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Article de méthode

Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline

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DOI :

10.3791/55589

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29 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Pathology, Leiden University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus University Medical Center, 3Center for Gynecological Oncology Amsterdam, VU Medical Center

Dans cet article

Résumé

L'immunohistochimie à fluorescence multiparamètre peut être utilisée pour évaluer le nombre, la répartition relative et la localisation des populations de cellules immunitaires dans le micro-environnement de la tumeur. Ce manuscrit décrit l'utilisation de cette technique pour analyser les sous-populations de cellules T dans le cancer de l'oropharynx.

Résumé

La technique d'immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs (IHC) est une méthode pour quantifier les populations cellulaires d'intérêt tout en tenant compte de leur répartition relative et de leur localisation dans le tissu. Cette technique a été largement appliquée pour étudier l'infiltration immunitaire dans divers types de tumeurs. Le microenvironnement tumoral est infiltré par des cellules immunitaires attirées par le site de la tumeur. On a constaté que différentes populations de cellules immunitaires jouent différents rôles dans le microenvironnement de la tumeur et ont un impact différent sur le résultat de la maladie. Ce manuscrit décrit l'utilisation de la fluorescence multiparamétrique IHC sur le carcinome épidermoïde oropharyngé (OPSCC) à titre d'exemple. Cette technique peut être étendue à d'autres échantillons de tissus et types d'intérêt cellulaire. Dans l'étude présentée, nous avons analysé le compartiment intra-épithélial et stromal d'une grande cohorte OPSCC (n = 162). Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T complets (CD3 + ), le régulateur immunosuppresseur(Tregs, c'est-à-dire FoxP3 + ) et T helper 17 (Th17) ( c'est -à- dire IL-17 + CD3 + ) en utilisant un contre-cutané nucléaire pour distinguer l'épithélium tumoral du stroma. Un nombre élevé de cellules T s'est révélé être corrélée avec une survie sans maladie améliorée chez les patients avec un faible nombre de lymphocytes non-T IL-17 + intratumoraux. Cela suggère que les lymphocytes non-T IL-17 + peuvent être corrélés avec une mauvaise réponse immunitaire dans l'OPSCC, ce qui correspond à la corrélation décrite entre IL-17 et une survie médiocre chez les patients cancéreux. Actuellement, de nouvelles techniques IHC de fluorescence multiparamètres sont développées en utilisant jusqu'à 7 différents fluorochromes et permettront une caractérisation et une localisation plus précises des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral.

Introduction

Les carcinomes à cellules squameuses opharyngées (OPSCC) sont un groupe hétérogène de cancers des cellules squameuses originaires de l'oropharynx. Les facteurs de risque pour l'OPSCC comprennent l'infection par le papillomavirus humain (VPH) et l'alcool et le tabagisme 1 , 2 . Le rôle de la réponse immunitaire et la façon de l'utiliser dans un contexte clinique commencent à être explorés. Le micro-environnement de la tumeur est infiltré par des cellules immunitaires qui sont attirées par le site du cancer. Bien qu'une fréquence cytotoxique élevée de lymphocytes T CD8 + ait été corrélée avec une survie améliorée chez les patients OPSCC 3 , le rôle d'autres sous-ensembles de cellules T, y compris les cellules Treg et Th17, n'est toujours pas clair 4 . Alors que les cellules Th1 et Th17 sont censées aider à la réponse immunitaire ciblant les cellules tumorales, les Treg sont bien connus pour leurs capacités à supprimer l'activité d'autres lymphocytes T 5 . Cependant, la présence de TOn a constaté que les regs étaient corrélés avec des réponses favorables et défavorables dans différents types de tumeurs 6 . Étant donné que toutes les cellules immunitaires présentes dans le sang infiltrent la tumeur dans la même mesure, l'étude du micro-environnement local de la tumeur fournit la mesure la plus fiable de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. L'objectif de cette étude est de déterminer la corrélation entre les nombres et les types de cellules immunitaires et les résultats cliniques. Nous avons utilisé l'imagerie IHC à fluorescence à quatre couleurs pour analyser le nombre et la localisation de diverses sous-populations de cellules T dans l'OPSCC humain.

Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T totaux (CD3 + ), les cellules Th17 et les Tregs FoxP3 + immunosuppressifs, dont la voie de différenciation est étroitement liée aux cellules Th17. Les cellules Th17 se caractérisent par la combinaison de CD3 et d'IL-17. La cytokine IL-17 peut également être produite par des cellules non T 7 . Nous avons déterminé la distribution de l'intra-epitLes lymphocytes T de l'hélium et du stromal, les cellules non T Tregs, Th17 et IL-17 + dans une grande série de cas OPSCC et ont analysé les corrélations avec la survie du patient. La fluorescence multicouche IHC a été utilisée pour identifier l'expression de CD3, Foxp3 et IL-17, en combinaison avec un contre-tassement DAPI. Ce dosage a permis d'identifier facilement et clairement les cellules tumorales (en utilisant la coloration nucléaire DAPI) et les populations de cellules T infiltrantes (en utilisant une combinaison de marqueurs différents). Après la préparation et la coloration des échantillons, un microscope fluorescent et un logiciel d'imagerie ont été utilisés pour séparer les différentes couleurs fluorescentes utilisées et pour déterminer le nombre et le type de cellules présentes à la fois dans l'épithélium tumoral et dans le stroma associé à la tumeur.

Un autre essai pour quantifier et phénotype des populations de cellules immunitaires est l'analyse de cytométrie de flux, ou la cytométrie par analyse de temps de vol (CyTOF), d'échantillons de tumeurs ou de périphériques ( c.-à-d., Le sang ou l'ascite). En utilisant ceciTechnique, toutes les informations sur la localisation et la répartition relative des différents types de cellules sont perdues. L'utilisation et l'analyse des échantillons périphériques ne fournissent pas non plus d'informations sur les cellules susceptibles d'infiltrer le micro-environnement de la tumeur. Les analyses de cellules immunitaires de sang et d'ascite ont été montrées pour ne pas refléter le phénotype et la fréquence d'infiltration de cellules immunitaires du tissu tumoral 8 , 9 .

Une autre alternative est l'utilisation de microscopie à champ brillant. Un avantage de cette technique par rapport à l'imagerie par fluorescence est l'absence d'autofluorescence tissulaire. Bien que certains échantillons contiennent plus d'autofluorescence, en particulier les érythrocytes, mais aussi d'autres types de cellules, y compris les granulocytes neutrophiles, ces zones peuvent facilement être éliminées lors de l'analyse de presque tous les échantillons. L'immunofluorescence offre l'avantage d'analyser des marqueurs multiples dans un échantillon en utilisant un panel de fluorescence cibléeNt longueur d'onde. Ceci est actuellement impossible dans la même mesure pour le microscope à champ brillant en raison de l'absence d'un nombre suffisant d'étiquettes et d'isotypes d'anticorps disponibles dans le commerce pour un antigène particulier.

La technique de fluorescence multicouche IHC décrite ici a été utilisée dans de nombreux types de cancer différents et des combinaisons d'anticorps pour étudier différentes populations de cellules immunitaires, ainsi que des molécules exprimées par des cellules tumorales, telles que des antigènes de leucocytes humains (HLA) et PD-L1 10 , 11 , 12 . Le protocole a été établi et validé à l'aide de différents types d'échantillons et d'anticorps.

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Protocole

Les échantillons de patients ont été traités conformément aux directives éthiques médicales décrites dans le Code de conduite pour une utilisation secondaire appropriée du tissu humain de la Fédération néerlandaise des sociétés scientifiques biomédicales (www.federa.org).

1. Préparez des diapositives

  1. Obtenir des tissus réséqués (tout type de tissu) d'un département de pathologie après avoir obtenu l'autorisation d'un comité d'éthique médicale pour utiliser le matériel réséqué.
    NOTE: Pour l'expérience actuelle, des échantillons de tumeurs de prétraitement ont été obtenus à partir de tumeurs oropharyngées primaires diagnostiquées dans le Leiden University Medical Center, Leiden, Pays-Bas entre 1970 et 2011, sélectionnées comme décrit précédemment (n = 162) 13 . La taille du tissu n'était limitée que par l'exigence d'une quantité suffisante de tissu tumoral pour prendre de manière fiable 4 images microscopiques à l'intérieur de la tumeur.
  2. Fixer le tissu dans du formol tamponné à 4% pendant au moins 12 h. Déshydrate le tissu en agSérie d'éthanol radié. Lavez-le dans du xylène et incorporez-le dans de la paraffine à l'aide d'un processeur automatisé de tissu.
  3. Découpez des sections de tissu à 4 μm d'épaisseur fixées au formol et à la paraffine (FFPE) sur des lames de verre à l'aide d'un microtome. Placez le bloc de tissu dans le support de tissu microtone en utilisant des procédures standard.
    1. Couper les rubans de tissu et les poser sur la surface d'un bain-marie contenant de l'eau désionisée à 45 ° C. Utilisez un coulissant adapté pour la coloration immunohistochimique pour pêcher une section en plaçant la glissière dans l'eau directement sous la section. Déplacez soigneusement la glissière vers le haut dans un angle, enlevant la section de l'eau et en la collant sur la glissière.
  4. Laissez les glissières sécher pendant une nuit à 37 ° C.
  5. Déparaffinez les diapositives FFPE en les immergeant complètement dans 100% de xylene frais, trois fois pendant 5 min chacun. Réhydratez les diapositives en les immergeant deux fois dans de l'éthanol 100% frais, 70% d'éthanol et 50% d'éthanol pendant 5 min chacun.

2. Effectuer la récupération de l'antigène

  1. Laver les lames dans de l'eau désionisée pendant 5 min.
  2. Préchauffer le tampon d'acide Tris-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (Tris 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 9,0) jusqu'à la température d'ébullition en utilisant un micro-ondes. Effectuer la récupération de l'antigène en immergeant les diapositives dans le tampon EDTA préchauffé et en gardant le tampon à cette température pendant 10 minutes au micro-ondes.
    REMARQUE: Tout micro-ondes d'une puissance de 900 W peut être utilisé.
  3. Laissez les glissières refroidir dans le tampon pendant 2 h.

3. Diapositives sur les taches

  1. Lavez les diapositives deux fois avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes chacune.
  2. Dessinez un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe pour empêcher les anticorps dilués de renverser la glissière. Laver encore une fois avec le PBS; Ceci est facultatif.
  3. Incuber le tissu avec des anticorps primaires (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 et anti-IL-17 1:50) dilué dans du sérum bovin à 1% p / v aLbumin (BSA) dans du PBS à température ambiante pendant une nuit.
    REMARQUE: Le volume par diapositive dépend de la taille du tissu, mais il est typiquement de 50 à 150 μL. Remplacer les anticorps primaires par des anticorps de la même classe d'isotype avec une spécificité inconnue pour les diapositives de contrôle négatives à la même dilution que les anticorps CD3, CD8 et FoxP3 ( c.-à-d. Anticorps anti - isotypes Ig de lapin, anticorps anti-isotypes IgG1 de souris et chèvre Anticorps anti-isotypes IgG).
  4. Lavez les diapositives trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
  5. Incuber le tissu avec une combinaison d'anticorps secondaires marqués par fluorescence ciblant les espèces et / ou les isotypes d'anticorps primaires ( c. -à-d. IgG Alexa 488 à 1: 200 anti-chèvre, IgG A546 anti-lapin d'âne et A647 anti-souris d'âne) dilué dans 1% de BSA dans du PBS à température ambiante pendant 1 h.
    NOTE: Le volume par diapositive dépend de la taille du tissu, mais il est typiquement de 50 à 150 μL.
    1. AprèsEn ajoutant l'anticorps secondaire, gardez les diapositives protégées contre la lumière autant que possible en les stockant dans une boîte noire ou en enroulant la boîte en papier d'aluminium.

4. Glisser les diapositives de montage et de rechapage

  1. Lavez les diapositives trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacune.
  2. Monter les glissières à l'aide d'un support aqueux anti-décoloration contenant un contre-durcisseur nucléaire ( p. Ex., DAPI). Analyser les diapositives à l'aide d'un microscope fluorescent dès que possible (dans les deux semaines). Rangez les diapositives dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à l'analyse.

5. Analyser les diapositives de tissus tachés

  1. Obtenez quatre images de chaque diapositive à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un objectif 20-25. Prenez des images à des endroits aléatoires dans toute la zone tumorale totale incluse dans la diapositive pour capturer une fraction représentative de la tumeur.
    REMARQUE: un grossissement standard de 250X devrait être utilisé. Tout fluorescent oR peut être utilisé, à condition qu'il ait les filtres et les lasers nécessaires pour visualiser les fluorochromes utilisés.
    1. Pour la visualisation d'Alexa 488, utilisez un maximum d'excitation de 490 et un maximum d'émission de 525; Pour la visualisation d'Alexa 546, utilisez un maximum d'excitation de 556 et un maximum d'émission de 573; Pour la visualisation d'Alexa 647, utilisez un maximum d'excitation de 650 et un maximum d'émission de 665; Et pour la visualisation de DAPI, utilisez un maximum d'excitation de 358 et un maximum d'émission de 461.
    2. Enregistrez les images sous forme de fichiers d'image ( c.-à-d. Jpeg et tiff) dans le logiciel disponible pour l'utilisateur.
  2. Discrimination entre l'épithélium tumoral et les zones de stroma tumorales en fonction des formes nucléaires et cellulaires des cellules épithéliales tumorales contre les cellules stromales après consultation d'un pathologiste.
    1. Pour déterminer la surface totale de la stomie, tracez une ligne autour de toutes les zones occupées par les cellules stromales (plutôt que les cellules tumorales) et le recorD la surface en utilisant le logiciel d'analyse d'image fourni par le fabricant du microscope.
      1. Cliquez sur l'onglet "Superposition" sous l'image; Choisissez la forme "Closed Poly-line" et cliquez dessus. Démarquez la limite entre les champs épithélium tumoral et les champs stromal en cliquant autour de la zone jusqu'à ce que le premier point soit rétabli. Cela fournit une mesure pour cette zone.
        REMARQUE: une fois que la forme est fermée, un nombre apparaîtra à côté de la forme entourant la surface de l'image sélectionnée (A = x μm 2 ).
    2. Soustrayez cette surface de la surface totale de l'image (fournie dans les propriétés de l'image) pour calculer la surface de la surface épithéliale. Exclure les zones vasculaires, nécrotiques et autofluorescentes en dessinant une ligne autour d'elles, en enregistrant la taille de la zone fournie et en soustrayant celle de la surface épithéliale.
    3. Enregistrez tous les numéros de surface dans un fichier de tableur pour calculer les surfaces moyennes etNuméros de cellule par diapositive.
    4. En utilisant le logiciel d'analyse d'image, déterminez si les cellules sont simples, doubles ou triples en vérifiant la fluorescence des quatre canaux.
      1. Comptez les cellules à simple, double et triple positif dans chaque image en utilisant ImageJ.
        1. Télécharger ImageJ. Ouvrez une image en cliquant sur "Fichier" et "Ouvrir" et en sélectionnant l'image à analyser. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur "Point Tool" (un carré rouge au milieu de quatre lignes) et sélectionnez "Multi-Point Tool". Double-cliquez sur «Multi-Point Tool» et comptez le nombre de différents types de cellules dans l'image en sélectionnant un numéro de compteur différent pour chaque type de cellule.
          REMARQUE: comptez toutes les cellules de chaque type de cellule différente, identifiées par la présence d'une, deux ou toutes les trois couleurs fluorescentes. Exclure DAPI, car ce contre-durcissement nucléaire est présent dans toutes les cellules et est utilisé pour discriminer les cellules tumorales des cellules immunitaires. Chaque type de cellule est comptéEn utilisant un numéro de compteur différent. Comptez les nombres de cellules de chaque type de cellule séparément dans les zones épithéliales et stromales de la tumeur en choisissant chaque fois un numéro de compteur différent. Ne comptez pas les cellules dans les vaisseaux sanguins et les zones largement autofluorescentes.
        2. Enregistrez le nombre de cellules analysées dans chaque conteneur pour chaque image dans un fichier de tableur.
        3. Diviser le nombre total de cellules pour chaque type de cellule sur la surface totale de l'épithélium tumoral et le stroma tumoral analysé.

6. Analyse statistique

NOTE: Toutes les analyses statistiques doivent être discutées avec un statisticien pour assurer la qualité des données. Pour les statistiques générales, utilisez un guide de statistiques médicales 14 .

  1. Testez les corrélations entre les fréquences cellulaires en utilisant un test de Rho de corrélation de rang de Spearman.
  2. Testez les différences statistiques dans le nombre de cellules positivesEntre les groupes de patients en utilisant le test de Wilcoxon Mann-Whitney.
  3. Testez les corrélations entre le nombre de cellules et la survie sans maladie ( c.-à-d., Le délai entre le diagnostic et la récidive locale ou distante de la mort ou de la maladie) en divisant les patients en groupes en fonction d'un nombre de cellules coupées utilisant la génération de courbes de Kaplan-Meier et le journal Analyse de rang 15 .
  4. Effectuer des analyses multivariées à l'aide de l'analyse de régression par risque proportionnel de Cox.

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Résultats

Une série d'échantillons de tumeurs de prétraitement FFPE obtenues à partir de tumeurs oropharyngées primaires diagnostiquées dans le Centre médical de l'Université de Leiden, à Leiden, aux Pays-Bas entre 1970 et 2011, sélectionnées comme décrit précédemment (n = 162), ont été colorées selon le protocole décrit 13 . Une ou quatre images aléatoires de chaque diapositive ont été analysées ( figure 1 ). Certaines cellules autoflu...

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Discussion

Pour le protocole décrit, l'une des étapes les plus critiques est de déterminer la dilution correcte des anticorps primaires utilisés. La dilution des anticorps secondaires marqués était de 1: 200, comme recommandé par le fabricant de ces anticorps spécifiques à l'Alexa. La dilution des anticorps primaires devrait ensuite être déterminée par une dilution en série, de préférence en utilisant deux échantillons différents du type de tissu souhaité (dans ce cas, OPSCC). La dilution de travail optimale est la dilutio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts commercial ou financier.

Remerciements

Simone Punt a été soutenu par la licence UL2010-4801 de la Dutch Cancer Society. Nous tenons à remercier tous les coauteurs de l'article original selon lequel ce protocole JoVE est basé sur: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter et Sjoerd van Der Burg.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pathos Delta Ultra Rapid Tissue ProcessorMilestone et HistostarProcesseur de tissus automatisé
HistostarThermo ScientificMachine d’enrobage de blocs de tissus
FormaldehydeBaker
XylolMerck
EthanolMerck
milliQ waterElaga Purelab Chorus
Cire de paraffine/ParacleanKlinipath5079A
Porte-mouchoir à microtomeLeicaRM225
Flex IHC sideDakoLame de mouillage
TrisMerk-Milipore1,083,821,000
EDTABaker1073
PBSBio-RadBUF036A
BSASigmaA9647
Rabbit anti-CD3Abcamab828Titrage requis dilution d’anticorps
Souris IgG1 anti-FoxP3Abcamab20034Titrage requis dilution d’anticorps
Chèvre IgG anti-IL-17R& D SystemsAF-317-NATitrage de la dilution d’anticorps requise
Anticorps de contrôle des isotypes des Igs de lapinAbcamab27472Utilisation à la même concentration finale que l’anticorps de
contrôle des isotypes IgG1 de sourisAbcamab91353Utilisation à la même concentration finale que l’anticorps de
contrôle des isotypes des IgG de la chèvreThermoFisher Scientific02-6202Utilisation à la même concentration finale que anti-IL-17
Âne anti-lapin IgG A546ThermoFisher ScientificA10040Dilué 1:200 dans 1 % BSA/PBS
Âne anti-souris-A647ThermoFisher ScientificA31571Dilué 1:200 dans 1 % BSA/PBS
Âne anti-chèvre IgG A488ThermoFisher ScientificA11055Dilué 1:200 dans 1 % BSA/PBS
VectaShield contenant DAPIVector LaboratoriesH-1200
Microscope confocal à balayage laser LSM700Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objectifZeiss420852-9972-720
LSM Zen SoftwareZeissversion 2009
LSM Image BrowserZeissversion 4.2.0.121Disponible en téléchargement sur www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.
SPSSIBM Corp.version 20.0
ImageJversion 1.50iDisponible en téléchargement à http://rsb.info.nih.gov/ij.
anti-FoxP3

Références

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Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Tissus fixés au formol et inclus en paraffineIHC de fluorescence multiparamétriquelymphocytes T CD3-positifsTreg FoxP3-positifscellules Th17 IL-17-positivesmicroscopie de fluorescencelogiciel d'analyse d'images
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