Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

Summary

Ce manuscrit détaille la fabrication de réseaux de neurones fabriqués par micro-tissus: des constructions tridimensionnelles de taille de micromètre composées de trajets axonaux longs alignés couvrant une ou plusieurs populations neuronales agrégées enfermées dans un hydrogel tubulaire. Ces échafaudages vivants peuvent servir de relais fonctionnels pour reconstruire ou moduler les circuits neuronaux ou comme bancs biofidéliques imitant la neuroanatomie de la matière grise et blanche.

Abstract

La récupération fonctionnelle se produit rarement après une dégénérescence due à une blessure ou à une dégénérescence induite par la maladie dans le système nerveux central (SNC) en raison de l'environnement inhibiteur et de la capacité limitée de neurogenèse. Nous développons une stratégie pour traiter simultanément la perte de voie neuronale et axonale dans le SNC endommagé. Ce manuscrit présente le protocole de fabrication pour les réseaux de neurones à micro tissage (micro-TENN), les constructions implantables constituées de neurones et de tracés axonaux alignés sur la lumière de la matrice extracellulaire (ECM) d'un cylindre d'hydrogel préformé de centaines de microns de diamètre pouvant s'étendre à des centimètres en longueur. Les agrégats neuronaux sont délimités aux extrêmes de l'encastrement tridimensionnel et sont recouverts de projections axonales. Les Micro-TENN sont uniquement conçus comme une stratégie pour la reconstruction du SNC, en imitant les aspects de la cytoarchitecture de connexion au cerveau et en fournissant potentiellement des moyens de remplacement du réseau. Le neuLes agrégats ronaux peuvent synapse avec le tissu hôte pour former de nouveaux relais fonctionnels pour restaurer et / ou moduler les circuits manquants ou endommagés. Ces constructions peuvent également constituer des «échafaudages vivants» pro-régénérables capables d'exploiter des mécanismes de développement pour la migration cellulaire et le suivi axonal, fournissant des indices synergiques structurels et solubles basés sur l'état de régénération. Les micro-TENN sont fabriqués en versant de l'hydrogel liquide dans un moule cylindrique contenant une aiguille centrée longitudinalement. Une fois que l'hydrogel a été gélifié, l'aiguille est retirée, laissant une micro-colonne creuse. Une solution ECM est ajoutée à la lumière pour fournir un environnement approprié pour l'adhérence neuronale et la croissance axonale. Les neurones dissociés sont agrégés mécaniquement pour l'ensemencement précis dans une ou les deux extrémités de la micro-colonne. Cette méthodologie produit de manière fiable des constructions miniatures autonome avec des tracés axonaux à longue projection qui peuvent récapituler les caractéristiques de la neuroanatomie du cerveau. Synaptic immLes indicateurs de calcium non colorés et codés génétiquement suggèrent que les micro-TENN possèdent une distribution synaptique étendue et une activité électrique intrinsèque. Par conséquent, les micro-TENN représentent une stratégie prometteuse pour la reconstruction neuro-chirurgicale ciblée des voies cérébrales et peuvent également être appliquées sous forme de modèles biofidéliques pour étudier les phénomènes neurobiologiques in vitro .

Introduction

Une caractéristique commune des troubles et des maladies du système nerveux central (SNC), comme une lésion cérébrale traumatique (TCE), une lésion de la moelle épinière (SCI), un accident vasculaire cérébral, une maladie d'Alzheimer et une maladie de Parkinson est la déconnexion des voies axonales et des cellules neuronales Perte ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Par exemple, lorsqu'un accident vasculaire ischémique n'est pas traité, on estime que les axones sont perdus à raison d....

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux à l'Université de Pennsylvanie et du Centre médical des affaires des anciens combattants de Michael J. Crescenz et ont adhéré aux lignes directrices énoncées dans la Politique du service de santé publique des NIH sur les soins et l'utilisation du laboratoire Animaux (2015).

1. Développement de l'hydrogel d'agarose (Composante acellulaire des micro-TENN)

1. Préparation de la solution d'agarose
   1. Dans un cabinet de prévention des risques biotechnologique....

Results

Les micro-TENN ont été surveillés à l'aide d'une microscopie à contraste de phase pour évaluer leur cytoarchitecture et leur croissance axonale ( Figure 4 ). Au sein de micro-TENNs unidirectionnels de 2 mm de long, les agrégats neuronaux étaient limités à une extrémité de la micro-colonne et prévoyaient un faisceau d'axones à travers le noyau interne. Les axones ont parcouru toute la longueur de la colonne pendant 5 jours in vitro (DIV) ( Figure 4A

Discussion

La lésion et la maladie du SNC entraînent généralement la perte ou le dysfonctionnement des voies axonales à longue distance qui comprennent le connecteur du cerveau, avec ou sans dégénérescence neuronale concomitante. Ceci est aggravé par la capacité limitée du SNC à favoriser la neurogénèse et la régénération. Malgré la poursuite de stratégies de réparation telles que le facteur de croissance, la cellule et la délivrance de biomatériaux comme approches individuelles ou combinatoires, ces techniques ne permettent pas s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Découpeuse laser	Universal Laser Systems	PLS4.75	Utilisé pour fabriquer le moule à micro-canaux découpé au laser.
Dispositif de fabrication de micro-colonnes découpé au laser	Sur mesure	--------------	Contactez notre groupe de recherche si vous êtes intéressé. Dimensions et plans fournis dans le manuscrit.
Vis	--------------	--------------	#4-40 avec un diamètre de filetage de 3,05 mm
Écrous	----------------------------		#4-40 avec un diamètre de filetage de 3,05 mm Aiguille d’acupuncture
(180 µ ; m diamètre)	Lhasa Medical	sj.16X40	Le diamètre peut varier en fonction de la taille souhaitée pour la lumière de la micro-colonne.
Boîte de Pétri	Fisher	08772B
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Pipette sérologique jetable en polystyrène	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Tube capillaire (398 µ ; m diamètre)	Fisher	21170D	Le diamètre peut être modifié en fonction de la taille souhaitée pour la coque de la micro-colonne.
Plaque chauffante	Fisher	SP88857200
Barre magnétique	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
Aiguille de calibre 25 mm	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Ciseaux	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Stérilisateur à billes chaudes	Sigma	Z378550-1EA
Stéréoscope	Nikon	SMZ800N	Utilisé pour toutes les étapes de dissection et pour la fabrication de micro-TENN.
Queue de rat de type I collagène	Corning	354236	Maintenir à 4 º ; C et ne retirer qu’en cas de besoin. Utilisez de la glace pour préserver sa température lors de l’utilisation.
Tube de microcentrifugation	Fisher	02-681-256
Laminine	de souris Corning	354232	Maintenir à 4 º ; C et ne retirer qu’en cas de besoin. Utilisez de la glace pour préserver sa température lors de l’utilisation.
Milieu neurobasal	Invitrogen	21103049	Milieu basal pour la culture de cellules neuronales prénatales et embryonnaires. Magasinez chez 4º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher	SS2661
Acide chlorhydrique (HCl)	Fisher	SA48-1
Papier tournesol	Fisher	09-876-18
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Conserver à 4 º ;C.
0,25 % Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056	Se conserve à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Désoxyribonucléase pancréatique bovine (DNase) I	Sigma	10104159001	Se conserver à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Supplément B-27	Invitrogen	12587010	Supplément ajouté au milieu neurobasal pour la culture des neurones de l’hippocampe et de la corticole. Conserver à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
L-glutamine  ;	Invitrogen	35050061	Store à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Sprague Dawley embryon jour 18 rats	Charles River	Souche 001
Pipette Pasteur	Fisher	22-042816
Tube à centrifuger de 15 mL	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifugeuse	Fisher	05-413-115
Hémocytomètre	Fisher	02-671-6
Objet30 Imprimante 3D	Stratasys  ;	--------------	Utilisé pour fabriquer les moules pyramidaux à micro-puits.
Moule à puits pyramidal imprimé en 3D	Sur mesure	--------------	Contactez notre groupe de recherche si vous êtes intéressé. Dimensions et plans fournis dans le manuscrit.
Polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissement	Fisher	NC9285739	Livré en kit avec élastomère et agent de durcissement. À utiliser à l’intérieur d’une hotte chimique.
Entonnoir	Fisher	10-348C
1 ml poire pipette	Sigma	Z509035
Micro-spatule	Fisher	S50821
Plaque de culture 12 puits	EMESCO	1194-353043
Four	Fisher	11-475-154
Incubateur	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Stocké à -80º ;C. Virus adéno-associé (AAV) disponible dans le commerce avec l’indicateur de calcium GCaMP6f.
Formaldéhyde 40 %	Fisher	F77P-4	Le formaldéhyde est un composé toxique connu pour être cancérigène et doit être éliminé dans un contenant séparé.
Triton X-100	Sigma	T8787	Tensioactif non ionique utilisé pour perméabiliser les membranes cellulaires.
Sérum de cheval	Gibco	16050-122
Souris anti-Tuj-1/bêta-III tubuline anticorps primaire	Sigma	T8578-200UL	Stocker à -20º ;C.
Anticorps primaire anti-synapsine 1 de lapin	Synaptic Systems	106-001	Stocker à -20º ;C.
Âne anti-souris 568 anticorps secondaire	Invitrogen	A10037	Stocker chez 4º ;C.
Âne anti-lapin 488 anticorps secondaire	Invitrogen	A21206	Stocker chez 4º ;C.
Hoechst 33342, Trichlorhydrate	Invitrogen	H3570	Magasinez chez 4º ;C.  ; Hoechst est un mutagène connu qui doit être traité comme cancérigène. Par conséquent, il doit être éliminé dans un récipient séparé.
Microscope confocal à balayage laser A1RSI  ;	Nikon	--------------	Utilisé pour prendre les reconstructions confocales de constructions immunomarquées.
Microscope Eclipse Ti-S  ;	Nikon	--------------	Utilisé pour prendre les images en contraste de phase.  ; Avec acquisition d’images numériques à l’aide d’un appareil photo QiClick interfacé avec le logiciel de recherche de base Nikon Elements (4.10.01).
Microscope à fluorescence haute vitesse	Microscope Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti associé à une caméra ANDOR Neo/Zyla pour l’imagerie calcique.
Logiciel NIS Elements AR 4.50.00	Nikon Instruments	--------------	Utilisé pour identifier les transitoires calciques à partir des enregistrements effectués avec le microscope à fluorescence à grande vitesse.  ;