Article de méthode

Protocole de suivi vidéo pour les chimies de dissolution d'écran pour les abeilles

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DOI :

10.3791/55603

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12 juin 2017

 , 
1Entomology, Virginia Tech, 2Entomology, University of Nebraska-Lincoln

Dans cet article

Résumé

La perte de colonies d'abeilles de miel présente un défi pour les services de pollinisation des cultures. Les pratiques actuelles de protection des pollinisateurs justifient une approche alternative pour minimiser le contact des abeilles à des pesticides nuisibles à l'aide de chimie répulsif. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour un protocole de suivi visuel pour dissimuler les dissolvants pour les abeilles.

Résumé

L'abeille européenne , Apis mellifera L. , est une pollinisation économique et agricole qui génère des milliards de dollars par an. Le nombre de colonies d'abeilles de miel a diminué aux États-Unis et dans de nombreux pays européens depuis 1947. Un certain nombre de facteurs jouent un rôle dans ce déclin, y compris l'exposition involontaire des abeilles à des pesticides. Le développement de nouvelles méthodes et règlements est justifié pour réduire l'exposition aux pesticides à ces pollinisateurs. Une approche est l'utilisation de chimies répulsives qui dissuadent les abeilles de miel d'une récolte récemment traitée par un pesticide. Ici, nous décrivons un protocole pour discerner la dissuasion des abeilles de miel exposées à des chimies répulsives sélectionnées. Les cueilleurs à abeilles à miel sont recueillis et affamés pendant la nuit dans un incubateur 15 h avant le test. Les abeilles à miel individuelles sont placées dans des boîtes de Petri qui possèdent soit un cube de sucre-agarose (traitement témoin), soit un cube de sucre-composé d'agarose (traitement répulsif) placé dansAu milieu du plat. La boîte de Petri sert d'arène qui est placée sous une caméra dans une boîte lumineuse pour enregistrer les activités de locomoteurs d'abeille en utilisant un logiciel de suivi vidéo. Au total, 8 traitements témoins et 8 répulsifs ont été analysés pendant une période de 10 minutes, chaque traitement ayant été reproduit avec de nouvelles abeilles. Ici, nous démontrons que les abeilles de miel sont dissuadées des cubes de sucre et d'agarose avec un traitement composé alors que les abeilles sont attirés par les cubes de sucre-agarose sans composé ajouté.

Introduction

L'abeille européenne , Apis melliferaL. , Est un insecte économique et d'importance économique qui fournit des services de pollinisation évalués à plus de 200 milliards de dollars à l'échelle mondiale 1 . Aux États-Unis et en Europe, le nombre de colonies d'abeilles a diminué. Les États-Unis ont perdu la ca. 60% des colonies de abeilles douces gérées de 1947 à 2008, alors que l'Europe a perdu la ca. 27% de 1961 à 2007 2 , 3 . Il existe un certain nombre de facteurs qui pourraient être responsables du nombre accru de pertes de colonies, y compris, mais sans s'y limiter, les infestations parasitaires, les infections pathogènes, les pratiques d'apiculture et l'utilisation de pesticides 2 à 4 .

Les abeilles peuvent être exposées aux pesticides par deux voies principales. L'exposition des pesticides à l'extérieur de la ruche peut se produire lorsque les personnes nourrissantes entrent en contact avec des cultures quiOnt été pulvérisés avec des produits chimiques pour la protection contre les parasites. L'exposition aux pesticides à l'intérieur de la ruche peut se produire lorsque les apiculteurs utilisent des produits chimiques pour lutter contre les ravageurs et les agents pathogènes dans la rivière, tels que les acariens, les bactéries et les microsporidies 4 . Des résidus de pesticides ont été identifiés dans des échantillons de cire, de pollen et d'abeilles à base de 24 ruchers aux États-Unis et au Canada 5 , 6 . Les effets du contact avec les pesticides chez les abeilles mélangées incluent une toxicité aiguë ainsi que des effets sous-létals tels que la paralysie, la désorientation et les changements de comportement et de santé 1 , 7 . Comme l'agriculture moderne nécessite l'utilisation de pesticides pour maintenir un rendement élevé des cultures, ces produits chimiques continueront à être utilisés à l'avenir 2 . Afin de mieux protéger les abeilles de l'exposition aux pesticides, il est nécessaire d'élaborer de nouveaux protocoles et réglementations 5 .Une approche possible pour la protection est l'utilisation de répulsifs pour réduire l'exposition des abeilles aux pesticides tout en se nourrissant de nourriture.

Les insectifuges (IR) ont généralement été utilisés comme mesures de protection personnelle contre les virus des arthropodes 8 . L'IR le plus utilisé et le plus réussi, développé il y a plus de 60 ans, est DEET 8 , 9 . Il est considéré comme l'étalon-or pour les tests anti-insectes et est utilisé par l'Organisation mondiale de la santé et l'Agence de protection de l'environnement comme un contrôle positif pour le criblage répulsif 10 . En outre, DEET a été trouvé pour disperser les abeilles de miel d'une menace à leur colonie 11 . Les attributs actuels associés aux IR personnels comprennent: (1) un effet durable contre un grand nombre d'arthropodes; (2) non irritant pour l'utilisateur lorsqu'il est appliqué sur la peau ou les vêtements; (3) inodore ouOdeur agréable; (4) aucun effet sur les vêtements; (5) aucune apparence huileuse lorsqu'elle est appliquée sur la peau et pour résister à la transpiration, au lavage et à l'essuyage par l'utilisateur; (6) aucun effet sur les plastiques couramment utilisés; Et (7) chimiquement stable et abordable pour une utilisation généralisée 12 . Un répulsif utilisé pour les abeilles ne nécessite que quelques-uns de ces attributs tels que des effets durables, des irritants pour les applicateurs, une odeur inodore ou agréable, chimiquement stable et abordable pour une utilisation répandue et non toxique pour les abeilles. Cependant, avant d'explorer ces attributs en profondeur, une méthode pour cribler des composés pour la répulsion / la dissuasion à haut débit est nécessaire. Ici, nous décrivons un protocole pour un essai de laboratoire pour cribler des composés pour la dissuasion des abeilles, une étape importante dans la détermination de la répulsion. Le protocole suivant est modifié à partir d'une étude antérieure décrivant une méthode de suivi visuel pour évaluer les effets sublétaux des pesticides sur les abeilles 13 . HowePar exemple, ce protocole diffère en ce sens qu'il est conçu pour mesurer les effets des répulsifs candidats qui pourraient dissuader les abeilles de miel des cultures traitées par des pesticides. Il n'existe pas de protocoles recommandés pour les essais en laboratoire de dissolvants chimiques pour les abeilles et, par conséquent, ce protocole offre une approche simple pour l'affichage de tels composés.

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Protocole

1. Préparez des cubes de sucre-agarose

  1. Pesez 8 g de sucre et placez-les dans une fiole Erlenmeyer de 50 ml.
  2. Remplissez le ballon Erlenmeyer avec 20 ml d'eau désionisée. Dissoudre le sucre en faisant tourbillonner le flacon.
  3. Peser 170 mg d'agarose et l'ajouter à la solution de sucre.
  4. Chauffer la solution de sucre-agarose dans un four à micro-ondes en haut pendant 25 s. Dissoudre l'agarose dans la solution de sucre.
  5. Laisser refroidir le flacon et la solution de sucre-agarose.
    REMARQUE: Le flacon doit être frais au toucher, mais ne laissez pas la solution se solidifier.
    1. Pour préparer un cube de sucre-agarose pour le traitement de contrôle, verser la solution de sucre-agarose semi-refroidie dans un moule de bateau de pesée.
      REMARQUE: Le moule de pesée a les dimensions 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 .
    2. Pour préparer un cube de sucre-composé d'agarose pour le traitement répulsif, ajouter la quantité souhaitée de composé à la solution semi-refroidie ( par exemple , 1% DEET en sUgar-agarose (v / v)). Faites pivoter le flacon pour mélanger le composé, puis versez la solution dans un moule de bateau de pesée.
      REMARQUE: huit moules de contrôle et huit moules d'essai seront préparés à ce stade. Les moules de contrôle ne contiennent pas de répulsif.
  6. Refroidir les cubes de sucre-agarose dans les moules dans un réfrigérateur pendant 5-10 min. Retirer les cubes solidifiés de sucre et d'agarose des moules des bateaux de pesée et les placer dans un récipient en plastique avec une serviette en papier humidifié.
  7. Placez les récipients dans un réfrigérateur pour le stockage. Les cubes de sucre-agarose doivent être utilisés dans les 7 jours suivant leur préparation.

2. Programmation du logiciel de suivi vidéo et de la configuration expérimentale

  1. Sous Paramètres d'expérience dans la barre de l'Explorateur d'expérience (dans le logiciel de suivi, voir la Table des matériaux), située à gauche de l'écran, assurez-vous que la caméra correcte est sélectionnée et que l'enregistrement vidéo est centré sur les arénas de Petri.
    1. Si l'enregistrement vidéo doit être centré, accédez aux réglages de l'appareil photo et sous les contrôles AOI et sélectionnez les options centrales X et Y centrale.
  2. Sous Paramètres d'expérience, modifiez le nombre d'arènes à 16. Sous Caractéristiques suivies, sélectionnez Détection du point central.
  3. Sélectionnez Paramètres Arena pour configurer l'arène souhaitée pour l'analyse.
    1. Placez les 16 boîtes Petri dans un motif 4 x 4 sur un boîtier lumineux, placé sous la caméra ( Figure 1 ).
      REMARQUE: Ces plats servent à créer l'arène d'enregistrement et sont vides.

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Figure 1: Arrangement de Petri sur la boîte à lumière. Les boîtes de Petri sont disposées dans un bloc 4 x 4 sur le boîtier lumineux. Cet arrangement permet une identification facile des traitements de contrôle et de répulsion pour le vProtocole de suivi individuel. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Dans les réglages de l'arène, utilisez le bouton de l'arrière-plan, situé sur le panneau de l'outil du côté droit, pour prendre une photo des 16 boîtes de Petri. Ceci sera utilisé comme modèle pour configurer l'arène.
  2. Sélectionnez "Créer une ellipse" dans la barre d'outils en haut de l'écran Paramètres Arena et créez un cercle qui correspond au diamètre de l'une des boîtes de Petri dans l'image saisie. Placez le marqueur Arena 1 dans le cercle ( Figure 2 ).

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Figure 2: Capture d'écran du Visual Tracking Software Arena Settings. L'observation des bandes diagonales dans le cercle confirme la zone de détection dans le cercle. UNE Le marqueur Zone 1 est fourni pour chaque carré et définit la zone cible pour chaque plat de Petri. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sélectionnez "Zone Group 1" situé sous Arena 1 dans le panneau d'outils du côté droit. Sélectionnez "Créer un rectangle" dans la barre d'outils en haut de l'écran. Créez un carré de 30 x 30 pixels à l'aide de ceci, puis positionnez-le au centre du cercle qui a été créé à l'étape précédente. Sélectionnez "Ajouter Zone" dans la barre d'outils supérieure, puis cliquez sur le milieu du carré. Déplacez le marqueur Zone 1 pour qu'il soit dans le carré.
    REMARQUE: Le carré créé est la zone d'alimentation et il n'est pas nécessaire que la zone d'alimentation soit exactement de la même taille que celle indiquée dans la mesure où elle est légèrement supérieure au cube d'agarose-sucre.

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Figure 3: Capture d'écran des paramètres de l'arène complétés. Les paramètres d'arène complétés devraient ressembler à cet exemple. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sélectionnez "Arena 1" dans le panneau d'outils du côté droit, puis cliquez sur dupliquer l'arène complète. Dans le menu déroulant, sélectionnez "Tous les autres arènes", puis cliquez sur OK. Déplacez les configurations d'arènes dupliquées sur les autres boîtes de Petri dans l'image saisie (Figure 3).
    1. Sélectionnez "Arena 1", puis sélectionnez "Calibrate Scale" dans la barre d'outils supérieure. Dessinez la ligne d'étalonnage sur le diamètre de la plate-forme de Petri Arena 1. Changez la mesure du diamètre à 9 cm (diamètre des boîtes de Petri utilisées). Sélectionnez «Valider les paramètres de l'arène» sur le panneau de l'outil côté droit.
  2. Sélectionnez "Paramètres de détection "sur la barre de contrôle à gauche.
  3. Sélectionnez "Paramètres de détection 1", puis sélectionnez "Réglage gris" dans le menu déroulant situé dans la boîte à outils du côté droit. Sous la détection, réglez la plage de sorte qu'elle soit de 0 à 83 ( Figure 4A ).
  4. Cliquez avec le bouton droit sur "Paramètres de détection" et créez un nouveau paramètre nommé "Paramètres de détection 2". Assurez-vous que "Gray Scaling" est toujours sélectionné, mais ne modifiez pas les autres paramètres.
    REMARQUE: il y aura de gros cercles jaunes dans la fenêtre vidéo sur les arènes. Cela aidera à organiser les plats de Petri dans les positions correctes avant l'enregistrement ( figure 4B ).

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Figure 4: Capture d'écran des Paramètres de détection 1 et 2. ( A ) Montre à quoi ressemblera l'arène avec l'échelle grise corrigée pour uneAbeille de miel dans une boîte de Petri. ( B ) Indique la zone de détection de l'arène afin que le positionnement des boîtes de Petri puisse se faire entre essais. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sélectionnez "Liste d'essai" dans l'Explorateur expérimental et cliquez sur "Ajouter une variable" dans la barre d'outils supérieure. Nommez la variable définie par l'utilisateur comme "Traitement". Sélectionnez la barre déroulante «Valeurs prédéfinies» dans la colonne Traitement définie par l'utilisateur et ajoutez C (contrôle) et T (traitement) en tant que valeurs prédéfinies. Sélectionnez le bouton "Ajouter des essais" situé dans la barre d'outils supérieure. Ajoutez deux essais, puis, pour chaque arène, sélectionnez s'il s'agit d'une arène de contrôle (C) ou d'une arène de traitement (T) ( Figure 5 ).

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FiGure 5: Capture d'écran de la Liste d'essai. L'etiquetage des arénas est important ici, car le programme utilise les informations ici pour séparer les données pour l'analyser statistiquement. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Sélectionnez "Profil de données" dans le panneau Expérimenter. Sur la colonne de gauche, sélectionnez "Traitement" situé sous l'intitulé "Variables indépendantes définies par l'utilisateur". Cela ajoutera une boîte "Filtre" dans la zone avec l'organigramme. Sélectionnez "C" dans la boîte contextuelle, puis placez le filtre nouvellement créé entre la zone "Démarrer" et "Résultat 1". Les flèches de l'organigramme doivent être réglées de sorte qu'elles passent de la boîte de départ au filtre et enfin au résultat 1.
    1. Répétez l'étape 2.12, mais sélectionnez cette fois "T" pour le filtre, puis sélectionnez"Résultat" dans la section "Éléments communs". Déplacez les cases nouvellement créées dans la zone d'organigramme et connectez les cases avec des flèches ( Figure 6 ).

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Figure 6: Capture d'écran du profil de données. Cela montre comment l'organigramme doit être configuré pour obtenir la séparation appropriée dans l'analyse statistique. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Enregistrez le fichier.

3. Recueillir des individus d'abeilles

  1. Mettez des vêtements de protection et sélectionnez une ruche pour collecter des abeilles (principalement des cueilleurs).
  2. Retirez le couvercle extérieur et intérieur de la ruche. Utilisez un outil de ruche pour sélectionner un cadre à partir du corps supérieur de la ruche qui ne contient pas de couvain.Soulevez doucement le cadre de la boîte de la ruche.
  3. Inspectez le cadre pour la reine des abeilles. Si elle n'est pas là, balayez les travailleurs des abeilles du cadre dans un conteneur pour le transport. Recueillez suffisamment d'individus pour pouvoir exécuter deux essais complets pour chaque composé à tester (16 individus sont utilisés par essai avec des témoins).
    REMARQUE: les personnes collectées devraient principalement être des fourrages; Cependant, il peut y avoir d'autres individus âgés tels que les abeilles infirmières incluses dans la collection.
  4. Prenez note du moment où les abeilles ont été enlevées. Transférer dans une boîte en plastique de 9 cm x 7 cm x 9 cm contenant des trous d'air et les placer dans un incubateur à 32 ° C et 70% d'humidité relative.
  5. Affamissez les abeilles par 15 h.
    NOTE: Cela fonctionne généralement mieux si les abeilles sont collectées le soir avant d'être testées.

4. Effectuer un essai de suivi visuel

  1. Démarrez le programme de suivi visuel et ouvrez les sauvegardesD fichier expérimental qui a été créé pour ce test.
  2. Sélectionnez "Paramètres de détection 2".
  3. Placez les gisements de sucre et d'agarose dans les centres de 8 des 16 boîtes de Petri. Répétez ce processus avec les cubes de composé de sucre-agarose (dissuasif) dans les 8 autres aliments.
  4. Utilisez une pince pour enlever une seule abeille de miel de la boîte en plastique et placez-la dans l'une des boîtes de pétri de contrôle.
  5. Répétez l'étape 4.4 pour les 15 autres boîtes de Petri.
  6. Placez tous les plats dans la boîte lumineuse et placez-les afin que les zones de détection de l'arène (indiquées sur l'écran de l'ordinateur lorsque le réglage de détection 2 est sélectionné) s'insèrent dans chacune des arènes de petri. Illuminez la boîte lumineuse à partir d'en bas par un ensemble de lumières LED réglées sur le spectre rouge. Entouré de la boîte entière et de la caméra avec une feuille de plastique noir pour éliminer la lumière externe et réduire les ombres dans les arènes.
  7. Une fois que les boîtes de Petri ont été réglées, assurez-vous que «Paramètres de détection 1» est leParamètre sélectionné.
    REMARQUE: à ce stade, le logiciel de suivi visuel ne devrait capturer que les abeilles de miel dans les arénas de petri.
  8. Sélectionnez "Acquisition" dans Explorateur d'expériences. Appuyez sur le bouton vert "Démarrer l'essai" situé dans la boîte de dialogue Acquisition Control à droite pour commencer l'enregistrement.
  9. Exécutez le dosage pendant 10 minutes, puis cliquez sur le bouton rouge "Arrêter l'essai" dans la boîte de dialogue Acquisition Control pour arrêter l'enregistrement.
  10. Retirez les individus des boîtes de Petri et placez-les dans un récipient séparé afin qu'ils ne soient pas testés deux fois.
  11. Répétez les étapes 4.4-4.10 pour le deuxième essai sur le même composé.
    REMARQUE: Cette méthode peut être modifiée pour augmenter le nombre d'abeilles mignonnes par traitement, selon les besoins de l'utilisateur.
  12. Sélectionnez Statistiques dans Expérimental Explorer, puis cliquez sur Calculer.
  13. Exportez les données vers un logiciel de gestion des données, puis analysez les données pour une signification en utilisant un one-wAnalyse de variance avec un post-test de Tukey et un test en T non apparié utilisant un logiciel de statistique préféré.

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Résultats

Un protocole de suivi visuel a été développé pour enregistrer la quantité de temps que les abeilles ménagères ont passées dans une zone cible avec un mélange de sucre-agarose (traitement de contrôle) ou de sucre-composé agarose-composé (traitement dissuasif). Le temps enregistré a été analysé à l'aide d'un programme logiciel statistique et le temps moyen passé ± erreur standard dans la zone cible est signalé comme un graphique à barres. DEET, l'étalon-or pour les essais anti-...

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Discussion

Ce protocole de suivi visuel offre une approche simple pour dissiper les dissolvants chimiques des abeilles de manière relativement simple et rapide. Il n'existe pas de protocoles recommandés pour les essais en laboratoire des dissolvants chimiques pour les abeilles. Des études antérieures et de plein champ ont examiné les répulsifs d'abeilles 14 , 15 ; Cependant, les protocoles décrits nécessitent beaucoup de temps, nécessitent beaucoup de main-d'œu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Thomas Kuhar pour l'utilisation du logiciel de suivi visuel et de l'équipement. Nous remercions James Wilson et Scott O'Neal pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fiole Erlenmeyer de 50 mLKimax26500-50utilisée pour la fabrication des cubes de sucre/agarose
SucreKrogertout produit similaire suffira à
l’eauacquise dans la maison
AgaroseApex20-102utilisée pour la fabrication des cubes de sucre/agarose
Moule pour cubes d’agarose (Weigh Boat)tout moule qui fournira au chercheur un cube de sucre/agarose de 1,5 cm x 1,5 cm x 0,3 cm suffira
EthoVision XTNolduslogiciel de suivi visuel
633 nm LEDCyronHTP904ECes lumières ont été placées dans une boîte à lumière construite pour éclairer les arènes par le bas. La boîte était une simple structure en bois avec un couvercle en plastique dépoli / verre plexi qui permettait à la lumière de se disperser vers le haut sans aucun éblouissement.
Ordinateur portable ou PCDellInspiron One 2305nécessaire pour le logiciel de suivi vidéo. Tout appareil PC capable de fonctionner avec un logiciel de suivi visuel suffira à Bee
Keeping vêtements de protectionDadant & Sons IncV0126n’importe quelle cagoule et veste de protection suffira
Outil de rucheDadant & Sons IncM00757utilisé pour ouvrir la ruche d’abeilles mellifères
Récipient pour abeillesmellifères tout récipient adapté à l’hébergement et au stockage des abeilles mellifères suffira
Pince poids plume pointe étroiteBioquip4748utilisé pour sélectionner des abeilles mellifères individuelles
9 cm (diamètre) Boîte de PétriFisher Scientific  ;S01778arène utilisée pour contenir des abeilles mellifères individuelles lors du suivi vidéo
Appareil d’enregistrement (Caméra)BasleracA-1300-60gmtout appareil capable d’enregistrer clairement le sujet et de transférer le fichier sur un ordinateur suffira
GraphPad PrismGraphpadn’importe quel logiciel statistique suffira
déminéralisée

Références

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