Article de méthode

L'analyse des rétinoïque induite par l'acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

DOI :

10.3791/55621

⸱

22 avril 2017

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1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Souris des cellules souches embryonnaires (CSE) isolées de la masse interne du blastocyste (typiquement à E3.5 jour), peut être utilisé comme système modèle in vitro pour étudier le développement embryonnaire précoce. En l'absence de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), CES différencient par défaut dans les cellules précurseurs neurales. Ils peuvent être amassés dans un agrégat sphérique en trois dimensions (3D) appelé corps embryoïdes (EB) en raison de sa similitude avec l'embryon à un stade précoce. EB peuvent être ensemencées sur des lamelles revêtues de fibronectine, où ils se détendent en cultivant deux extensions dimensions (2D), ou implantés dans des matrices de collagène 3D où ils continuent de plus en plus sous forme de sphéroïdes, et se différencient en trois couches germinales: endodermique, mésodermique et ectodermique. La culture de collagène 3D imite l'environnement in vivo plus près que la 2D SRU. La culture 2D EB facilite l'analyse par immunofluorescence et immunoblot pour suivre la différenciation. Nous avons développé une differentia neuronale en deux étapesProtocole de tion. Dans la première étape, EBS sont générées par la technique de la goutte suspendue, et, simultanément, sont induites à se différencier par l'exposition à l'acide rétinoïque (RA). Dans la seconde étape, le produit de différenciation de neurones dans un format 2D ou 3D, en l'absence de RA.

Introduction

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Proviennent de la CES masse cellulaire interne blastocyste. Ces cellules sont pluripotentes, à savoir qu'ils ont la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule de l'organisme d'origine. ESC différenciation in vitro est d' un grand intérêt en tant que système expérimental pour étudier les voies de développement et les mécanismes. Il offre un système de modèle puissant et flexible pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la correction du dysfonctionnement des cellules et des tissus. Récapitulent de nombreux aspects EBs de la différenciation cellulaire au cours de l'embryogenèse précoce. En partic....

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Protocole

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1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris (FAE)

  1. Préparer le milieu MEF, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, à haute glucose), supplémenté avec 15% de sérum de fœtus bovin (FBS).
  2. Manteau de 100 mm des boîtes de culture cellulaire avec une solution de gélatine à 0,5% pendant 30 min à température ambiante (RT).
  3. Count en utilisant un cytomètre FAE. Retirer la solution de gélatine et verser immédiatement milieu MEF pré-chauffé à 37 ° C. Décongeler rapidement des flacons de mitomycine C-MEF traitée dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 min, puis ensemencer 2,8 x 10 6 par MEF 100 mm plat revêtues de gélati....

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Résultats

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Oct4, Nanog, et SOX2 sont les facteurs de transcription de base qui confèrent ESC auto-renouvellement et la pluripotence. Nous avons appliqué le protocole ci - dessus pour comparer la différenciation neuronale des CES de type sauvage et d'une souche de souris génétiquement modifiées où Syx, un gène codant pour le facteur d'échange spécifique de RhoA Syx, est perturbé. Nous avions impliqués dans l' angiogenèse Syx 18. Nous avons remarqué des différences da.......

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Discussion

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Dans ce protocole, nous présentons une méthode relativement simple et accessible pour étudier la différenciation neuronale des souris CES. Dans les protocoles précédents, RA a été ajouté au milieu au jour 2 ou 4 jours de la tenture-drop EB 8 ou par culture en suspension 7, respectivement, ou immédiatement après l'agrégation goutte suspendue EB 21. Dans le protocole que nous avons conçu, RA a été ajouté plus tôt. En dépit de la première introduct.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts concurrents ou financiers

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par subvention du NIH R01 HL119984 AH

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Materials
MEFsEMD MilliporePMEF-CFESC Couche nourricière
ESCEMD MilliporeCMTI-2
Boîte de culture cellulaire (60 mm)Eppendorf30701119Culture cellulaire
Boîte de culture cellulaire (100 mm)Falcon353003Culture cellulaire
Boîte de Pétri (100 mm)Corning351029Gouttes suspendues
Plaque 24 puitsGreiner Bio-One6621602D EBs
Plaque 6 puitsEppendorf30720113Transfection
Dark Tube à centrifuger de 1,5 mLCelltreat Scientific Products229437Solution mère RA
Verre de couverture de microscopeFisherbrand12-545-80Circulaire, 12 mm de diamètre
Lames de microscope Superfrost-plusFisherbrand12-550-15
Kit de culture de collagène 3DEMD MilliporeECM675Culture 3D
Effectene Transfection ReagentQiagen301427Transfection de cellules souches
Microcon  ; Filtres centrifuges (10 kDa)EMD MilliporeMRCPRT010Concentration en protéines
Nom  ; CompanyNuméro de catalogueComments
Reagents
DMEMLonza12-709FMEFs culture
IMDMGibco12440-046ESCs culture
Sérum fœtal bovin (FBS)EMD MilliporeES-009-BESCs culture
GélatineSigma-AldrichG2625Revêtement parabole
LIFR& D Systems8878-LF-025Pour maintenir la pluripotence de l’ESC
MEM Solutions d’acides aminés non essentielsGibco11140050Culture cellulaire
2-MercaptoéthanolGibco21985023Culture cellulaire
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122Culture cellulaire
GentamicineGibco15750060Culture cellulaire
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022Culture cellulaire
0,25 % Trypsine-EDTAGibco25200-072Culture cellulaire
DMSOSigma-AldrichD2650
Acide tout-trans-rétinoïqueSigma-AldrichR2625-50MGInduction de la différenciation neurale
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA7030-50GBlocage et dilution des anticorps  ;
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100MLPerméabilisation de la membrane cellulaire
Passoire cellulaireCorning352360
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPILife Tech.P36931Réactif d’enrobage
16 % Paraformaldéhyde  ;Microscopie électronique Sciences15710Fixation cellulaire
FibronectineR& D Systems1030-FNRevêtement parabolique
PBSGibco10010049
Collagénase type IWorthington Biochem. CorpLS004196dissociation
EBName  ; CompanyNuméro de catalogue>Comments
Anticorps primaires
Nestin (Rat-401)Santa Cruz Biotechsc-33677Détection de la différenciation neuronale
Oct4Santa Cruz Biotechsc-5279Détection de différenciation neuronale
NanogBethyl LaboratoriesA300-398ADétection de la différenciation neurale
Sox2Signalisation cellulaire3579Détection de la différenciation neurale
Tubuline b3 (AA10)Santa Cruz Biotechsc-80016Détection de la différenciation neurale
Name  ; CompanyNuméro de catalogueComments
>Anticorps secondaires
Donkey anti-Mouse-Alexa555Life Tech.A31570Immunofluorescence
Âne anti-souris-Alexa488  ;Technologie de la vie.A21202Immunofluorescence
Nom  ; EntrepriseNuméro de catalogueComments
Instruments
Microscope à grand champNikonEclipse TS100Imagerie par culture cellulaire
Microscope confocalNikonC2Imagerie par immunofluorescence

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromis....

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Mots-clés

Diff renciation par l acide r tino queformation de corps embryo destechnique de la goutte suspendueculture 2D et 3Dpolym risation de gel de collag neanalyse par immunofluorescenceanalyse de la s cr tion prot iqueexpression de la nestine

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