Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires<em&gt; In Vitro</em

Résumé

Ce travail détaille une méthode étape par étape pour préparer des extraits riches en polyphénols à partir de poudres de baies lyophilisées. En outre, il fournit une description détaillée de la façon d'utiliser ces extraits riches en polyphénols dans la culture cellulaire en présence de l'hormone peptidique angiotensine II (Ang II) à l'aide de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

Résumé

Des études épidémiologiques indiquent que l'augmentation de la consommation de flavonoïdes est en corrélation avec la diminution de la mortalité due aux maladies cardiovasculaires (ECV) aux États-Unis (États-Unis) et en Europe. Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont un contenu polyphénolique élevé. On a montré que les polyphénols interagissent avec de nombreuses cibles moléculaires et exercent de nombreuses fonctions biologiques positives, y compris les effets antioxydants, anti-inflammatoires et cardioprotecteurs. Les polyphénols isolés de la mûre (BL), de la framboise (RB) et de la framboise noire (BRB) réduisent le stress oxydatif et la sénescence cellulaire en réponse à l'angiotensine II (Ang II). Ce travail fournit une description détaillée du protocole utilisé pour préparer les extraits de polyphénols à partir de baies lyophilisées. Les extractions de polyphénols à partir de poudre de baies lyophilisées ont été réalisées en utilisant de l'éthanol aqueux à 80% et un procédé d'extraction assisté par ultrasons. L'extrait brut a été encore purifié et fractionné en utilisant du chloroforme et de l'acétate d'éthyle,respectivement. Les effets des extraits bruts et purifiés ont été testés sur des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) en culture.

Introduction

Les polyphénols sont des composés contenant au moins un anneau phénolique dans leur structure et sont abondamment présents dans le règne végétal ¹ . Les humains ont consommé des plantes pendant des millénaires à des fins médicales sans connaître l'existence de tels composés ² . Beaucoup de fruits et légumes ont des composés polyphénoliques partagés, bien qu'avec des quantités différentes, y compris les flavonoïdes, les stilbènes et les acides phénoliques ³ . Bien que les polyphénols soient souvent associés à des fruits et légumes colorés, cela n'est pas strictement vrai. Par exemple, ....

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Préparez 80% d'éthanol (100 mL) en mélangeant 80 mL d'éthanol absolu (biologie moléculaire) et 20 mL d'eau stérile de culture cellulaire.
2. Pour préparer l'extrait de polyphénol (10 mg / mL), pesez 10 mg de CE ou de PE. Ajouter 1 ml de milieu d'Eagle modifié Modifié Dulbecco (DMEM) sous un capot de culture cellulaire. Vortex la solution. Aliquote dans des portions de 200 μL et stockez à -20 ° C.
3. Préparer le tampon de lyse.
   1. Ajouter 5 ml d'une solution mère HEPES 1 M (pH 7,4, finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère NaCl 5 M (finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère EDT 0,5 ....

Résultats

On a déjà démontré que les extraits de polyphénols isolés de BL, RB et BRB réduisaient la sénescence des VSMC en réponse à Ang II ²¹ . Il a été démontré que ces extraits de polyphénols purifiés modulent la signalisation Ang II en réduisant la phosphorylation d'Akt, de la protéine Kinase Activée par Mitogen (MAPK) et de l'ERK1 / 2. BL empêche la sénescence en réduisant l'expression de la NADPH oxydase (Nox) 1, une enzyme qui produit des anions superoxyd.......

Discussion

Les polyphénols isolés des baies contiennent des compositions distinctes. Le protocole d'extraction à base d'éthanol décrit ici a permis d'identifier différents niveaux d'acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits de polyphénols bruts et purifiés de BL ( Tableau 1 ). CE a été enrichi en acide gallic, en acide ferulique, en acide 4-O-caffeoylquinique et en acide 5-O-caffeoylquinique. Le processus de purification n'a pas modifié de manière significative les niveaux.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Angiotensine II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Traitement des VSMCs
&bêta ;-actine	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Anticorps primaire (1:5000)
Mûre	Mercer Foods		Poudre de mûre lyophilisée
Catalase  ;	Calbiochem	219010	Anticorps primaire (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Préparation d’extraits de polyphénols purifiés
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM )	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture d’éthanol VSMC
(grade absolu de biologie moléculaire)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Préparation des extraits de polyphénols
Acétate d’éthyle	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Préparation d’extraits de polyphénols purifiés
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Anticorps primaire (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8,0	Teknova, Inc.	E0306	Tampon
lyse Lyophilisateur	Labconco	VirTis Benchtop K	Préparation d’extraits de polyphénols
Sérum de veau fœtal (FBS)	Seradigm	1400-500	Culture cellulaire
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Tampon de lyse  ;
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Tampon de lyse
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01  ;	Tampon de lyse
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Tampon de lyse
Na4P2O7 , décahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Tampon de lyse
phospho ERK1/2  ;	Technologie de signalisation cellulaire, Inc.	9101S	Anticorps primaire (1:1000)
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Tampon de lyse
Réactif de colorant pour dosage de protéines	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Mesure de la concentration en protéines
Membrane de transfert PVDF	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Évaporateur rotatif	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Préparation d’extraits de polyphénols
Eau stérile	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Préparation d’extraits de polyphénols
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Préparation d’extraits cellulaires
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Anticorps primaire (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 papier filtre	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Préparation des extraits de polyphénols

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