Ici, nous décrivons une nouvelle approche pour infliger une lésion cérébrale traumatique à tête fermée chez Drosophila melanogaster . Notre méthode présente l'avantage de fournir directement des impacts répétitifs avec une force réglable sur la tête seule. Une exploration plus poussée du système invertébré aidera à éclairer la pathogenèse de l'encéphalopathie traumatique chronique.
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Article de méthode
Une nouvelle méthode pour modéliser l'encéphalopathie traumatique chronique dans
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Résumé
Résumé
L'encéphalopathie chronique traumatique (CTE) est une maladie neurodégénérative établie qui est étroitement associée à une exposition à une lésion cérébrale traumatique répétitive légère (mTBI). Les mécanismes responsables de ses changements pathologiques complexes restent largement insaisissables, malgré un consensus récent pour définir les critères neuropathologiques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour développer un modèle de CTE dans Drosophila melanogaster ( Drosophila ) dans une tentative d'identifier les gènes et les voies clés qui conduisent à l'accumulation caractéristique de tau hyperphosphorylée et à la mort neuronale dans le cerveau. Les effets de résistance réglables pour infliger des blessures légères et fermées sont livrés directement à la tête de mouche, en soumettant la tête à une accélération et une décélération rapides. Notre méthode élimine les problèmes potentiels inhérents à d'autres modèles mTBI de Drosophila ( par exemple, la mort d'un animal peut être induite par un dommage àD'autres parties du corps ou des organes internes). Les soins infantiles moins coûteux et coûteux, la durée de vie courte et les outils génétiques étendus rendent la mouche des fruits idéale pour étudier la pathogenèse du CTE et permettre d'effectuer des écrans génétiques et pharmacologiques avancés à l'échelle du génome. Nous prévoyons que la caractérisation en cours du modèle générera des connaissances mécanistiques importantes sur la prévention des maladies et les approches thérapeutiques.
Introduction
L'encéphalopathie traumatique chronique (CTE) a récemment été reconnue comme un trouble neurodégénératif distinct, séparé des autres tauopathies telles que la maladie d'Alzheimer 1 . Contrairement à la maladie d'Alzheimer et à d'autres tauopathies communes, dont les facteurs de risque les plus importants font avancer l'âge et les antécédents familiaux de démence, le CTE, comme l'indique son nom, implique une étroite association avec une histoire de traumatisme cérébral, très probablement observé chez les sportifs de sport de contact, Tels que les boxeurs et les joueurs de football, ainsi que dans les anciens combattants militaires 2 , 3 , 4 , 5 . On pense qu'il est initié par des coups répétés de concussion et de subconcussion à la tête. Les patients peuvent présenter des symptômes et des signes tels que les déficits cognitifs, les changements de l'humeur et du comportement et le dysfonctionnement du mouvement, qui se chevauchent de manière significative avec la maladie d'Alzheimer, frontotemporalLa démence, la démence du corps de Lewy et la maladie de Parkinson 6 . En revanche, les examens post-mortem du tissu cérébral révèlent un modèle distinct d'accumulation de tau hyperphosphorylée entourant de petits vaisseaux sanguins au fond des sondes corticales, une caractéristique pathognomonique non observée dans les autres affections dégénératives 7 . Cependant, jusqu'à présent, on sait très peu de choses sur la pathogenèse menant à la manifestation de la maladie. Ceci est en grande partie dû à l'absence d'un modèle animal fidèle - récemment, des modèles de rongeurs ont été générés 5 , 8 . Ces organismes modèles ont les inconvénients des soins intensifs en coûts et une durée de vie relativement longue, qui ne sont pas bien adaptées aux études sur les maladies neurodégénératives.
Par rapport aux homologues de mammifères, les animaux invertébrés tels que Drosophila sont une excellente alternative, avec leur maintenance rentable,Des outils étendus pour dissécher les déterminants génétiques et une durée de vie relativement courte 9 . Remarquablement, la volée et les cerveaux humains partagent des voies moléculaires et cellulaires évolutives conservées, ainsi que des similitudes anatomiques 10 , 11 , 12 . Deux modèles ingénieux de Drosophila pour étudier une lésion cérébrale traumatique ont déjà été rapportés 13 , 14 . Le premier dispositif "High Impact Trauma" (HIT) conçu par Katzenberger et ses collègues contenait des mouches à mouvement libre dans un flacon en plastique qui était lié à l'extrémité libre d'un ressort métallique 13 , 15 . Lorsque le flacon en plastique a été incliné verticalement et relâché, il a frappé un tampon en polyuréthane et a transmis un traumatisme aux mouches alors qu'ils remontent vers le mur du flacon et se sont rétablis. En revanche, Barekat et ses collègues ont conçu une méthode de livraison différente.La plate-forme Omni Bead Ruptor-24 14 . Les mouches ont été incapacités avec du CO 2 et ont été placées dans un tube à vis de 2 mL qui a été fixé à l'homogénéisateur et soumis à des conditions de secousse préprogrammées. L'un des avantages de l'utilisation du système d'homogénéisation des tissus est que l'expérimentateur pourrait moduler l'intensité des blessures, la durée de la blessure et le nombre de blessures. Cependant, les deux régimes souffrent du même inconvénient: les blessures primaires de la tête sont infligées au hasard en termes d'impact sur le lieu et la force. En outre, les deux méthodes ont entraîné une mortalité considérable, causée par des dommages collatéraux inévitables à d'autres parties du corps et des organes internes. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour induire le mTBI dans les mouches des fruits. Notre appareil se compose d'un pistoque balistique à propulsion gazeuse. Par rapport aux modèles Drosophila existants 14 , 15 , notre méthode présente l'avantage unique de fournir des mesuresL'impact urable, dirigé uniquement sur la tête de mouche en mouvement libre, permettant ainsi le contrôle précis de divers facteurs, tels que la gravité de l'impact, l'intervalle de temps entre les impacts et le nombre total d'impacts subis.
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Protocole
1. Assemblage du dispositif de frappe ( Figure 1 )
- Retirez le piston d'une seringue de tuberculine de 1 ml. Couper le canon à la marque de 1 mL.
- Retirez une barrière aérosol (3 mm de hauteur x 4 mm de diamètre) à partir d'une pointe de pipette de 200 μL et utilisez-la comme élément de frappe. Placez l'élément de frappe dans le cylindre de la seringue. Appuyez doucement sur le canon pour déplacer l'élément de frappe à l'extrémité de la pointe, le côté plat recouvrant l'ouverture de la buse.
- Fixez l'extrémité de la pointe du cylindre à un tube en plastique qui est connecté au régulateur de débit de dioxyde de carbone (CO 2 ) d'une station d'anesthésie de Drosophila .
- Tenez le canon verticalement et serrez-le sur un support de support de serrage standard de sorte que l'élément de frappe reste au bas du barillet.
- Modifiez une pointe de pipette de 200 μL pour fabriquer le porte-mouches.
- Coupez 4 mm de la pointe pour créer une ouverture de 0,8 mm de diamètre, ce qui permet à la tête de mouche d'être exposée.
REMARQUE: le thoRax et toutes les autres parties du corps de mouche resteront à l'intérieur de la pointe de la pipette.
- Coupez 4 mm de la pointe pour créer une ouverture de 0,8 mm de diamètre, ce qui permet à la tête de mouche d'être exposée.
- Modifiez une pointe de pipette de 1000 μL et une bouchon d'aiguille de seringue de 1 mL pour créer le connecteur.
- Coupez 44 mm de l'ouverture de la pointe. Prenez une longueur de 6 mm d'un bouchon d'aiguille de seringue de 1 mL et poussez-le bien dans le segment restant de la pointe de pipette de 1000 μL.
2. Fonctionnement du dispositif de grève
- Anesthésier une seule mouche femelle adulte de 2 jours utilisant du CO 2 sur une coque.
- Transformez-le doucement sur le porte-mouches à l'aide d'une brosse fine. Tapotez délicatement le support afin que la tête de mouche soit vue en dehors de la pointe. Si le proboscope de la mouche est exposé à l'extérieur de la pointe, retirez-la délicatement à l'intérieur de la pointe avec une aiguille de seringues à 1 mL émoussée.
REMARQUE: Assurez-vous de garder les proboscis de la mouche à l'intérieur du support. Sinon, la mouche peut mourir d'une blessure par proboscis d'aspiration. - Serrez la mouche hoLève le cylindre de la seringue avec le connecteur pour que la tête de la mouche soit orientée vers le bas.
- Réglez la pression du gaz à 100 kPa. Réglez le débit en fonction de la conception de l'expérience.
- Tournez rapidement et à nouveau le bouton-poussoir du régulateur de débit pour que l'élément de frappe frappe la tête de mouche une fois.
- Soulevez le porte-mouche et déplacez-le sur une coque. Inverser le porte-mouches et frapper doucement le côté pour laisser tomber la mouche. Laisse la mouche dans un flacon vide pour récupérer.
3. Suivi des mouvements assisté par vidéo
- Remplissez une boîte de Petri de 6 cm de diamètre avec un élastomère de silicium transparent pour faire l'arène de suivi. Laissez un espace de 3 mm entre le silicium et le couvercle du plat pour permettre aux mouches de marcher librement mais pas de voler.
- Anesthésier les quatre mouches à partir du sham ou du groupe traité à chaque fois et les placer dans l'arène. Laissez les mouches à 22 ° C pendant 1 h.
- Positionnez une caméra de type Charge-Coupled Device (CCD) au-dessus des arènes et enregistrez pendant 5 min.
- Analyser les trajectoires de mouvement enregistrées à l'aide du logiciel Ctrax (disponible gratuitement dans Caltech) 16 . Exportez les données suivies dans un format compatible avec le langage de programmation (par exemple, Matlab) et analysez les données en fonction de la distance parcourue par trame 17 . Calculez la distance de marche moyenne pour chaque vol et combinez-le avec toutes les autres mouches / groupes enregistrés pour obtenir une distance cumulative moyenne parcourue par la population de fichiers dans le même groupe.
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Résultats
Pour établir un modèle CTE à l'aide de Drosophila adulte, nous avons déterminé l'efficacité de notre appareil pour infliger une blessure à tête fermée. Pour éliminer les variations relatives au génotype, au sexe ou à l'âge, nous avons utilisé des mouches femelles Canton-S WT de 2 jours dans l'expérience. Nous pourrions facilement contrôler la résistance de l'élément de frappe en régulant le débit de CO 2 à une pression de gaz constante de 100 kPa. ...
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Discussion
Les modèles animaux qui font fidèlement les caractéristiques du CTE, y compris les altérations neurophysiologiques, les caractéristiques neuropathologiques et les déficits neuro-comportementaux, sont essentiels pour découvrir les mécanismes de la maladie et pour développer des cibles diagnostiques et thérapeutiques. Il est compréhensible qu'aucun modèle animal d'une maladie humaine ne soit parfait pour imiter tous les paramètres finaux cliniquement pertinents. Cependant, nous croyons qu'un modèle CTE robuste...
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Déclarations de divulgation
Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage de la faculté de médecine de l'Université Johns Hopkins à LC
Remerciements
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Barrière anti-aérosol | USA Scientific | 1120-8810 | Utilisé comme impacteur |
| 200 μ ; L Pointe de pipette | USA Scientific | 1111-0706 | Utilisé comme support de tête de mouche |
| 1000 μ ; L Pointe de pipette | USA Scientific | 1122-1830 | Utilisé comme connecteur |
| 1 mL Seringue à tuberculine | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | FB0875713A | Utilisé comme arènes de suivi |
| Régulateur de débit | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Support/support | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Brosse fine | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD | Camera Microsoft ; | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| Boîte à outils MATLAB pour le traitement d’images | MATLAB | R2015b |
Références
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Réimpressions et autorisations
