Dosages de retard de gel d&#39;agarose et de protéine-ARNt pour l&#39;analyse de la<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction

Résumé

Un protocole est présenté pour la production de l'ARNt (UUU) et l'analyse de l'ARNt (UUU) en complexe avec l'enzyme TcdA par des essais de retard de gel d'agarose.

Résumé

Nous démontrons des méthodes pour l'expression et la purification de l'ARNt (UUU) dans Escherichia coli et l'analyse par des essais de retard de gel de la liaison de l'ARNt (UUU) à TcdA, une N ⁶ -théonylcarbamoyladénosine (t ⁶ A) déshydratase, qui cyclise le thréonylcarbamoyle Chaîne latérale attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) des tRNAs à t ⁶ A cyclique (ct ⁶ A). La transcription du gène synthétique codant pour l'ARNt (UUU) est induite chez E. coli avec 1 mM de ß-D-1-thiogalactopyranoside isopropylique (IPTG) et les cellules contenant de l'ARNt sont récoltées 24 heures après l'induction. La fraction d'ARN est purifiée en utilisant la méthode d'extraction du phénol acide. L'ARNt pur est obtenu par une Chromatographie de filtration sur gel qui sépare efficacement les molécules d'ARNt de petite taille des plus grands acides nucléiques intacts ou fragmentés. Pour analyser la liaison TcdA à l'ARNt (UUU), TcdA est mélangé avec l'ARNt (UUU) et séparé sur un gel d'agarose natif à 4 ° C.L'ARNt libre (UUU) migre plus rapidement, tandis que les complexes TcdA-ARNt (UUU) subissent un retard de mobilité qui peut être observé lors de la coloration du gel. Nous démontrons que TcdA est une enzyme de liaison à l'ARNt (UUU). Ce test de retard de gel peut être utilisé pour étudier les mutants TcdA et les effets des additifs et d'autres protéines sur la liaison.

Introduction

Le test de retard de gel ¹ (également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité électrophorétique, EMSA) est une méthode électrophorétique conçue pour étudier et caractériser les interactions protéines-acides nucléiques. Il permet l'analyse de l'ADN protéique ainsi que des interactions protéine-ARN et, en particulier, des interactions entre les protéines de liaison à l'ARNt et à l'ARNt, en utilisant soit des composants purifiés, soit des mélanges complexes de protéines ( par exemple , des lysats cellulaires) ou des acides nucléiques ( p . Ex . ARNt Piscines). Nous avons appliqué des essais de retard de gel à l'étude de l'interaction entre l'ARNt purifié (UUU) et TcdA, une N ⁶ -théonylcarbamoyladenosine (t ⁶ A) déshydratase, qui cyclise la chaîne latérale de thréonylcarbamoyle attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) Des tRNAs à t ⁶ cyclique (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA est également connu sous le nom CsdL ^{3 ,}F "> 4. Le gène tcdA / csdL forme une grappe avec les gènes csdA et csdE ⁵ , qui codent pour la cysteine ​​desulfurase et l'accepteur de soufre du système de désulfinase de cysteine ​​sulfinase (CSD) et est nécessaire pour maintenir la fonction TcdA in vivo ³ .

La raison d'être des tests de retard de gel est que, bien que les molécules d'acide nucléique libres migrent rapidement vers l'avant de l'acrylamide ou des gels d'agarose en raison de leur grande charge négative, la mobilité électrophorétique des complexes de protéines des mêmes acides nucléiques est considérablement réduite. La réduction de la mobilité est visualisée comme un «décalage» dans les complexes acide nucléique-protéine, qui se résolvent sous forme de bandes discrètes. Un complexe de protéines d'acide nucléique et de charge positif et plus large montre un déplacement plus important ou une réduction de la mobilité sur un gel.

Puisque la neutralisation des charges du complexe est un phénomène universelPour les complexes protéine-acide nucléique, l'essai de retard de gel peut être appliqué à une large gamme de complexes et de types d'acides nucléiques. La méthode est simple, peu coûteuse et peut être effectuée dans des laboratoires avec un équipement minimum. Il ne nécessite que de petites quantités de protéines et d'ARNt. C'est un avantage par rapport à d'autres techniques biophysiques, qui habituellement consomment de plus grandes quantités d'échantillons.

Le test de retard de gel a été largement utilisé pour l'étude des facteurs de transcription. Le test a été utilisé pour analyser la cinétique de liaison, la force et la spécificité des facteurs de transcription pour de nombreuses séquences d'ADN différentes. C'est en effet dans ce domaine que l'EMSA a été développée pour la première fois ^{6 , 7} . Des essais de retard de gel avec des molécules d'ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} et tRNA ont également été utilisés dans la recherche sur les ribosomesEt d'analyser, comme nous le faisons ici, les enzymes qui modifient les nucléosides d'ARNt post-transcriptionnellement.

De nombreux paramètres différents affectent le résultat d'un essai de retard de gel tel que la température, la qualité de l'échantillon de protéines et d'ARNt et la force de la liaison. Une planification minutieuse et l'exécution de l'expérience est cruciale pour l'interprétation des résultats de l'acide nucléique et des espèces liées aux protéines. Ici, nous avons utilisé le gène synthétique codant pour l'ARNt (UUU) clone dans un vecteur d'expression dont le promoteur n'a pas le site de liaison au ribosome Shine-Dalgarno, ce qui conduit à la synthèse de grandes quantités d'ARNt ² . Ce protocole détaillé est destiné à fournir un guide clair pour effectuer des expériences de retard de gel d'ARNt tout en évitant les erreurs courantes.

Protocole

Attention: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et corrosifs. Utiliser les pratiques appropriées lors de l'extraction de l'ARNt à l'aide de phénol, y compris l'utilisation d'une hotte et d'un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées, etc. ). Ce protocole utilise une tache d'acide nucléique non toxique. L'utilisation d'autres taches peut nécessiter des précautions supplémentaires et une élimination spécialisée de l'agent de coloration si elles sont toxiques ou cancérogènes ( p . Ex ., Bromure d'éthidium).

1. Préparation du gel d'agarose

1. Peser 2 g d'agarose et l'ajouter à une bouteille en verre pour préparer un gel d'agarose à 2% p / v.
2. Ajouter 100 ml d'un tampon de liaison 1x-tris-borate-éthylènediaminetétracétique (EDTA) (TBE) à la bouteille contenant de l'agarose. Faire fondre par chauffage dans un micro-ondes. À intervalles de 30 s, tourbillonner le contenu pour mélangerBien et répétez cette étape jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Laisser refroidir la solution d'agarose à environ 50-60 ° C.
3. Tapez les bords ouverts d'un bac en gel pour créer un moule, placez un peigne approprié pour créer les puits et jeter l'agarose fondu dans celui-ci. Éviter la formation de bulles et laisser la solidifier à température ambiante.
4. Une fois solidifié, placer le bac en gel dans une unité d'électrophorèse et le remplir avec un tampon TBE jusqu'à ce que le gel soit complètement recouvert.

2. Préparation de l'ARNt

1. Express tRNA (UUU) à E. coli
   1. Dans la matinée, utiliser un flacon de E. coli BL21 congelé (DE3) transformé avec le vecteur d'expression pET23d-EcUUU ² (héberge le gène codant pour l'ARNt de E. coli (UUU)), pour obtenir un Luria Broth (LB) à faible teneur en sel, Plaque additionnée de 100 μg / ml d'ampicilline. Inverser la plaque et la placer dans un incubateur de 37 ° C jusqu'à ce que les colonies apparaissent (fin de l'après-midiOon).
   2. Inoculer une colonie unique cultivée dans 5 ml de LB plus 100 μg / mL d'ampicilline et faire pousser toute une nuit à 220 tr / min à 37 ° C.
   3. Le lendemain matin, granuler les cellules (6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C), remplacer le milieu par 5 mL de LB fraîche plus 100 μg / mL d'ampicilline et réusiner. Utilisez cette suspension pour inoculer 200 mL de LB plus 100 μg / mL d'ampicilline. Cultiver pendant 5 h à 220 tr / min à 37 ° C.
   4. Lorsque la densité optique de la culture à 590 nm (OD ₅₉₀ ) a atteint 0,6 - 0,8, ajouter 1 mM d'IPTG à la culture pour déclencher l'expression du gène de l'ARNt (UUU). Incuber à 37 ° C pendant 3 h.
   5. Récolte les cellules en centrifugant la culture à 6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
2. Lysis and extraction
   1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse de 5 ml (acétate de sodium 0,3 M, EDTA 10 mM). À partir de ce moment-là, utilisez des tampons autoclavés et gardez tous les échantillons contenant de l'ARNt à 4 ° C pour éviter que tDégradation de l'ARN.
   2. Ajouter 1 volume de phénol acide (pH 4,3) à la pastille de cellules ressuscité dans la hotte. Mélanger pendant 1 min par inversion pour lyser les cellules et centrifuger à 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Recueillir la phase aqueuse supérieure contenant l'ARNt soluble (UUU) (et des concentrations plus faibles des autres pools d'ARNt) en utilisant une pipette en prenant soin de ne pas aspirer la phase organique (inférieure). Jeter la couche inférieure et la pastille, qui consiste en la phase organique et les débris cellulaires, dans un récipient adéquat.
   4. Précipiter l'ARNt en mélangeant soigneusement la phase soluble (aqueuse) avec 2,5 volumes d'éthanol à 100% v / v par inversion pendant 1 h à 4 ° C. Centrifuger le mélange à 15 000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot riche en ARNt dans 4 ml de tampon de filtration sur gel (phosphate de sodium 20 mM ou phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Exécuter 5 μL du pool d'ARNt resuspendu sur un gel d'agarose à 2% p / v.
      REMARQUE:L'ARNt de bonne qualité apparaît comme une bande unique (taille moléculaire comprise entre 50 et 100 pb).
3. Purification de l'ARNt (UUU)
   1. En suivant la pratique chromatographique standard ¹² , charger l'ARNt ressuscité (UUU) sur une colonne de filtration sur gel préparative haute résolution (dimensions: 16 x 600 mm, volume du lit: 120 ml, plage de résolution: 1 000 à 70 000 Da) préalablement équilibrée dans un tampon de filtration sur gel (phase mobile). Réglez le débit à 1 mL / min pour éluer les échantillons.
      REMARQUE: Le sommet de l'ARNt (UUU) élue approximativement à 75,5 ml. Typiquement, on peut obtenir un rendement de 0,5-1,0 mg / L d'ARNt de culture.
   2. Analyser les échantillons à des volumes d'élution représentatifs par électrophorèse de 5 à 10 μl de chaque échantillon sur un gel d'agarose à 2% p / v.

3. Préparation de l'échantillon

1. Exprimer et purifier TcdA selon López-Estepa et al . ² .
   REMARQUE: jusqu'à 250 μMTcdA peut être utilisé pour l'étude.
2. Pipettez la quantité correspondante de TcdA selon le tableau 1 dans des tubes de centrifugation de 1,5 mL correctement étiquetés. Ajouter 1,6 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) (concentration finale) et mélanger doucement à l'aide d'une pipette. Fermer le couvercle et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
3. Ajouter 10 μM de triphosphate d'adénosine (ATP) et 50 mM de MgCl ₂ (concentrations finales). Mélanger avec une pipette et incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Ajouter l'ARNt purifié (UUU) (section 2.3) selon le tableau 1 , mélanger avec une pipette et incuber à température ambiante pendant 5 min.
5. Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à 100 μL de volume final. Mélanger correctement et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% v / v.
6. Vortez l'échantillon et essorez brièvement le contenu du tube (10 000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Développement de chargement de gel et d'électrophorèse

1. Placez l'unité d'électrophorèse dans un plateau rempli de glace écrasée pour maintenir la chambre à 4 ° C pendant l'opération d'électrophorèse.
2. Soigneusement, faites pipeter 5 μL de chaque échantillon dans le puits correspondant. Ajouter un marqueur de taille d'ADN approprié.
3. Branchez les électrodes dans les fentes correspondantes de l'unité d'alimentation. Allumez le bloc d'alimentation et réglez la tension à 100 V et faites fonctionner le gel pendant 90 min.

5. Coloration du gel pour observer l'interaction de l'ARNt-protéine

1. Préparer la solution de coloration en mélangeant 50 mL de TBE avec 1x d'une tache d'ADN appropriée. Évitez d'exposer la solution de coloration à la lumière du soleil en recouvrant le récipient de coloration avec du papier d'aluminium.
   NOTE: Les taches d'ADN sont habituellement stockées sous forme de 10 000 ou 20 000 fois de concentrés.
2. Après 90 minutes d'électrophorèse, retirez soigneusement le gel du bac et placez-le dans un récipient avec une solution de coloration. Placez-le sur un bascule à faible vitesse de basculement à la température ambianteUre pendant 30 min.
3. Retirez le gel d'agarose du récipient de coloration, tapez-le soigneusement sur un morceau de papier de cellulose ou de filtre pour enlever l'excès de liquide et placez-le directement sur un transilluminateur. Allumez la lumière UV pour visualiser les bandes contenant de l'ARNt. Prenez une photo du gel.
4. Coloration des protéines (facultatif).
   1. Jeter la solution de coloration à l'ADN en toute sécurité (selon les procédures de sécurité) et la remplacer par une solution de 50 ml de bleu brillant (CBB) de Coomassie. Placez le plateau sur un basculeur à température ambiante et tachez la nuit (> 12 h). Jeter la solution de coloration CBB et la remplacer par 50 ml de PBS pour éliminer l'excès de colorant. Déterminez pendant 1 h sur un rocker.
5. Visualisez les complexes d'ARNt contenant des protéines sous un transilluminateur léger et prenez des photos du gel pour comparer avec la photo de gel UV de l'ARNt.

Résultats

De grandes quantités d'ARNt (UUU) peuvent être obtenues en exprimant le gène de l'ARNt dans E. coli sous le contrôle d'un promoteur T7 inducible fort. L'ARNt exprimé (UUU) s'accumule dans le cytoplasme et est enrichi sur le pool d'ARNt naturellement abondants. Un procédé de purification en deux étapes consistant en une étape de capture / extraction et une étape de filtration / polissage sur gel a été utilisé pour obtenir l'ARNt EMSA. L'étape de ca...

Discussion

L'essai de retard de gel de protéine-ARNt d'agarose décrit ici peut être modifié de plusieurs manières. Tout d'abord, le pourcentage d'agarose dans le gel peut être réduit pour permettre la séparation et la visualisation des complexes protéine-ARNt significativement plus importants que ceux analysés ici (120 kDa). Deuxièmement, si la protéine cible est thermolabile, des précautions supplémentaires doivent être prises pour que la température soit maintenue en dessous de la température maximale acceptable ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
E. coli BL21(DE3)	Novagen	70235	DE3 contient de la polymérase T7 lors de l’induction de l’IPTG.
pET23d	Novagen	69748-3	pET23d confère une résistance à l’ampicilline ; Promoteur T7.
Bouillon LB, faible teneur en sel (bouillon Lennox L), granulé	Melford	GL1703	Le bouillon LB conventionnel, à haute teneur en sel, peut également être utilisé.
Ampicilline	Sigma-Aldrich	10419313
Agitateur (Thermostaté)	NBS	Excella E24  ;	N’importe quel incubateur à agitateur avec contrôle de la température peut être utilisé.
Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99 %	Acros Organics	BP1755
Acétate de sodium, anhydre, >99 %	Melford	B4017
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), sel disodique, >99 %	Acros Organics	AC327205000	Nocif en cas d’inhalation.
Centrifugeuse (réfrigérée)	Eppendorf	5430
Rotor de centrifugeuse (réfrigérée)	Eppendorf	5430/5430P
Centrifugeuse	Sorvall	RC5C
Rotor de centrifugeuse	Sorvall	SLA-3000
Solution phénolique, saturée de tampon de citrate 0,1 M, pH 4,3 ± ; 0,2	Sigma-Aldrich	P4682	Toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosive
Éthanol absolu pour analyse, 100 % v/v	Merck Millipore	100983
Phosphate de sodium dibasique dihydraté, Na2HPO4, >=99 %	Sigma-Aldrich	71643
Dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO4	Merck	48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  ;	GE Healthcare	28989333
Agarose	Melford	MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl)aminométhane HCl]	Melford	T1513
Acide borique	Melford	B0503
Micro-ondes	Haier	HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyéthyl)chlorhydrate de phosphine]	Sigma-Aldrich	C4706	Corrosif pour les métaux et la peau.
ATP [adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium hydraté], grade I, >=99 %	Sigma-Aldrich	A2383
Chlorure de magnésium (MgCl2), anhydre, >=98 %	Sigma-Aldrich	M8266
Chlorure de sodium (NaCl), >99 %	Fisher Bioreagents	BP358
Chlorure de potassium (KCl), >99 %	Melford	P0515
NZYDNA Ladder VI	NZYtech	MB8901
Bloc d’alimentation	Consort	EV261
Unité d’électrophorèse	Real Laboratory	RELSMINI10
Real Safe Coloration des acides nucléiques	Real Laboratory	RBMSAFE	20,000X stock UV
Transilluminator (G :Box/EF)	Syngene	2216498
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich	B0770
Rocker (Gyro-Rocker)	Stuart	SSL3
Mixer Vortex  ;	13214789		de la marque Fisher

Le lysogène