LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

Summary

Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction de répulsion électrostatique chromatographie hydrophile-tandem procédé (LERLIC-MS / MS). Ceci est une nouvelle méthodologie qui permet pour la première quantification et la caractérisation des temps glutamine et l'asparagine isoformes désamidation par protéomiques de fusil de chasse.

Abstract

Caractérisation des désamidation des protéines est impératif de déchiffrer le rôle (s) et les potentialités de cette modification post-traductionnelle de protéines (PTM) en pathologie humaine et d'autres contextes biochimiques. Afin d'effectuer la caractérisation des protéines désamidation, nous avons récemment développé une nouvelle spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction répulsion hydrophile électrostatique chromatographie en tandem méthode (LERLIC-MS / MS) qui peut séparer la glutamine (Gln) et isoforme asparagine (Asn) produits de désamidation de composés modèles à des échantillons biologiques complexes. LERLIC-MS / MS est, par conséquent, la première stratégie protéomiques de fusil de chasse pour la séparation et la quantification des isoformes de Gln désamidation. Nous démontrons aussi, comme une nouveauté, que le protocole de traitement de l'échantillon décrit ici stabilise l'intermédiaire permettant sa caractérisation succinimide par LERLIC-MS / MS. Application de LERLIC-MS / MS comme indiqué dans cet article vidéo peut aider à élucider le moment Unknown matrices moléculaires de désamidation des protéines. De plus, LERLIC-MS / MS fournit une meilleure compréhension des réactions enzymatiques qui englobent désamidation dans les milieux biologiques distincts.

Introduction

Désamidation est une modification post - traductionnelle des protéines (PTM) qui introduit une charge négative sur le squelette de la protéine par modification de l' asparagine (Asn) et / ou de la glutamine (Gln) les résidus ^1. Cette modification tout en affectant des résidus Asn génère les produits isomères d' acide isoaspartique (isoAsp) et l' acide aspartique (Asp) à un 3 commun: rapport 1 ^2. Néanmoins, ce rapport peut être modifié par l'intervention de l'enzyme de réparation L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) ^{3, 4.} De même, la désamid....

Protocol

1. Emballage Fanion-échange de grande longueur (LAX) Colonne Capillaire

(Note: Bien que la colonne LAX peut être emballé à domicile que nous décrivons dans ce protocole, les colonnes LAX sont disponibles dans le commerce, voir également le tableau des matériaux et des réactifs pour plus de détails).

1. Suspension de 50 mg de matériau de garnissage échangeur d'anions faible dans 3,5 ml de tampon d' emballage (tableau 1) pour préparer la suspension.
2. Assembler l'extrémité de la colonne capillaire (longueur 50 cm - tube 200 um de diamètre intéri....

Results

La désamidation de résidus Gln et Asn est considérée comme une modification de la protéine dégénérative (DPM) impliqués dans plusieurs maladies chroniques et mortelles ^14. Il a été démontré que cette PTM peut prédire les états demi-vie et d'anticorps et de dégradation d' autres molécules dans le corps humain et milieux biologiques similaires ^{1, 15.} L'importance de désamidation des protéines, en fait, va au.......

Discussion

Dans cette vidéo-article , nous présentons un protocole étape par étape de LERLIC-MS / MS ^3, un procédé pour effectuer une caractérisation en profondeur et de déterminer avec précision l'étendue de la désamidation de la protéine et des procédés enzymatiques impliquées sur cette modification de la protéine. LERLIC-MS / MS est basée sur l'utilisation d'une longue longueur (50 cm) LAX selon le principe de chromatographie d'interaction de répulsion électrostatique hydrophile (Erlic) <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 et micro ; m 100-& Aring ; (matériau en vrac)	PolyLC Inc.	Commande
Colonne capillaire échangeuse d’ions longue longueur 50 cm - 200 & micro ; m ID	PolyLC Inc.	Commande
Tube PEEKsil 1/16" OD x 200 & micro ; m ID x 50 cm de longueur	SGE Analytical Science sous Trajan Scientific Australia  ;	620050
Raccord femelle à femelle pour tube 1/16" OD	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Écrou femelle pour microférule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microférule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Bombe à pression NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC système	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Tubes à verrouillage sûr	Eppendorf  ;	T9661-1000EA
Perles en acier inoxydable. 0,9 &ndash ; 2,0 mm. 1 lb Non stérile.	Next Advance	SSB14B
Centrifugeuse de table  ;	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Bain de circulation numérique chauffé standard, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 cartouche de dessalage 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm concentrateur	Eppendorf  ;		Concentrateur Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC  ;	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC  ;
Spectromètre de masse Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray  ;	Michrom-Bruker Inc.	Incubateur TCSI-SS2
INCUCELL  ;	MMM Groupe	INCUCELL111
Trypsine modifiée de qualité séquençage	Promega	V5111
Comprimés cocktail inhibiteurs de protéase	Roche	11836170001 (ROCHE)
Solution tampon de phosphate 10x (diluée à 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich	A1542
Désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacétamide	Sigma-Aldrich	i6125
Acide formique	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Hydroxyde d’ammonium	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acétonitrile de qualité HPLC	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol Grade HPLC	Sigma-Aldrich	675431
Eau Grade HPLC	Sigma-Aldrich	14263