Article de méthode

Dissection du pancréas de souris pour faire une analyse histologique et profilage métabolique

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DOI :

10.3791/55647

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19 août 2017

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1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

Dans cet article

Résumé

Cet article vidéo fournit une démonstration détaillée des procédures requises pour réussir à éliminer le pancréas de souris par la technique pour faire une analyse histologique et profils métaboliques.

Résumé

Nous avons enquêté sur le facteur de transcription spécifique de pancréas, 1 a cre-recombinase ; sarcome de LOX-stop-lox-Kristen rat, glycine, acide aspartique au codon 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) souche de souris comme un modèle de cancer pancréatique humain. L’objectif de nos études actuelles est d’identifier de nouveaux biomarqueurs métaboliques de la progression du cancer du pancréas. Nous avons effectué des profils métaboliques d’urine, selles, sang et extraits de tissus du pancréas, ainsi que des analyses histologiques du pancréas à l’étape de la progression du cancer. Le pancréas de souris n’est pas un organe solid bien défini comme chez les humains, mais il s’agit plutôt d’un tissu mou diffusément distribué qui n’est pas facilement identifiable par des individus peu familiers avec l’anatomie interne de la souris ou par des individus qui ont peu ou aucune expérience en spectacle dissections de souris d’orgue. Le but de cet article est de fournir un détail lavage démonstration visuelle pour guider les novices dans l’élimination du pancréas de souris par la technique. Cet article devrait être particulièrement utile aux étudiants et aux chercheurs de nouvelles pour la recherche qui nécessite la récolte du pancréas de souris par la technique de profilage métabolique ou des analyses histologiques.

Introduction

La souris est devenue un important modèle animal du cancer pancréatique humain1,2. Dans le Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modèle murin, la Kristen oncogène de rat sarcoma (K-Ras) intervient exclusivement dans le pancréas, aboutissant à l’initiation des lésions précancéreuses dans le pancréas, appelés les néoplasies intraépithéliales pancréatiques (paninés), que les progrès pour les adénocarcinomes canalaires pancréatiques, communément appelé PDACs3. Ce système de modèle de souris offre l’un des meilleurs modèles animaux disponibles pour cancer pancréatique humain4,5, avec l’avantage supplémentaire que les paninés émergent dans les cinq premiers mois de la vie et souvent progrès à PDAC dans un seule l’année4,5, alors que le cancer du pancréas survient plus fréquemment chez l’homme 60-70 ans.

Extraction du pancréas par dissection de la Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + souris à divers âges permet un examen histologique détaillé longitudinal du développement du cancer du pancréas, allant dès les premiers stades de PanIN grâce à la progression à l’ACPE3,4 , 5. récolte du pancréas à des âges allant de cinq à quinze mois peut également servir à préparer les tissus extraits pour caractériser les changements globaux dans le métabolisme des4 pancréas qui se produisent pendant la transition de santé à des tissus malades 6,,7.

Cet article présente un guide visuel complet des étapes requises pour effectuer une extraction de pancréas de souris et fournit des lignes directrices pour le stockage d’un pancréas pour une analyse ultérieure. Ce guide sera également utile pour les personnes effectuant des recherches sur d’autres maladies du pancréas, y compris diabète de type I et devraient être particulièrement utiles aux étudiants et aux chercheurs de nouveau à la recherche impliquant la cueillette du pancréas de souris à l’aide dissection des profils métaboliques ou des analyses histologiques.

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Protocole

les procédures effectuées dans la vidéo et décrites ci-dessous ont été approuvés par l’utilisation Comité (IACUC) à l’Université de Miami et d’institutionnels animalier.

1. préparation et Test de stimulation

  1. établir deux zones distinctes pour l’intervention chirurgicale, la table d’opération et la table après l’opération. Scène de ces deux domaines avec tous les matériaux et tous les ustensiles nécessaires. Table
    1. stade d’exploitation sous une hotte ventilée. Organiser la table avec l’équipement d’une manière qui permet la performance continue et sans encombre de la procédure.
    2. Établit un tableau postopératoire dans la même pièce et près de la table principale de l’opération. Maintenir les deux tables comme des environnements stériles tout au long de la procédure.
  2. Place ce qui suit fournit sur la table d’opération : un bocal avec couvercle, un tube de 15 mL, une paire de ciseaux chirurgicaux, un flacon d’éthanol à 70 %, deux planches de mousse, deux pinces, deux seringues de 1 mL 21 jauge, deux tubes de 50 mL, tube à un centrifuger , un flacon cryogénique, quatre blocs chirurgicaux, dix quilles, un distributeur de lingettes stérilisants et un conteneur pour objets acérés.
  3. Placer les fournitures suivantes sur la table après l’opération : une balance analytique, une 4 L dewar d’azote liquide, un peu profond large bouche dewar, un rack de microtube flottante, une paire de ciseaux chirurgicaux, deux pinces, quatre flacons cryogéniques et un distributeur de lingettes stériles.
  4. Remplir un 50 mL et un tube de 15 mL à 75 % du volume de formaline.
  5. à l’aide d’une épingle dans chaque coin, apposer un tampon chirurgical à un panneau de mousse approximative de 30 cm x 30 cm pour servir le jury de la dissection. Utilisez les quatre broches restantes au cours de l’opération. Préparer un petit panneau de mousse avec un tampon de transférer les organes à la table après l’opération chirurgicale.
    ATTENTION : Isoflurane (99,9 %) est un produit chimique toxique et doit être utilisé dans une hotte de ventilation pour assurer le niveau maximal de sécurité de l’opération de nettoyage de déchets gaz anesthésique 8. Informations supplémentaires au sujet des risques à des chercheurs associés à l’utilisation de la méthode open-déplacer l’isoflurane peuvent être trouvées dans un article par Taylor et Mook 8.
  6. Placer un patin chirurgical dans le bocal en verre et de trempage avec quelques gouttes d’isoflurane (99,9 %) et placer une serviette en papier sur le dessus pour empêcher tout contact de la souris avec l’isoflurane. De même, utilisez un bloc chirurgical pour ligne le tube restant et laissez tremper avec quelques gouttes d’isoflurane et placez un coussin supplémentaire sur le dessus pour empêcher tout contact entre la souris et l’isoflurane.
  7. Pour l’azote liquide dans la bouche large peu profonde dewar jusqu’au repère de remplissage maximum est atteint.
    8. Chambre de
  8. Place la souris sélectionnée pour la dissection dans l’anesthésie, c'est-à-dire le bocal en verre avec un tampon imbibé de quelques gouttes d’isoflurane (99,9 %), couvert avec le couvercle, pendant environ 1 min.
    Remarque : Cette période varie de la souris à la souris. Une fois que la souris est inconsciente, retirez-la de la chambre et placez-la sur le Conseil d’exploitation.
  9. Orienter la souris de sorte qu’il est couché la face ventrale vers le haut et avec sa tête dirigé à l’opposé de la scientifique. Placez la tête à l’intérieur du tube, bordée d’un bloc chirurgical imbibé de quelques gouttes d’isoflurane (99,9 %) et effectuer un test de stimulation par une pincée de pied pour s’assurer que la souris ne répond pas aux stimuli.
    1. Si ce test échoue et que la souris répond pour le test du pincement pied, répétez l’étape 1.8.

2. Première Incision, perforation du coeur et l’euthanasie

  1. Pin les membres de la souris sur le panneau isolant chirurgicale et mouiller la partie ventrale de la souris avec l’éthanol à 70 %.
  2. Pincer la fourrure/peau près de l’ouverture urétrale avec une pince et tirez légèrement vers le haut. Faites une incision avec des ciseaux chirurgicaux dans la cavité abdominale à partir de l’ouverture urétrale, la ligne médiane et se termine à menton.
    1. Près le point de départ de l’incision initiale, prends un côté de la fourrure/peau avec la pince et produit une autre incision avec des ciseaux vers le bas et en diagonale vers la patte arrière.
    2. Répéter cela de la même manière sur le côté opposé.
      Remarque : La fourrure et la peau peut être épinglée pour créer une ouverture plus large, mais n’est pas nécessaire.
  3. Localiser le coeur et supprimer le péricarde, qui est le sac autour du coeur, pour éviter l’obstruction de l’aiguille de la seringue.
    1. Saisir le péricarde avec la pince et couper avec des ciseaux. Effectuer la ponction cardiaque en insérant avec précaution l’aiguille de la seringue dans le coeur battant et lentement commencer à rentrer le piston.
    2. Pour la collecte de sang optimale, utiliser le piston de l’aiguille afin d’imiter l’action de pompage du cœur et éviter de tirer trop vite.
      Remarque : En général environ 1 mL de sang peuvent être collecté.
    3. à l’issue de la collection de sang, dissiper le sang dans le tube à centrifuger et jeter la seringue dans le récipient de dièses.
    4. Après la ponction cardiaque est effectuée, procéder à l’euthanasie en enlevant les attaches reliant cœur.
      Remarque : L’héparine, un anticoagulant, n’a pas ajouté à la seringue dans cette procédure avant la ponction cardiaque pour permettre au sang de coaguler pour collection de sérum dans la présente étude spécifique. Toutefois, si le chercheur voulait empêcher la coagulation du sang afin de recueillir le plasma, héparine pourrait être ajouté à la seringue avant la ponction cardiaque.
  4. Si l’étude implique le génotypage de la souris, découper une partie de l’oreille avec les ciseaux et le placer dans un tube à centrifuger pour une vérification de génotype.

3. Extraction de pancréas

  1. localiser l’estomac sur le côté gauche de la souris. Commencez doucement (afin d’éviter les déchirures) séparant le pancréas de l’estomac et du duodénum à l’aide de deux pinces.
    Remarque : Lorsque le démontage du pancréas de l’estomac et des intestins, il est très important que les pinces servent doucement pour guider le tissu du pancréas loin des organes et à ne pas écraser ou déchirer le pancréas avec la pince.
    1. Continuent de diviser le pancréas provenant des sections jéjunum et iléon intestin grêle et enfin du caecum du gros intestin.
  2. Au caecum, repositionner la pince et continuer la séparation du pancréas le long du côlon restant vers le rectum.
    Remarque : À ce stade, il est facile à couper et enlever la portion de l’estomac à la région du côlon qui précède immédiatement le rectum.
  3. Localiser le pancréas et joint rate. Faites glisser le pancréas vers le côté droit de la souris. Séparez les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique par la pince à détacher complètement le pancréas et la rate attenante.
  4. Enlever le pancréas et étalez-le à l’examen. Laissez la rate attachée au pancréas pour fins d’identification. Tissu conjonctif
    1. Supprimer tous, tissus gras et mésentériques par le pancréas.
      Remarque : Ce tissu est plus blanc, en couleur et donc peut être aisément distingué des tissus du pancréas qui sont plus rose en couleur. Cela est particulièrement important si le pancréas entier doit être enlevé. Par exemple, si le pancréas doit être pesé et par rapport au poids corporel ou entre groupes d’animaux. Dans le Ptf1a cre / + ; LSL-Kras G12D / + modèle de souris, plus précisément dans les mois plus âgés, tissu pancréatique fibreux dur pourrait être présent. Dans ce cas, l’extraction soigneuse du pancréas doit être effectuée comme les intestins pourraient être entrelacées dans un tissu tumoral. Dans les cas avancés, rate anormale et le tissu hépatique peuvent également être présents.
  5. Si vous le souhaitez, supprimer des autres organes à ce stade.

4. collecte de données et stockage

  1. après l’extraction des organes, déplacer les échantillons dans la zone postopératoire pour préservation.
  2. Peser chaque organe et rangez-les dans leur flacon cryogénique respectif.
    Remarque : le long de with la masse de l’échantillon, d’irrégularités doivent être enregistrées pour référence ultérieure.
  3. Une fois que les organes sont pesés, placez-les dans l’azote liquide pour snap gel.
  4. Après le snap gel, stocker les organes à-80 ° C pour le stockage à long terme.
  5. Placer les échantillons de formol stocké sur le comptoir toute la nuit et le lendemain matin changer leur solution de formol à l’éthanol à 70 %.
    Remarque : Ces échantillons doivent être stockés à 4 ° C pour le stockage à long terme.
  6. Pour le stockage à long terme, figer le sang et l’oreille punch à-80 ° C.. Pour la collecte de sérum du sang, permettent au sang de coaguler pendant 30 min puis centrifuger à elle. Retirer la partie de sérum à l’aide d’une pipette et ensuite stocker à -80 ° C.

5. Clean Up

  1. désinfectez tous la dissection des outils avec les lingettes stérilisants. Capuchon du tube doublé avec l’isoflurane imbibé bloc chirurgical. Remplacer le plateau chirurgical sur le panneau isolant avec un coussin frais chirurgicaux. Éliminer les parties de la souris qui n’ont pas recueillis par la facilité de ' politique d’élimination des animaux s.

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Résultats

La figure 1 montre une vue d’ensemble de la zone d’environnement d’exploitation et la Figure 2 montre la zone de fonctionnement du poste. Bien que ce paramètre fournit la quantité minimale de matériel et mise en scène, les personnes peuvent choisir de modifier ceci pour mieux répondre à des besoins individuels. Le protocole doit être optimisé selon les besoins spécifiques de l’expérience. Cette procédure est menée d’une manière q...

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Discussion

Signification en ce qui concerne les méthodes existantes
Parmi les autres vidéos informels des dissections de souris, cet article vidéo fournit la première qualité professionnelle, des pairs, démonstration visuelle de toutes les étapes détaillées nécessaires pour l’extraction et la récolte du pancréas de souris par dissection10 . Avec le pancréas est un organe principal de l’activité métabolique et l’insuline production, la dissection et la récolte du pancréas permet la préserv...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

MAK reconnaît le soutien pour ce travail de la National Institutes of Health / Institut National du Cancer grant nombre - 1R15CA152985-01 a 1. Ce projet a également été soutenu par le programme de prix recherche Undergraduate Université Miami, les possibilités de doctorat-premier cycle Université de Miami pour le programme de bourses et le programme des boursiers Miami University Summer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bocal en verre  ;Corning3140-150Le bocal en verre utilisé dans la vidéo n’est plus fabriqué. Il s’agit de son remplaçant.
Couvercle du bocal en verreCorning9985-150Le couvercle du bocal en verre utilisé dans la vidéo a été abandonné.  ; Il s’agit de son remplaçant.
15 mL Falcon TubesFisher Scientific339650
Ciseaux chirurgicauxFisher Scientific9201
Flacon compressible  ;Fisher Scientific03-409-10DD
100 % ÉthanolFisher Scientific22-032-103
FormolFisher Scientific245-684
Planches en mousseTherapak562908
ForcepsFisher Scientific200205SHN
1 mL 21G SeringuesBD Biosciences309624
50 mL Falcon TubesScientific339652
2,0 mL Tubes à microcentrifuger  ;Fisher Scientific02-681-258
Coussinets chirurgicauxFisher ScientificS67011
Longueur des goupilles en T :  ; 2"  ;Advance Store ProductsX32T-05
Lingettes stérilisantesProfessional Disposables International Inc.Q85084
Conteneur pour objets tranchantsFisher Scientific14-827-122
Balance analytiqueMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Faible et large bouche DewarFisher ScientificF3087-V
Rack flottant à microtubesVWR60986-100
Fiole cryogénique de 1,2 mL, Isothésie stérileFisher Scientific10-500-25
(isoflurane)  ;Henry Schein Santé animale050033
Azote liquideWright BrothersNIT-60-XX
Souris Kras StrainThe Jackson LaboratoryOO8179
Souris Cre StrainMMRRCOOO435-UNC
Fisher

Références

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Mots-clés

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