Article de méthode

Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l'azote liquide

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DOI :

10.3791/55616

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6 avril 2017

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1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour congeler les tissus musculaires en les plongeant directement dans l'azote liquide. Ce protocole met également en évidence une nouvelle cryovial qui permet d'éviter « l'effet de couverture » de l'azote gazeux lorsque les contacts de l'azote liquide de la surface tissulaire d'un échantillon.

Résumé

Les études sur la physiologie des muscles squelettiques doivent relever le défi technique du traitement de façon appropriée les échantillons pour obtenir des sections avec des compartiments cytoplasmiques clairement visibles. Un autre obstacle est serré de l'apposition myofibres aux tissus environnants. Du fait que le processus de fixation de tissu et inclusion dans la paraffine conduit à la contraction des fibres musculaires, la congélation est un moyen optimal de durcissement des tissus musculaires pour le sectionnement. Cependant, un problème fréquemment rencontré, la formation de cristaux de glace, se produit lors de la préparation des coupes congelées en raison de la forte teneur en eau du muscle. Le protocole présenté ici d'abord décrit une méthode simple et efficace pour la congélation correctement les tissus musculaires en les plongeant dans de l'azote liquide. Le problème avec l'utilisation de l'azote liquide seul est qu'il provoque la formation d'une barrière de gaz d'azote à côté du tissu, qui agit comme un isolant et empêche le refroidissement des tissus. Pour éviter cet effet « couverture vapeur », un new cryovial a été conçu pour augmenter la vitesse d'écoulement du liquide autour de la surface du tissu. Ceci a été réalisé en découpant un total de 14 trous d'entrée dans la paroi du flacon. Selon la dynamique des bulles, un taux plus élevé de résultats d'écoulement de liquide en bulles plus petites et moins de chances de former une barrière contre les gaz. Lorsque l'azote liquide circule dans le tube cryogénique à travers les trous d'entrée, la vitesse d'écoulement à travers le tissu est suffisamment rapide pour éliminer la barrière de gaz. Par rapport à la méthode de congélation des tissus musculaires en utilisant isopentane prérefroidi, ce protocole est plus simple et plus efficace et peut être utilisé pour geler les muscles de façon débit. De plus, cette méthode est optimale pour les institutions qui n'ont pas accès à isopentane, qui est extrêmement inflammable à la température ambiante.

Introduction

Le muscle squelettique est le composant le plus précieux d'un animal producteur de viande du point de vue nutritionnel et de traitement. Dans l'industrie de la viande, il y a deux aspects particulièrement critiques: l'efficacité de la croissance musculaire et la qualité de la viande résultant. En tant que composant principal du muscle, les fibres musculaires sont directement liées à la performance de la croissance et la qualité de la viande fraîche chez les animaux 1. Par exemple, le nombre total de fibres (TNF) et la zone transversale des fibres (CSAF) déterminent principalement la masse musculaire et la qualité de la viande; En outre, le type de fibre Composition (FTC) affecte fortement la qualité de la viande fraîche 2. Par conséquent, la manipulation des caractéristiques de la fibre musculaire chez les animaux est une méthode très efficace pour augmenter la rentabilité de base et de la compétitivité des exploitations 1.

À ce jour, plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques ont été identifiés pour manipuler la fibre musculaire caractéristique etics 1. Cette manipulation peut être réalisé par la sélection ciblée des animaux avec des gènes spécifiques, tels que le gène de myostatine chez les bovins 3, le gène Callipyge chez le mouton 4, et les gènes RYR1 et IGF2 chez les porcs 5. En outre, le contrôle de l' alimentation et des traitements avec des hormones spécifiques jouent un rôle important dans les caractéristiques des fibres musculaires 6. Ainsi, une approche qui combine des facteurs génétiques et nutritionnels pourrait être en mesure d'améliorer la teneur en viande maigre et la qualité de la viande. Cependant, des études sur les fibres musculaires sont limitées dans l'industrie de la viande parce que l'élucidation de la structure des fibres musculaires est toujours un défi.

les propriétés des fibres musculaires sont identifiés en utilisant des procédés histochimiques, tels que le dosage de l'adénosine triphosphatase de myosine (ATPase). Cette méthode repose sur le fait que les enzymes situé dans des coupes congelées minces (6-8 pm) deles fibres musculaires peuvent être amenés à réagir chimiquement avec certains produits. Cependant, la teneur en eau des muscles est supérieure à 75% chez les porcs, les lapins, les souris et les humains, quelle que soit la position (c. -à- dos, l' abdomen, ou des membres postérieurs) 7. Un tel taux d'humidité élevé dans les muscles provoque un problème fréquemment rencontré - artefacts de congélation - lors de la préparation de coupes cryogéniques, comme décrit précédemment 8, 9. Dans la plupart des cas, il est presque impossible de geler de façon appropriée les tissus musculaires dans une ligne de production d'abattoir, selon notre expérience.

Le protocole présenté ici décrit une méthode simple et efficace utilisé dans notre laboratoire pour geler les tissus musculaires pour cryosectioning de manière à haut débit. Le point culminant de cette méthode est une nouvelle cryovial qui est conçu pour les tissus musculaires surgélation dans l'azote liquide. Le flux de travail peut faciliter en même temps que le tissucongélation et de traitement pour un excellent cryosection musculaire, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et l'apposition serré de fibres musculaires au tissu environnant. De plus, ce protocole peut être appliqué à un large éventail d'options pour l'analyse des tissus parce que l'azote liquide ne se mélange pas avec les tissus.

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Protocole

La méthode actuelle a été établi et validé pour récolter et stocker plus de 1000 échantillons de muscles pour la coloration histologique dans notre laboratoire. Toutes les procédures impliquant les soins des animaux et l'utilisation ont suivi les lignes directrices établies par le ministère de l'Agriculture de la Chine.

1. L'équipement pour le prélèvement d'échantillons

  1. L'identité de l'étiquette échantillon sur chaque flacon cryogénique.
    Remarque: Le flacon cryogénique est spécialement conçu pour congeler des échantillons de tissus frais pour la procédure de cryosection (Figure 1A). Les flacons sont faits de polypropylène dans une usine de moule (Figure 1C).
  2. Obtenir les équipements suivants: azote liquide dans un réservoir d'azote liquide approprié, des lunettes de sécurité ou un écran facial, des gants de congélation, une pince de 10 cm, 25 une pince à épiler cm, un refroidisseur de mousse de polystyrène (dimensions intérieures: 20 cm de longueur x 12 cm de largeur x 13,5 cm de hauteur ; dimensions extérieures: 24 cm de long x 16 cm de largeur x 15 cm de haut), film de matière plastique (2,5 cm long x 0,8 cm de largeur x épaisseur 0,1 mm),un scalpel, et A4 couvercles de liaison en PVC (21 cm x 29,5 cm) (figure 1B).

2. Préparation des échantillons musculaires

  1. Remplir le refroidisseur de mousse de polystyrène avec de l'azote liquide 5 min avant la collecte des échantillons.
    REMARQUE: La grande colonne d'azote liquide est essentielle parce qu'une partie de l'azote liquide se résume loin et se transforme en gaz lorsque toucher des échantillons frais il. Afin de réduire la fréquence de transfert de l'azote liquide pour reconstituer la perte, un refroidisseur en polystyrène de taille appropriée doit être acquise à l'avance en fonction du nombre d'échantillons.
  2. Une fois qu'un échantillon est obtenu, placer délicatement sur une feuille de couverture de liaison A4 PVC et d'observer la direction des fibres musculaires.
    REMARQUE: Ici, nous avons utilisé la section du muscle long dorsal doris de la première à la dernière vertèbre lombaire chez le porc. Les échantillons sont environ 12 cm de long, 8 cm de large et 5 cm de haut.
  3. Utilisez un scalpel pour réaliser deux incisions parallèles à travers l'échantillon in la direction des fibres musculaires, à environ 3 cm de longueur et 0,6 cm de distance. Coupez le muscle incisés dans un rectangle d'environ 0,6 cm de large x 0,6 cm de hauteur x 1,5 cm de long.
    REMARQUE: La fiabilité de la mesure de la surface de section transversale des fibres musculaires dépend essentiellement de l'orientation des fibres du muscle incisé.
  4. Utiliser des pinces 10 cm de mettre doucement l'échantillon sur un morceau de film plastique, avec l'axe longitudinal du muscle incisé parallèle au bord long de la feuille (figure 2A).
    REMARQUE: le film en matière plastique a deux fonctions: une fonction de maintien qui aide à fixer l'orientation des fibres musculaires et d'une fonction d'adhérence qui empêche des fissures dans l'échantillon due à la congélation rapide.
  5. En utilisant des pinces, placer le tissu musculaire dans le milieu inférieur d'un flacon cryogénique marqué, juste entre les trous d'entrée, puis fermer hermétiquement le flacon (figure 2B).

3. congélation et stockage d'échantillon de muscles

  1. En utilisant des pinces 25 cm, plonger rapidement l'ensemble du flacon cryogénique dans l'azote liquide dans le refroidisseur en polystyrène pré-refroidi, dans l'attente jusqu'à ce que l'azote liquide ne bout pas (environ 10 à 20 s).
    NOTE: Le cryovial flottera lorsque l'azote liquide est en ébullition, donc plonger soigneusement le flacon dans l'azote liquide bouillant pendant 10-20 s.
  2. Transférer les échantillons de muscles à un réservoir de stockage d'azote liquide ou d'un congélateur à -80 ° C pour le stockage à long terme.

4. Préparation Diapo

  1. Pré-refroidir un cryostat à -20 ° C et -22 ° C.
  2. Enlever et jeter le vieux lame microtome, essuyer le porte-couteau et la plaque anti-roulis dans le cryostat, installer une nouvelle lame microtome dans le cryostat, et régler l'épaisseur de coupe de 8 um.
  3. Transférer l'échantillon de muscle dans le flacon cryogénique du réservoir de stockage d'azote liquide ou -80 ° C congélateur au cryostat, le transporter dans de l'azote liquide ou de la glace sèche.
  4. Attendre 30 min pour l'échantillon à équilibrer la température du cryostat.
    NOTE: Tout équipement qui pourrait toucher l'échantillon doit être pré-refroidi, car une température élevée peut provoquer la formation de cristaux de glace dans l'échantillon.
  5. Monter l'échantillon dans le porte-échantillon en vertu de la formulation de température de coupe optimale des glycols et des résines solubles dans l'eau (OCT). Couper des sections de 8 um.
    REMARQUE: Réglage de l'angle de coupe perpendiculairement à l'orientation des fibres musculaires, parce que la CSAF est la surface en coupe transversale des fibres musculaires.
  6. Monter les sections vers le centre d'une microplaque à température ambiante. Placer immédiatement la lame dans une zone de glissement dans un congélateur à -80 ° C. Ne pas laisser la lame sécher à la température ambiante.

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Résultats

L'illustration cryovial et l'équipement de laboratoire commun pour la congélation des muscles lors de la préparation des coupes congelées sont présentés à la figure 1. Les cryotubes sont en polypropylène dans une fabrique de moule. Chaque flacon a un total de 14 trous d'entrée: celui-ci est sur le capuchon; un autre est en bas; et les 12 forment quatre lignes parallèles restantes, chacune avec quatre trous à 90 ° l'un de l'autre. Ces trous d'entré...

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Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle cryovial plusieurs trous pour la congélation et le stockage de tissus musculaires pour effectuer des évaluations histologiques de la fonction musculaire. L'étape critique dans la modification de ce protocole est que l'échantillon dans le tube cryogénique à trous multiples est immergé directement dans de l'azote liquide. À notre connaissance, c'est la façon la plus simple et rapidest pour obtenir d'excellents échantillons congelés pour cryosectioning musculaire parmi le...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêts, financiers ou autres, sont déclarés par les auteurs.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC): 31301950 et 31671288.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microtome cryostat  ; Leica Leica CM1950
Nikon,Nikon DS-U3
  ; Flacon cryogénique   ; FilmConçu par nous-mêmes
Azote
Commomly
Pince de 10 cm Pinceutilisée par Commomly
Verre
de sécurité
de congélation utilisés par CommomlyUtilisé en commun
Microscope numérique plastique liquide Scalpel utilisé par de 25 cm Gants

Références

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Mots-clés

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