1.6, pour une surexpression.
    2. Sélectionnez une colonie et faites-la pousser dans 10 mL de milieu LB contenant 50 μg / mL Kan (LB + Kan); Secouez vigoureusement pendant 18 h à 37 ° C.
    3. Inoculer 10 ml de culture de nuit dans 1 L de milieu LB + Kan et pousser à 37 ° C jusqu'à ce que la DO 600 (densité optique à 600 nm) atteigne ~ 0,7.
    4. Immerger la culture dans de l'eau glacée pendant environ 15 min pour refroidir la température à 18 ° C et ajouter le β-D-1-thiogalactopyranoside d'isopropyle (IPTG) à la culture à une concentration finale de 1 mM pour l'expression protéique recombinante. Cultivez la culture à 18 ° C pendant environ 16-18 h.
  3. Purification de rBC1531
    1. Récolter les cellules par centrifugation (5 000 xg, 4 ° C, 30 min). Jeter le surnageant soigneusement afin de ne pas déranger les cellules. Ré-suspendre les cellules dans 50 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 10 mM d'imidazole.
    2. Lyse les cellules deux fois par sonication sur glace pour éviter le surchauffe des lysats cellulaires (temps: 2 min 30 s, cycle sur: 5 s, cycle hors tension: 10 s, amplitude: 38%).
    3. Effacer le lysat cellulaire par centrifugation (~ 25 000 xg, 4 ° C, 30 min).
    4. Mélanger 3 ml de billes de nickel et 60 ml de PBS contenant 10 mM d'imidazole et entraîner par gravité le tampon supplémentaire pour régler les grains de nickel équilibrés dans une colonne de Chromatographie sur verre de 2,5 x 10 cm.
    5. Pipeter pour transférer le surnageant de l'étape 1.3.3 à la colonne avec des perles de nickel pré-équilibrées et incuber à 4 ° C pendant 2 h sur une roue à une vitesse faible (~ 20 tours par minute).
    6. Laisser le surnageant s'écouler par gravité et laver les billes de nickel dans la colonne trois fois avec 100 ml de PBS contenant 10 mM d'imidazole.
    7. Elute rBC1531 protéine en appliquant 4 x 5 mL de PBS contenant 250 mM d'imidazole.
    8. Prendre 15 μL de l'élution à partir de l'étape 1.3.7 et l'exécuter sur 15% de SDS-PAGE. Visualisez les bandes de protéines surLe gel en utilisant la coloration au bleu de Coomassie 10 .
  4. Suppression des étiquettes d'affinité de la protéine rBC1531 par la protéolyse de la thrombine
    1. Pipetter les fractions dans le tube de dialyse (poids moléculaire coupé: 3 kDa) et placer le tube dans un bécher contenant 4 L de tampon compatible avec le clivage de la thrombine (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM et β-mercaptoéthanol 1,5 mM) À 4 ° C pendant la nuit.
    2. Pipettez les fractions et transférez-les dans un tube conique.
    3. Mesurer l'absorbance à 280 nm et estimer la concentration de la protéine rBC1531, comme décrit 13 .
    4. Prendre 50 μg de rBC1531 dans un tube de 0,5 mL et ajouter diverses quantités de thrombine ( c.-à-d., 2, 1, 0,6 et 0,3 unités). Incuber les réactions de rBC1531 et de thrombine à 20 ° C pendant ~ 3 h pour déterminer la moindre quantité de thrombine nécessaire pour cliver l'étiquette d'affinité N-terminal.
    5. Exécutez le rBC1531 et les réactions de thrombine sur un 15%SDS-PAGE et déterminer la quantité la plus faible de thrombine ( p. Ex., 0,3 unité de thrombine pour 50 μg de rBC1531) qui digère complètement l'étiquette d'affinité N-terminal et produit un rBC1531 sans étiquette.
    6. Ajouter 10 mg de protéine rBC1531 et 60 unités de thrombine à un tube de 15 ml et incuber à 20 ° C pendant environ 3 h pour la réaction de protéine de thrombine.
    7. Appliquer des normes de filtration sur gel à une colonne de Chromatographie d'exclusion de taille (SEC) pour préparer une courbe standard de poids moléculaires et des volumes d'élution, comme décrit 13 .
    8. Placer la protéine rBC1531 digérée par la thrombine à partir de l'étape 1.4.6 dans un tube de filtre centrifuge (poids moléculaire coupé: 3 kDa) et centrifuger à 3.000 g à 4 ° C pour réduire à un volume inférieur à 5 mL.
    9. Appliquer la protéine rBC1531 concentrée sur la colonne SEC et collecter 60 fractions éluées dans 0,5 mL par tube 13 .
    10. Prenez 15 μL de chaque fraction, exécutez-les sur une SDS-PAGE de 15% et staiDans le gel en utilisant une solution de coloration Coomassie (0,15% (p / v) de bleu brillant Coomassie, 40% (v / v) de méthanol et 10% (v / v) d'acide acétique glacial) comme décrit 10 .
    11. Pipettez les fractions contenant rBC1531 et collectez-les dans un tube.

2. Criblage et optimisation de la cristallisation de rBC1531

  1. Conditions de criblage pour la cristallisation de la protéine rBC1531
    1. Concentrez le rBC1531 de l'étape 1.4.11 jusqu'à ~ 18.5 mg / mL en utilisant un tube de filtre centrifuge, comme décrit à l'étape 1.4.8.
    2. Ajouter 50 μL de chaque solution de tamisage de cristallisation (voir section 2.2) 14 dans les puits de plaques de cristallisation à jet de 96 puits. Placez 0,5 μL de la solution de protéine RBC1531 de 18,5 mg / mL sur un lit de repos. Mélanger la solution de protéines avec 0,5 μL de solution de puits, répétant le processus pour la totalité de la plaque.
    3. Couvrir la plaque avec un film adhésif transparent.Placez les plaques à 96 puits à 18 ° C et autorisez la diffusion de la vapeur.
    4. Numérisez les gouttes à un grossissement de 20 à 40 X à l'aide d'un microscope optique pour surveiller la formation de cristaux quotidiennement pendant 2 à 3 semaines.
    5. Recueillir des données de diffraction des rayons X 12 en utilisant les cristaux de protéines rBC1531 obtenus.
  2. Optimisation des conditions de cristallisation rBC1531
    1. Préparer 500 μL de la solution d'état de cristallisation initiale sélectionnée ( p. Ex. Cacodylate de sodium 0,1 M, pH 6,5 et citrate de sodium 1,0 M) et remplir une plaque de cristallisation à 24 puits pour la goutte assise.
    2. Ajouter 0,5 μL de la solution de protéine RBC1531 de 18,5 mg / mL à un lit de repos, mélanger avec 0,5 μL de solution de puits et recouvrir immédiatement la plaque avec un film adhésif transparent. Placez la plaque à 18 ° C.
    3. Observez la croissance des cristaux sous un microscope optique pendant une semaine.
    4. Optimiser diverses conditions de cristallisation en faisant varier le pH ( c.-à-d.. PH 5,5-6,8) de cacodylate 0,1 M et en modifiant la concentration en sel ( c.-à-d. 0,9-1,2 M) de citrate de sodium pour obtenir des cristaux singuliers. Surveiller la croissance des cristaux pendant ~ 1 semaine et collecter les données de diffraction des rayons X 12 .

3. Caractérisation de l'activité Nucleoside Triphosphatase (NTPase) de rBC1531

  1. Validation de l'étude colorimétrique inorganique à base de phosphate
    1. Préparer un stock de pyrophosphate (100 mM) et le diluer à des concentrations finales de 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 et 250 uM dans 200 μL de tampon de réaction (HEPES 20 mM, pH 7,4; 150 MM de NaCl et 2 mM de MgCl 2 ) en double des plaques à 96 puits. Utilisez la première plaque comme témoin (cela ne contient pas de pyrophosphatase). Assurez-vous que la deuxième plaque contient de la pyrophosphatase comme plaque de travail, comme indiqué à l'étape 3.1.2.
    2. Ajouter 0,01 unité de saccharomyces cerevisiae p inorganiqueYrophosphatase (1 μL) aux puits de la plaque de travail et incuber à 20 ° C pendant 30-60 minutes.
    3. Préparer la solution d'acide molybdate en mélangeant des solutions de molybdate d'ammonium (0,86% v / v) et d'acide ascorbique (14% v / v) dans un rapport de 7: 3. Ajouter 16 μL de solution d'acide molybdate aux puits de travail et de contrôle et attendre 15 minutes.
    4. Lisez la densité optique à 690 nm (OD 690nm ).
  2. Étude de la NTPase colorimétrique
    1. Préparer un stock de substrat de nucléoside triphosphate (NTP) 100 mM et diluer jusqu'à la concentration souhaitée ( par exemple 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 ou 132 uM) dans 180 μl de tampon de dosage (HEPES 20 mM, PH 7,4, NaCl 150 mM et MgCl 2 2 mM).
    2. Ajouter 20 μg de substrats rBC1531 (1,5 mM) et NTP de l'étape 3.2.1 jusqu'à 200 μL par réaction dans une plaque à 96 puits et des pipettes haut et bas pour bien mélanger. Couvrez la plaque avec son couvercle et placez-la dans un incubateur de 37 ° C pendant 30 min.Pour effectuer la réaction d'hydrolyse du substrat.
    3. Transférer la plaque dans un bain-marie à 70 ° C et laisser reposer pendant 15 minutes pour arrêter les réactions catalytiques médiées par le rBC1531.
    4. Ajouter 0,01 unité de pyrophosphatase inorganique de S. cerevisiae (1 μL) à chaque puits de la plaque de réaction (à partir de l'étape 3.2.3) et incuber à 20 ° C pendant 30 minutes. Ajouter 16 μL de solution d'acide molybdate à la plaque de réaction pour développer la couleur (~ 15 min). Lire à OD 690nm .
    5. Analyser l'utilisation de l'équation de Michaelis-Menten, comme décrit 12 .

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Résultats

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La caractérisation de la protéine d'intérêt dans cette étude a commencé par la préparation d'une quantité suffisante de protéine recombinante B. cereus bc1531 (rBC1531), de préférence plus de plusieurs milligrammes. Le fragment d'ADN codant pour la protéine BC1531 a été préparé par PCR en utilisant l'ADN génomique de B. cereus comme modèle, car il contient des gènes orthologues identiques à ba1554 . Le rBC1531 a été surexprimé sous la forme d'une protéine solub...

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Discussion

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Les études sur les vrais agents pathogènes sont limitées en raison des restrictions de sécurité et des réglementations. Alternativement, les agents pathogènes peuvent être étudiés à l’aide de non-agents pathogènes ou d’espèces moins pathogènes liés à l’évolution. Le gène ba1554 est considéré comme un gène critique chez B. anthracis. Heureusement, un gène identique est présent chez B. cereus non clinique.Ainsi, sans problèmes d’innocuité graves, la protéine recombinante BC1531 peut être utilisé...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Les jeux de données de diffraction des rayons X ont été collectés à la ligne de faisceau 7A du Pohang Accelerator Laboratory (Corée). Cette étude a été soutenue par le programme de recherche scientifique de base administré par la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF), financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future (2015R1A1A01057574 à MH).

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Matériaux

Sal

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bacillus cereus ATCC14579Collection coréenne pour la culture tissulaire3624
Kit de préparation de l’ADN génomiqueGeneAll106-101Préparation de l’ADN génomique
Amorce avantMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAA
CGATGAAAGATATGCA		BamHI site est souligné
Amorce inverseMacrogenLesite <><
: nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polymerase
BamHIEnzynomicsR003SemSal
/emIEnzynomicsR009S
pET49b expressionvector Novagen71463Le vecteur d’expression a été modifié pour ajouter des marqueurs d’affinité et des sites BamHI/SalI 10
T4 ADN ligaseEnzynomicsM001S
Dialyse memebraneThermofisher18265017
Chauffe-bloc secJSRJSBL-02T
LB bouillon (Luria-Bertani)Solution LPSLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
KanamycinLPSsolution KAN025
Mini-prep KitFavorgenFAPDE300Préparation de l’ADN plasmidique
BL21(DE3) Cellule compétenteNovagen69450-3CN
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Fisher BioReagents50-213-378
Chlorure de sodiumDaejung7548-4100Matériau PBS
Chlorure de potassiumDaejung6566-4405Matériau PBS Phosphate de
potassiumBio Basic IncPB0445Matériau PBS
Phosphate de sodiumBio Basic IncS0404Matériau PBS
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicateurSonicsVCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210Perle de nickel
RotatorFinepcrAG
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-rad1610374SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Solution de coloration Coomassie
Alcool méthyliqueSamchun chimiqueM0585Solution de coloration Coomassie
Acide acétiqueDaejung1002-4105Solution de coloration Coomassie
Dialyse memebraneThermofisher68035
2-MercaptoethanolSigma-aldrichM6250
ThrombinMerckmillipore605157-1KUCNPréparer des aliquotes de 20 &mu ; L (1 unité par &mu ; L) et se conserver à 70 ° ; C et décongeler avant utilisation
Superdex 200 16/600General Electric28989335Chromatographie d’exclusion stérique
Norme de filtration sur gelBio-rad151-1901
Filtre centrifugeAmiconUFC800396
Plaques de cristallisationHampton researchHR3-083Plaque de descente à 96 puits
La suite de centrage JCSG I-IVQiagen130924-130927Solution de sécreening de cristallisation
MicroscopeNikonSMZ745T
Plaques CryschemHampton researchHR3-158Plaque de chute assise à 24 puits
Pyrophosphatase inorganiqueSigma10108987001
Solution de molybdate d’ammoniumSigma13106-76-8
Acide L-ascorbiqueSigma50-81-7
Substrat NTPStartagene200415-51
SpectrophotomètreBiotekSynergyH1lecteur de microplaques
GraphPad Prism 5GraphPadPrism 5 pour fenêtre
> R003S>I Enzynomics R009S pET49b Envynomics P410 PCR PolymeraseemBam/emHI Enzynomics

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Protein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

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