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Article de méthode

L'utilisation d'un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

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DOI :

10.3791/55586

⸱

8 avril 2017

 ,  ,  , 
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

Dans cet article

Résumé

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

Résumé

Le développement d'outils d'édition programmables génome a facilité l'utilisation de la génétique inverse pour comprendre les rôles des séquences génomiques spécifiques jouent dans le fonctionnement des cellules et des organismes entiers. Cette cause a été aidé énormément par l'introduction récente du système un CRISPR / cas9 outil polyvalent qui permet aux chercheurs de manipuler le génome et du transcriptome afin, entre autres, assomment, abattre ou frapper dans les gènes dans une cible manière. Dans le but de frapper sur un gène, CRISPR / cas9 médiée cassures double brin recrutent la voie de réparation de l'ADN d'assemblage terminal non homologue pour introduire l'insertion du cadre de lecture à l'origine ou la suppression de nucleotides au niveau du site de coupure. Cependant, un ARN de guidage individuel peut entraîner des effets indésirables hors cible, et pour écarter ces derniers dehors, l'utilisation des ARN guides multiples est nécessaire. Cette multiplicité des cibles signifie également qu'un criblage à haut volume de clones est nécessaire, ce qui soulève l'utilisation d'un efFicient technique à haut débit pour le génotype des clones knock-out. techniques de génotypage actuelles soit souffrent de limitations inhérentes ou entraînent des coûts élevés, les rendant donc impropre à des fins à haut débit. Ici, nous détaillons le protocole pour l'utilisation de la PCR fluorescente qui utilise l'ADN génomique à partir d'un lysat cellulaire brut sous forme d'un gabarit, puis la résolution des fragments de PCR par électrophorèse sur gel capillaire. Cette technique est suffisamment précis pour différencier une différence de paire de bases entre les fragments et est donc suffisante pour indiquer la présence ou l'absence d'un cadre de lecture dans la séquence codante du gène ciblé. Cette connaissance précise empêche effectivement la nécessité d'une étape de séquençage de confirmation et permet aux utilisateurs de gagner du temps et des coûts dans le processus. De plus, cette technique est avérée être polyvalent dans génotypage diverses cellules de mammifères de diverses origines de tissus ciblés par les ARN de guidage contre de nombreux gènes, comme le montre ici et ailleurs.

Introduction

approches de génétique inverse ont permis aux scientifiques d'élucider les effets des altérations spécifiques dans le génome de la cellule ou organisme entier. Par exemple, l'expression d'un gène particulier peut être atténué par le gène knock - down 1, 2 (réduction partielle) ou knock - out de gène 3, 4 (ablation complète) afin de déterminer l'effet que cela a sur la fonction de la cellule ou sur la développement de l'organisme.

expériences de knock-out de gène sont devenues plus faciles depuis l'introduction des nucleases spécifiques de séquences programmables, tels que des nucléases doigt de zinc (ZFN) et la transcription des nucléases effectrices de type activateur (TALENS). Cependant, la caractérisation relativement récente du CLUSTERED régulièrement entrecoupés de courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a rendu extrêmement facile pour tout laboratoire dans le monde entier pour effectuer genexpériences e knock-out. En substance, le CRISPR / système cas9 se compose de deux composants essentiels d'un ARN de guidage unique (ARN sg), qui reconnaît et se lie par l'intermédiaire d'une complémentarité de base à une séquence spécifique dans le génome, et une endonucléase appelé cas9. Le lendemain de la liaison spécifique et de l'action du complexe ARN sg-cas9 sur l'ADN génomique est le clivage double brin de l'ADN. Ceci, à son tour, déclenche le mécanisme de réponse aux dommages de l'ADN dans la cellule, qui est ensuite réparé par l'intermédiaire des voies d'extrémité d'assemblage non homologues (NHEJ) ou la recombinaison homologue (RH). Le mécanisme de réparation NHEJ (mais pas le mécanisme des ressources humaines) se traduit souvent par l'insertion aléatoire ou la suppression des nucléotides sur le site de réparation, ce qui entraîne des mutations d'insertion / délétion (indels), il peut provoquer le cadre de lecture d'un exon à passer. Cela peut alors entraîner le knock - out du gène en raison de la fin prématurée de la traduction et la carie médiation non - sens 5, 6,7.

En dépit de la mise en pratique offerte par l'introduction du CRISPR / système cas9 en assommant un gène, le génotypage des clones de cellules cibles reste un goulot d' étranglement, en particulier dans un haut débit 8, 9. Les techniques existantes, soit souffrent de graves limitations inhérentes ou sont financièrement coûteuses. Par exemple, le géomètre ou un dosage T7E1, qui est un essai enzymatique qui détecte des mésappariements de l'ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de distinguer entre les clones de type sauvage et des mutants homozygotes (clones dont les allèles sont mutés de manière identique), étant donné que ces clones ont des alleles identiques et donc ne présentent pas de mésappariements dans leur séquence d'ADN 11. De plus, l'utilisation du séquençage Sanger, qui est considéré comme l'étalon-or dans le génotypage des clones mutants, dans une configuration à haut débit est indésirable en raison de son coût élevé. Nous présentons ici un detailed protocole de la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, qui peut contourner les limitations des autres techniques de génotypage existantes et est particulièrement utile pour effectuer un criblage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Cette méthode est techniquement simple à réaliser et de gagner du temps et de coût.

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Protocole

1. Obtenir CRISPR / cas9 ciblées Clones unicellulaires

  1. Graine de cellules HEPG2 sur une plaque à 6 puits à raison de 500.000 cellules par puits dans 2 ml d'antibiotique de Dulbecco sans Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. transfecter des cellules avec un plasmide co-exprimant cas9 et ARN sg spécifique contre le gène d'intérêt en utilisant un réactif de transfection approprié selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE: Par exemple, ARNsg peut être cloné dans le vecteur GFP--2A pSpCas9 (BB), comme décrit précédemment 4.
  3. Remplacer le milieu de culture de 4 à 16 h après la transfection avec 2 ml de milieu sans antibiotique frais.
  4. Environ 48 heures après la transfection, recueillir suspension unicellulaire par trypsinisation les cellules.
    1. Trypsiniser les cellules dans 0,2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 1 ml de milieu et remettre en suspension thoroughly.
  5. Trier les cellules pour les clones GFP-positives, comme décrit précédemment 12, et de recueillir environ 3500 cellules.
  6. Plaque les cellules GFP-positives triées sur des boîtes de 10 cm à 500, 1000 et 2000 cellules par boîte dans 8 ml de pénicilline / streptomycine milieu de culture supplémenté. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
  7. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en remplaçant le milieu tous les cinq jours, jusqu'à ce qu'elles se développent en colonies unicellulaires assez grandes pour être visibles à l'oeil nu. Pour la plupart des lignées de cellules cancéreuses, cela prend environ deux semaines à partir du jour de placage.
  8. Lorsque les colonies sont de la taille appropriée ( par exemple, visible à l'oeil nu), le transfert des colonies individuelles à des puits d'une plaque de culture à 96 puits contenant 200 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
    1. Aspirer les colonies unicellulaires à l'aide d'une pipette de 200 pi avec un petit volume de milieu. Remettre les cellules à fond dans dedividuelle puits en triturant plusieurs fois.
  9. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en remplaçant le milieu tous les cinq jours, jusqu'à ce qu'ils atteignent 50-90% de confluence. Pour la plupart des lignées de cellules cancéreuses, cela prend environ 24 - 48 h.

2. ADN génomique brut Extracting L'utilisation d'un Lyse directe Méthode

  1. Lorsque les cellules atteignent 50-90% de confluence, enlever autant du milieu de culture des puits que possible en utilisant une aspiration sous vide multi-canal ou une pipette à canaux multiples.
  2. Ajouter 25 pi de 0,05% de trypsine-EDTA (sans rouge de phénol) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min.
  3. Remettre les cellules trypsinisées à fond par pipetant plusieurs fois. Vérifiez les cellules sous un microscope pour assurer qu'ils sont détachés de la surface en plastique.
  4. Créer une réplique des clones individuels en transférant environ 5 ul de la suspension à cellule unique à un 96 puits de culture plat videe. Ajouter 200 ul de milieu de culture à chaque puits et maintenir les cellules jusqu'à ce que les clones positifs sont identifiés en utilisant une électrophorèse sur gel de PCR-capillaire fluorescente (voir ci-dessous). Développer les cellules en série à des boîtes de 10 cm ou toute autre échelle de choix (voir la section 7).
  5. Ajouter 5 ul de la suspension de cellules isolées à partir de l' étape 2.3 à 10 pl de tampon maison-lyse directe (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 2,5 mM, NaCl 0,2 M, 0,15% de SDS et 0,3% de Tween-20) 12 dans un plaque PCR 96 puits et mélanger en pipetant plusieurs fois. Centrifuger brièvement (pour amener le liquide vers le fond du puits).
  6. Ajouter 200 ul de milieu de culture pour le reste de ~ 15 pi de suspension cellulaire de l' étape 2.3 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2, ainsi que la répétition de l' étape 2.4.
  7. Soumettre les lysats de l'étape 2.5 pour le programme de cycles thermiques suivant pour assurer une lyse complète des cellules et la libération de l'ADN génomique: 65 ° C pendant 30 s, 8 ° C pendant 30 s, 65 ° C pendant 1,5 min, 97 ° C pendant 3 minutes, 8 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 3 min, 97 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 1 min, et 80 ° C pendant 10 min. Centrifuger brièvement les lysats.
  8. Diluer les lysats en ajoutant 40 ul d'eau sans nucléase et mélanger soigneusement à l'aide d'un mélangeur à vortex. centrifuger brièvement. Les lysats dilués peuvent être utilisés immédiatement ou conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois sans perte significative de qualité.

3. Exécution PCR fluorescente à Amplifier CRISPR / cas9 Régions cibles

  1. Concevoir deux amorces marqué par un fluorophore vers l'avant (à la fois marqué à l'extrémité 5' ) pour chaque CRISPR / cas9 région cible; les sites de coupe qui sont plus de 300 pb de l'autre doivent être considérés comme deux régions cibles séparées (par exemple, vert amorce marqué par un fluorophore pour le contrôle de type sauvage non ciblé et bleu amorce marqué par un fluorophore pour CRISPR / clones cas9 ciblés; voir le Tableau of Materia ls).
    1. Se procurer ces amorces marquées vers l'avant et une amorce inverse non marqué en conséquence. Notez que les amorces peuvent être conçues en utilisant un outil de choix et que les amplicons doivent être 200 - 500 pb à long.
  2. Effectuer la PCR comme décrit précédemment 12 pour amplifier les régions cibles en utilisant les amorces marquées.
    1. Utiliser 3 pl de lysats dilués de l' étape 2.8 dans une réaction de 20 uL (voir le tableau 1) et le programme de cycle thermique suivant: 94 ° C pendant 10 min (1 cycle); 94 ° C pendant 10 s, 64 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 58 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s, et 68 ° C pendant 1 min (35 cycles).
  3. Résoudre 5 uL des amplicons de PCR sur un gel d'agarose à 1% pour vérifier la taille et la quantité relative d'ampliconsss = "xref"> 12.
    REMARQUE: L'exécution de cette étape pour tous les échantillons est encouragée, mais pas nécessaire; la résolution d'un certain nombre d'échantillons suffisant pour estimer la quantité d'amplicons présents dans les échantillons en général.

4. Des échantillons Préparation pour Capillaire Gel Electrophoresis

  1. Diluer amplicons de type sauvage (cellules parentales non ciblées) et CRISPR / ADN cas9 ciblée dans l'eau exempte de nuclease à environ 2,5 ng / ul. Assurez-vous de diluer l'échantillon suffisamment d'ADN de type sauvage à ajouter à chaque échantillon d'ADN cible (un minimum de 0,5 ul d'échantillon dilué de type sauvage par échantillon ciblé est nécessaire).
  2. Mélanger le type sauvage et dilué des échantillons d'ADN cibles en proportion égale (par exemple, mélanger 1 pi d'échantillon de type sauvage avec 1 ul de l' échantillon cible).
  3. Ajouter 1 pi de amplicons mixtes à 8,7 ul de formamide désionisée et 0,3 ul de taille standard marqué par un colorant dans une plaque à 96 puits PCR qui est compatible avec l'un génétiquealyzer.
    NOTE: L'utilisation d'un mélange maître du formamide et la taille standard ( par exemple, une préparation d'un pré - mélange de formamide et la taille standard dans un 29 ratio 1 avant l'addition d'amplicons pour assurer des quantités normalisées) est recommandée.
  4. sceller hermétiquement la plaque et on chauffe les échantillons à 95 ° C pendant 3 min en utilisant un thermocycleur PCR.
  5. Placer la plaque sur de la glace immédiatement après l'étape de chauffage et laisser incuber pendant au moins 3 min.

5. Exécution Capillaire Gel Electrophoresis sur un analyseur génétique

  1. Mettre en place des paramètres de dosage, le protocole de l'instrument, et le protocole de taille appelant le logiciel d'électrophorèse sur gel capillaire relié à un analyseur génétique.
    REMARQUE: Cette étape est nécessaire que pour le premier essai d'électrophorèse; le programme peut être enregistré pour une utilisation ultérieure. Pour les courses suivantes, passez directement à l'étape 5.2.
    1. Cliquez sur l'icône « Créer une nouvelle plaque » sur le tableau de bord du logiciel.
    2. Donnez la run nom fictif et sélectionnez les options suivantes: Nombre de puits, 96; Type de plaque, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; et polymère, POP7. Cliquez sur le bouton « Assign du contenu de la plaque ».
    3. Sous « Assays », cliquez sur « Créer un nouveau test »; un nouveau panneau apparaît.
    4. Nommez le test « FPCR-EGC dosage » et vérifier que « le type d'application » est correctement défini comme « Fragment ».
    5. Mettre en place le protocole d'instrument en cliquant sur le bouton « Créer un nouveau » sous « Protocole instrument. »
      1. Définir ou choisir les options et paramètres suivants dans les domaines appropriés: Type d'application, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; Polymère, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Nom du protocole, FPCR-EGC Protocole instrument; Four Température, 60 ° C; Run tension, 19,5 kV; Tension avant terme, 15 kV; Tension d'injection, de 1,6 kV; Durée, 1,330 s; Temps de pré-course, 180 s; Temps d'injection, 15 s; et retard de données, 1 s.
    6. Click sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
    7. Mettre en place un protocole appelant la taille en cliquant sur le bouton « Créer un nouveau » sous « Protocole Sizecalling. »
      1. Définir ou choisir les options et paramètres suivants dans les domaines appropriés: Nom Protocole, FPCR-EGC Protocole Sizecalling; Taille standard, GS500 (-250) LIZ; Taille-appelant, SizeCaller v1.1.0; Paramètres d'analyse, -; Analyse gamme, complète; Gamme de dimensionnement, pleine; Taille d'appel Méthode, Sud locale; Primaire de pointe, le présent; Bleu, Vert, chaînes d'Orange, (Check); Hauteur de pointe minimum, 175 pour tous les canaux; Utilisez Lissage, Aucun; Utilisez Baselining (Fenêtre de référence (Pts)), (Check) 51; Pic demi-largeur minimum, 2; Taille de la fenêtre de pointe, 15; Polynôme degré, 3; Seuil de pente crête de départ, 0,0; Seuil de pente de pointe End, 0,0; Réglages QC, -; Qualité de taille, -; Échouer si la valeur est <0,25; Passe si la valeur est <0,75; Supposons Linéarité de 0 à 80 pb0 pb; et entraînement Pull-Up drapeau si Pull-Up Ratio ≤ 0,1 et Pull-Up balayage ≤ 1.
    8. Cliquez sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
    9. Assurez-vous que le test est enregistré en cliquant sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » une fois et quitter le panneau en cliquant sur le bouton « Fermer ».
    10. Retour à la « Plate affectation du contenu », cliquez sur « Créer une nouvelle convention Nom de fichier » lien « Conventions Nom du fichier. »
    11. Nom du programme « FPCR-EGC Nom de fichier. »
    12. Sous la rubrique « Attributs disponibles », sélectionnez les attributs désirés qui apparaissent dans le nom de fichier (par exemple « Date de Run », « Temps d'exécution », « bien Position » et « Nom de l'échantillon »). Choisissez l'emplacement du fichier désiré où les résultats de l'exécution seront stockés.
    13. Cliquez sur le bouton « Appliquer à dosage », puisle bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
    14. Retour à la « affectation du contenu des plaques », cliquez sur le lien « Créer un nouveau groupe Résultats » sous la rubrique « Groupes de résultats. »
    15. Nom du programme « FPCR-EGC Résultats Groupes. »
    16. Sous la rubrique « Attributs disponibles », sélectionnez les attributs désirés qui apparaissent dans le nom de fichier (par exemple « Nom du test »). Choisissez l'emplacement du fichier désiré où les résultats de l'exécution seront stockés.
    17. Cliquez sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
  2. Mettre en place le programme pour une électrophorèse exécuter en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Accédez au tableau de bord et cliquez sur l'icône « Créer une nouvelle plaque ».
    2. Nom de la course comme on le souhaite (pour faciliter, la date, la lignée cellulaire et le nom du gène). Sélectionnez les options suivantes: Nombre de puits, 96; Type de plaque, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; et polymère, POP7. Cliquez sur le bouton « Assign du contenu de la plaque ».
    3. Attribuer chaque puits de l'échantillon désiré (par exemple, un échantillon peut être nommé « NC » pour indiquer que le puits est un témoin négatif).
    4. Sous les « Assays, » « Conventions Nom du fichier » et « Groupes » Résultats boîtes, cliquez sur le bouton « Ajouter de la bibliothèque » lien et sélectionnez les programmes créés à l'étape 5.1.3 à 5.1.17.
    5. Mettez en surbrillance tous les puits à analyser et sélectionner les programmes pertinents sous la rubrique « Assays » « Conventions de nom de fichier » et « Groupes » Résultats en cochant les cases à côté d'eux.
  3. Avant de charger la plaque sur le plateau du dispositif d'analyse génétique, appliquer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la plaque à 96 puits et mettre la plaque étanche dans le boîtier en plastique qui est fourni avec l'analyseur génétique.
  4. Appuyez sur le bouton « plateau » à l'avant de l'analyseur génétique, et lorsque le plateau remaux de l'avant de l'équipement, ouvrir la porte et charger la plaque enveloppée sur le plateau. Assurez-vous que la plaque est verrouillée en place puis fermez la porte.
  5. Cliquez sur le bouton « éclisse Run ».
  6. Dans la page « Plaques de charge pour Run », faire une dernière vérification pour faire en sorte que tous les réactifs et les conditions sont correctes et dans l'ordre.
  7. Cliquez sur le bouton « Démarrer Exécuter ». Chaque série de 24 échantillons (les premiers puits 3x8 de la plaque à 96 puits) en moins de 55 min pour terminer.

6. Analyse de la Electrophérogramme pour déterminer les différences de paires de bases

  1. Lorsque la course d'électrophorèse capillaire sur gel est terminé, ouvrez le logiciel d'analyse pour analyser les résultats.
  2. Cliquez sur « Ajouter des échantillons au projet » icône et rechercher le dossier contenant les fichiers d'exécution. Rappelons de l'étape 5.1.12 l'emplacement attribué des fichiers de résultats.
  3. Sélectionner tous les fichiers de résultats de chaque injection dans la course et cl terminéick sur le bouton « Ajouter à la liste »; les noms de ces fichiers commencent par « Inj » et contiennent les détails de la course.
  4. Cliquez sur le bouton « Ajouter et analyser » pour procéder à l'analyse.
  5. Sélectionnez tous les échantillons dans la course en cliquant sur le premier échantillon et en faisant glisser le curseur vers le bas pour le dernier échantillon, puis cliquez sur l'icône « Afficher Tracés ».
  6. Pour vérifier la qualité de la taille standard, ouvrez le canal orange des résultats en vérifiant l'icône orange et décochant le reste des icônes colorées; ce qui est important de veiller à ce que la taille appel est précise et fiable.
  7. Pour voir les pics correspondant aux fragments dérivés du contrôle et les clones untargeted ciblés, vérifiez les icônes bleu et vert pour ouvrir des lectures de ces canaux.
  8. Placez le curseur sur l'axe horizontal du premier résultat intrigue et faites un clic droit pour sélectionner « Full View ». Faites défiler vers le bas pour afficher tous les résultats en un coup d'oeil pour déterminers'il y a un problème majeur avec la course. Pour zoomer sur une plage de valeurs spécifique, faites un clic droit de la souris sur l'axe concerné de la parcelle, choisissez « Zoom Pour ..., » et la clé dans la gamme des valeurs d'intérêt.
    NOTE: Un problème majeur potentiel est que tous les échantillons donnent des pics de faible intensité. Ceci est généralement dû au stockage prolongé des amplicons marqué par un fluorophore avant l'exécution de l'électrophorèse capillaire ou la sur-dilution d'amplicons, qui peut être facilement rectifié en répétant l'étape de PCR, ou en diluant les amplicons en utilisant un facteur de dilution inférieur, respectivement.
  9. Pour enregistrer les résultats, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Assurez-vous que les canaux bleu et vert sont sélectionnés et cliquez sur l'icône « Tableau des tailles ».
    2. Enregistrez le tableau des valeurs en format texte délimité par des tabulations (.txt) en ouvrant « Fichier » et choisissez « Exporter la table. » Nommez le fichier en conséquence et sélectionnez l'emplacement du fichier de choix.
    3. Pour enregistrer l'intrigues de la course au format PDF, allez à l'option « Fichier » et cliquez sur « Imprimer ». Choisissez l'auteur PDF correspondant et appuyez sur « Imprimer ». Nommez le fichier en conséquence et sélectionnez l'emplacement du fichier de choix.
  10. Pour calculer la différence de la taille des fragments dérivés de contrôle de type sauvage non ciblé et les clones CRISPR / cas9 ciblées, suivre les étapes décrites ci-dessous.
    1. Ouvrez l'onglet fichier texte délimité (.txt) de l'étape 6.9.2 avec un programme tableur. Le tableau doit inclure ces quatre colonnes importantes: « Colorant / Sample Peak » (indiquant un canal bleu ou vert), « Nom du fichier d'échantillon » (les premiers caractères indiquent le bien ou le nom échantillon), « Taille » (en indiquant la taille de la fragment appelé), et « hauteur » (indiquant l'intensité de fluorescence du pic).
    2. Pour isoler les pics pertinents, exclure ceux qui ne sont pas dans la gamme de taille attendue.
      NOTE: En règle générale, les mutations de indel aboutissent rarement à plusà une différence de 100 pb; Ainsi, des pics dont la taille diffère de plus de 100 pb à partir du pic de commande de type sauvage (pic dominant dans le canal vert) sont exclus. Ceci peut être facilement fait en utilisant la fonction « entre » option sous la « Mise en forme conditionnelle » dans la feuille de calcul.
    3. Pour supprimer des pics non spécifiques, qui sont impossibles à distinguer du niveau d'arrière-plan, utilisez le « Moins » option dans la fonction « Mise en forme conditionnelle » dans le programme tableur pour exclure les pics dont les hauteurs sont inférieures à 2.000 unités. Cette valeur limite a été déterminée de manière empirique et peut donc être ajusté lorsque cela est jugé nécessaire.
    4. Calculer par soustraction de celui-ci de la première à la différence de taille des fragments entre chacun des pics obtenus dans le canal bleu (CRISPR / clones cas9 ciblés) et la semelle de pointe dans le canal vert (témoin de type sauvage non ciblé).
      NOTE: Il est important d'utiliser les valeurs attribuées à chaque electrophor capillaireesis échantillon, comme il peut y avoir des différences inter-échantillon de la taille des fragments de contrôle de type sauvage.
    5. Arrondir les valeurs à l'entier le plus proche pour déterminer le nombre de paires de bases qui ont été insérées dans ou supprimés à partir de, le cas échéant, la séquence génomique en question. Lorsque assommant un gène d'intérêt est, sélectionner des clones dont les mutations indel ne sont pas des multiples de 3 pb pour assurer qu'il ya dans la séquence du cadre de lecture de codage.

7. La vérification de l'état de Knockout de clones

  1. Développer les clones knock-out individuels de la plaque à 96 puits (à partir des étapes 2.4 et 2.6) sur une plaque à 24 puits par trypsinisation des cellules en utilisant 25 pi de 0,25% de trypsine-EDTA et incubation à 37 ° C pendant 5 min.
  2. Ajouter 125 pi de milieu (DMEM additionné de 10% de FBS) aux cellules trypsinisées et remettre en suspension à fond.
  3. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et on centrifuge à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Enlever autant du milieu que possible en utilisant une aspiration sous vide ou d'une pipette, remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu, et transférer la suspension cellulaire à un puits d'une plaque à 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent 80-90% de confluence.
  5. Développer les clones individuels en série à partir de la plaque de 24 puits à une plaque à 6 puits et de la plaque à 6 puits dans un plat quand ils atteignent 80 à 10 cm - 90% de confluence en répétant les étapes 7.1 à 7.4, en utilisant les volumes suivants: 50 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et 150 ul de milieu (pour l'expansion de la plaque de 24 puits à la plaque de 6 puits) et 200 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et 1 ml de milieu (pour l'expansion de la 6- puits d'une plaque à la boîte de 10 cm).
  6. Récolter les clones quand ils atteignent 80 - 90% de confluence par trypsinisation des cellules en utilisant 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
  7. Ajouter 5 ml de milieu (DMEM additionné de 10% de FBS) dans les cellules trypsinisées et resuspend fond.
  8. Transférer la suspension cellulaire également dans deux tubes de 15 ml, centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et enlever le moyen le plus possible. Une partie des cellules est pour l'extraction de l'ADN génomique et l'autre pour l'extraction de la protéine totale.
  9. Pour la vérification par séquençage Sanger, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Extrait l' ADN génomique des clones comme décrit précédemment 12.
    2. Effectuer une amplification par PCR de la région couvrant le site cible CRISPR / cas9, tel que décrit dans la section 3.2, mais en utilisant des amorces non marquées. Ne pas utiliser des amorces marquées pour cette étape, comme la fluorescence de la balise va interférer avec l'étape de séquençage Sanger ultérieure.
    3. Purifier les amplicons en utilisant un kit de nettoyage de PCR, comme décrit précédemment 12.
    4. Séquencer les amplicons purifiés en utilisant les amorces de PCR utilisées dans l'étape 7.9.2 pour déterminer le génotype des clones, comme décrit previously 12.
  10. Pour la vérification par analyse par transfert de Western, extrait de protéines totales à partir des cellules de type sauvage et des clones ciblés, comme décrit précédemment 12.
    1. Effectuer une analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps appropriés dirigés contre la protéine du gène cible, comme décrit précédemment 12; un véritable clone de knock-out est dépourvu de l'expression de la protéine.

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Résultats

La technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent décrit ici est prévu pour être applicable à une région pouvant être ciblé dans le génome de pratiquement toutes les lignées cellulaires qui se prête à la livraison d'ADN étranger. Nous avons déjà démontré son application en ciblant trois gènes dans une lignée cellulaire de cancer colorectal 12. Ici, nous montrons son efficacité dans génotypage d'une lignée de cellules de carcinome hépatoc...

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Discussion

Le assommant d'un gène spécifique dans une lignée cellulaire modèle de choix est devenu habituel pour élucider le rôle que le gène joue dans ce contexte cellulaire particulier. En fait, plusieurs écrans à l' échelle du génome sont actuellement disponibles qui utilisent le système de CRISPR / cas9 pour cibler des gènes humains pratiquement tous connus dans le génome 14, 15, 16. Avec ces écrans à grande échelle (ou même à...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Mme Tan Shi Min, Mme Helen Ong, et le Dr Zhao Yi pour aider avec les expériences d'électrophorèse sur gel capillaire. Ce travail a été soutenu par NMRC / IRG accorder NMRC / 1314/2011 et MOE ACRF Niveau 2 subvention du Fonds MOE2011-T2-1-051.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules HEPG2ATCCHB-8065
HyClone Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)Thermo Fisher ScientificSH30022.01
HyClone Sérum fœtal bovinThermo Fisher ScientificSV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP PlasmideAddgenePX458
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolThermo Fisher Scientific25200056
Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénolThermo Fisher Scientific15400054
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
HyClone Water, Biologie moléculaire GradeGE HealthcareSH30538,02
Oligonucléotide d’insertion d’ARNsg CRISPR (sens)AITbiotechAucunSéquence : 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'Oligonucléotide
d’insertion d’ARNsg CRISPR (anti-sens)AITbiotechAucunSéquence : 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Amorce directe d’amplification
PCR non marquéeAITbiotechAucunSéquence : 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' ; cette amorce est également utilisée pour séquencer les allèles amplifiés par PCR
6-FAM Amorce directe PCR fluorescente marquéeAITbiotechAucunSéquence : 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX-labellisée
PCR fluorescente amorce directeAITbiotechAucunSéquence : 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Amorce
inverse PCR non étiquetéeAITbiotechAucunSéquence : 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq
PCR Core KitQIAGEN201223
Hi-Di FormamideThermo Fisher Scientific4311320
GeneScan 500 LIZ Taille de colorant StandardThermo Fisher Scientific4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific4306737
3500xL Genetic AnalyseurThermo Fisher Scientific4405633
3500 Series 2 ProgrammeThermo Fisher Scientific4476988
Gene Mapper 5 ProgrammeThermo Fisher Scientific4475073
Gentra Puregene Cell KitQIAGEN1045696
Wizard SV Gel et PCR Système de nettoyagePromegaA9282
NAP1L1 Anticorps ( N-term)AbgentAP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 anticorps [5E10]GeneTexGTX70220
Peroxydase AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgGJackson ImmunoResearch111-035-144
Peroxydase AffiniPure Mouton Anti-SourisIgG Jackson ImmunoResearch515-035-003
11668027

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Knock out par CRISPR Cas9g notypage haut d bitd tection de mutations indelsconception d amorcesmatrice de lysat cellulaireanalyse de la taille des fragmentss quen age de Sangeranalyse par Western blot
L'utilisation d'un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit
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