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Article de méthode

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

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DOI :

10.3791/55688

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30 mai 2019

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1Beykoz Institute of Life Sciences and Biotechnology, Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey, 2School of Public Health and Tropical Medicine, Department of Tropical Medicine, Tulane University

Dans cet article

Résumé

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Résumé

Les progrès récents des technologies de la génétique et de la biologie des systèmes ont favorisé notre compréhension de la biologie des parasites du paludisme au niveau moléculaire. Cependant, les cibles efficaces des parasites du paludisme pour le développement de vaccins et de chimiothérapies sont encore limitées. Cela est dû en grande partie à l'indisponibilité de modèles d'infection in vivo pertinents et pratiques pour les espèces humaines de Plasmodium, notamment pour P. falciparum et P. vivax. Par conséquent, les espèces de paludisme de rongeur ont été intensivement employées comme modèles in vivo pratiques d'alternative pour le vaccin antipaludique, le ciblage de drogue, la réponse immunitaire, et les études fonctionnelles de caractérisation des gènes conservés de Plasmodiumspp. En effet, les modèles de paludisme des rongeurs se sont avérés inestimables, en particulier pour l'exploration de la transmission des moustiques et de la biologie du stade du foie, et étaient indispensables pour les études immunologiques. Cependant, il existe des divergences dans les méthodes utilisées pour évaluer les phénotypes des parasites transgéniques et sauvages de type asexué et sexuel au stade du sang. Des exemples de ces écarts sont le choix d'une infection intraveineuse contre intrapéritonéal des rongeurs avec des parasites de stade sanguin et l'évaluation de l'exflagellation masculine de gamète. Ici, nous détaillons les méthodes expérimentales normalisées pour évaluer les phénotypes des stades du sang asexué et sexuel chez les parasites transgéniques exprimant des espèces de parasites du paludisme de type journaliste ou sauvage. Nous détaillons également les méthodes d'évaluation des phénotypes des stades des moustiques parasites du paludisme (gamètes, ookinetes, oocystes et sporozoites) à l'intérieur des moustiques vecteurs d'anophèles. Ces méthodes sont détaillées et simplifiées ici pour les souches létales et non létales de P. berghei et P. yoelii, mais peuvent également être appliquées avec quelques ajustements aux espèces de paludisme p. chabaudi et P. vinckei rongeur.

Introduction

Les parasites du paludisme causent des centaines de millions d'infections à paludisme chez l'homme dans le monde, avec plus de 600 000 décès chaque année1. Les infections humaines sont causées par cinq espèces de parasites du paludisme, à savoir P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, et P. knowlesi. La plupart des décès cliniques du paludisme sont causés par P. falciparum en Afrique subsaharienne1. Une autre espèce humaine de parasite du paludisme qui provoque de nombreuses morbidités dans le monde en dehors de l'Afrique subsaharienne est P. vivax2. Les trois autres espèces sont toutes plus limitées géographiquement et causent des infections bénignes de paludisme, à l'exception du P. knowlesimortel3. L'indisponibilité de modèles d'infections in vivo non humains pertinents et pratiques a toujours été et constitue toujours un obstacle au développement de vaccins antipaludiques et de médicaments. Le ciblage antérieur des médicaments antipaludiques et les études métaboliques se sont largement appuyés sur des modèles de paludisme aviaire comme P. gallinaceum et P. lophurae, infectant les poulets et les canards, respectivement4. Par la suite, les espèces de paludisme de rongeur ont été graduellement introduites dans divers vaccins et études de ciblage de drogue comme modèles in vivo. Au fil des ans, les preuves de similitudes entre les interactions biologie et interaction hôte-parasite des stades du cycle de vie des modèles de paludisme des rongeurs avec les espèces humaines de paludisme se sont accumulées.

En particulier, les modèles de paludisme des rongeurs étaient extrêmement importants pour explorer et caractériser la biologie des stades de moustique et de pré-érythrocytique5. Cependant, il existe quatre espèces de rongeurs (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, et P. vinckei) qui ont des caractéristiques biologiques différentes, dont les plus notables sont dans les stades sanguins6. Les espèces de rongeurs sont différentes dans la synchronicité des stades sanguins, où les stades sanguins des souches de P. chabaudi et de P. vinckei sont pour la plupart synchrones, tandis que les stades sanguins de P. berghei et de P. yoelii ne sont pas6 , 7. Une autre différence notable est l'autodébisation des stades sanguins qui se produit dans certaines souches (par exemple, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, et P. vinckei lentum), tandis que l'infection sanguine d'autres les souches de la même espèce pourraient être mortelles si elles n'étaient pas traitées(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA et P. chabaudi AS). De plus, la souche P. yoelii 17X-NL et la souche P. berghei ANKA envahissent de préférence les réticulocytes8,9,10,11, bien que ces caractéristiques de P. les souches yoelii et P. berghei ne sont pas une exigence de croissance stricte12,13,14. Par conséquent, les souris sont traitées avec de la phénylhydrazine avant une infection par les stades sanguins de ces parasites pour augmenter la parasitemia et le gamocytemia nécessaires pour une infection par les moustiques pour la souche P. berghei ANKA et pour P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.

Des différences dans le développement des stades des moustiques existent également entre les différentes espèces de paludisme des rongeurs, les plus notables étant la température et le temps requis pour le développement optimal des stades des moustiques et la longueur de la sporozoite5,6, 20. Dans les stades pré-érythrocytiques des espèces de paludisme de rongeur, les différences incluent les espèces de rongeurs et la souche qui sont les plus sensibles à l'inoculation infectieuse de sporozoite, le nombre de sporozoites nécessaires pour l'inoculation dans une souche sensible de rongeur, le types de cellules de mammifères nécessaires pour les essais in vitro de développement de stade de foie, et le temps de terminer le développement de stade de foie5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

Malgré ces variations, les parasites du paludisme des rongeurs étaient les modèles favorables dès le début pour l'application d'approches génétiques inversées, parce qu'ils consommaient moins de temps et de ressources avec une forte probabilité de succès31. En fait, les modèles de paludisme des rongeurs étaient les meilleurs modèles, et dans de nombreux cas les seuls modèles, disponibles pendant de nombreuses années pour caractériser fonctionnellement les gènes exprimés dans les stades des moustiques et du foie.

À la lumière de la popularité et de l'agréabilité des approches génétiques inversées dans les modèles de paludisme des rongeurs, un certain nombre de méthodologies différentes ont été utilisées pour analyser les phénotypes des stades transgéniques du cycle de vie des parasites, en particulier les stades sanguins. Cependant, certaines de ces méthodes sont incohérentes; par exemple, comparer les infections de parasites au stade sanguin à la suite d'une injection ip (qui sont peut-être drainées aux ganglions lymphatiques péritonéaux et, à partir de là, peuvent entrer dans la circulation sanguine; par conséquent, les parasites injectés ne finissent pas également dans la circulation sanguine) , en comparant la transmission de moustiques de clones avec un nombre différent de transferts en série de stade sanguin ou de nombre G (qui pourrait affecter la gamcytogenèse32,33), ou en comparant les parasites transgéniques directement à la naïve de type sauvage (WT) parasites qui n'ont jamais été soumis à l'électroporation et à la sélection positive de drogue et aux diverses évaluations non normalisées de l'exflagellation masculine de gamète. Par conséquent, il est crucial de normaliser les protocoles qui sont simples à suivre pour l'analyse phénotypique de tout type de parasites transgéniques ou WT rongeur paludisme dans le sang et dans le moustique pour accueillir les variations biologiques du paludisme rongeur espèces parasites.

Ici, nous rendons compte d'un protocole expérimental normalisé et détaillé pour l'analyse phénotypique des stades du cycle de vie du sang et des moustiques des parasites transgéniques ou sauvages de Type P. yoelii et P. berghei. Ces protocoles s'appliquent également aux parasites P. chabaudi et P. vinckei.

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Protocole

Toutes les expériences animales décrites ici ont été menées selon les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Tulane et le comité d'éthique des animaux de l'Université Bezmialem Vakif. Tous les autres protocoles expérimentaux et l'utilisation de l'ADN recombinant ont été effectués selon les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité (BAC) de l'Université tulane.

1. Infection de souris par des parasites à stade sanguin pour l'analyse de la parasitemia et les essais d'infection par les moustiques

  1. Jour -3 : injection facultative de phénylhydrazine chez les souris récepteurs
    1. Injecter des souris rectifiées de sw ou de CD1 (souris qui seront utilisées pour l'infection par les moustiques et les tests d'infection par les moustiques) par voie intrapéritone (IP) avec 100 l de phénylhydrazine (50 mg de phénylhydrazine dans 5 ml de 1x saline tamponnée par phosphate (PBS)) à l'aide d'une aiguille de 26 G(m) seringue.
      REMARQUE: Pour les infections à moustiques robustes de P. berghei et P. yoelii, la phénylhydrazine est utilisée pour induire la réticulocytose chez les souris récepteurs, ce qui augmente la parasitemia et, par la suite, le pourcentage de gamocytes, et de manière significative augmente l'exflagellation des gamètes mâles (Figure 5), ce qui conduira à une meilleure infection des stades des moustiques pour les souches de P. berghei et De P. yoelii 15,16,17, 18.
  2. Jour -2 : injection de stocks de parasites congelés dans des souris donneuses
    1. Décongelez rapidement les stocks congelés cryoconservés et injectez immédiatement à chaque souris donneuse (généralement deux souris par génotype) une propriété intellectuelle de 200 l'aide d'une seringue à aiguilles de 26 G.
      REMARQUE: Pas plus de cinq souris sont logées par cage dans des environnements contrôlés de vivarium.
    2. Commencez à vérifier parasitemia sous un objectif de microscope 100x sur Giemsa-taché frottis de sang mince après 24 h postinfection. Suivez la section 2.1 du protocole pour les frottis de sang minces tachés de Giemsa.
      REMARQUE: En raison de l'incapacité de compter précisément les stades de sang viables survivants après la décongélation rapide et l'injection de sang infecté cryoconservé, les souris donneuses reçoivent d'abord le sang cryoconservé. Les érythrocytes infectés de la souris donneuse peuvent être quantifiés avec précision et utilisés par la suite.
  3. Jour 0: saignement des souris donneuses
    1. Saigner les souris donneuses (voir la section 3.1) lorsque leur parasitemia se situe entre 0,1 % et 1 %, ce qui est habituellement obtenu 2 à 3 jours après l'infection par les stocks congelés dans le cas des souches P. yoelii 17X-NL et P. berghei ANKA.
    2. Utilisez la ponction de veine faciale (pour obtenir entre 200 et 500 L), ou saigner les animaux en phase terminale par ponction cardiaque (pour obtenir entre 600 l et 1,2 ml) de sang infecté. Saignement terminal des souris par ponction cardiaque tel que décrit en détail dans la section 3.1.
      REMARQUE: Le saignement de veine faciale n'est pas une méthode courante d'obtenir le sang car il est beaucoup plus difficile à appliquer et est très pénible aux souris, comparéau au saignement terminal. La parasitemia optimale pour le saignement des souris donneuses est entre 0,1%-1% parce que, à cette gamme parasitemia, il y a très peu de gamétocytes (qui ne peuvent pas se répliquer pour produire des stades de sang asexué) et il y a moins d'érythrocytes double ou triple-infectés (qui rend la quantification moins précise).
  4. Jour 0 : quantification du sang infecté pour préparer des doses d'érythrocytes infectés par dilutions en série
    1. Préparer des dilutions en série du sang des donneurs en ajoutant 100 l l de sang à un tube de microcentrifuge (tube de dilution 1). Ajouter 900 l de RPMI moyen à tube 1 et bien mélanger en pipetting de haut en bas avec la même pointe de pipette, créant une dilution 1:10.
    2. Prenez 100 l de sang dilué du tube 1 et ajoutez-le à un nouveau tube de microcentrifuge (tube de dilution 2). Ajouter 900 l de RPMI moyen à tube 2 et bien mélanger en pipetting de haut en bas avec la même pointe de pipette, créant une dilution 1:100.
    3. Répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2 pour faire deux dilutions en série plus, créant 1:1,000 (tube de dilution 3) et 1:10,000 dilutions (tube de dilution 4).
    4. Ajouter 12 ll de sang dilué du tube 3 et 12 l de sang dilué du tube 4 aux différents côtés d'un hémocytomètre et déterminer le nombre moyen d'érythrocytes de chaque côté de l'hémocytomètre. Multipliez ces nombres par 10. Multipliez ces nombres par le facteur de dilution, 1 000 ou 10 000, respectivement, pour déterminer le nombre d'érythrocytes dans 1 oL de chaque dilution.
    5. Divisez le nombre désiré d'érythrocytes infectés à injecter par le nombre d'érythrocytes dans 1 L de chaque dilution afin de déterminer le volume de sang dilué de donneur nécessaire à l'injection. Choisissez la dilution avec le volume le plus approprié pour l'injection, ajoutez le volume à un nouveau tube de microcentrifuge, et complétez-le à 120 L avec le milieu de RPMI.
  5. Jour 0 : injection intraveineuse des souris receveuses
    1. Placez les souris récepteurs sous une lampe rouge chaleur pour dilater leurs veines pour l'injection. Chargez les doses de parasites dans une seringue à insuline de 27 G et placez la souris récepteur dans un rebord.
    2. Injecter 1 million ou 10 000 érythrocytes infectés par voie intraveineuse (IV) à l'aide de la seringue d'insuline 27 G dans chaque souris receveuse pour les tests d'infection par les moustiques ou pour les analyses de croissance asexuées et sexuelles de la croissance du sang, respectivement. Continuer à maintenir les souris dans des conditions de logement standard.
      REMARQUE: Une injection ip est une méthode indirecte d'introduction de parasites dans la circulation sanguine, car les érythrocytes parasités doivent passer à travers les ganglions lymphatiques drainants de la cavité péritonéale pour atteindre le sang. Cela fait d'une injection ip une voie d'accouchement indirecte pour l'injection d'un nombre précis de parasites dans la circulation sanguine. Par conséquent, la voie IV est préférable, car elle fournit des doses de parasites précises directement dans la circulation sanguine, comme le montre la figure 3 et décrit dans les résultatsreprésentatifs .

2. Détermination de la charge parasitaire à stade sanguin pour les stades sexuels et asexués

REMARQUE: Dans cette section, des méthodes normalisées d'évaluation phénotypique des stades sanguins du parasite du paludisme sont énumérées. Ces méthodes sont utiles dans l'évaluation de nouveaux candidats antipaludiques ou vaccinaux ou même ko de gènes sur le développement des stades sexuels et asexués chez les mêmes souris expérimentales. Il convient de noter que P. chabaudi et P. vinckei sont également des options alternatives très rationnelles et importantes pour ce type d'essais, en particulier dans le dépistage des drogues.

  1. Détermination de la parasitemia des stades asexués et des gamocytes mâles vs femelles par giemsa-taché souillé frottis de sang minces pour les tests de croissance de parasite
    1. À l'aide d'une aiguille de 26 G ou 27 G, piquer la queue de la souris et recueillir la gouttelette de sang sur une lame de microscope. Utilisez le bord court d'une autre lame de microscope pour enduire rapidement le sang à travers la diapositive.
    2. Fixez la lame avec 100% de méthanol pendant au moins 1 min, seulement après que le sang a complètement séché sur la lame. Tainer dans 10% de Giemsa pendant 10-15 min. Laver la lame avec de l'eau simple ou double distillée et laisser sécher.
    3. Lisez la diapositive à l'aide d'un objectif 100x et d'une immersion d'huile sous un microscope léger. Pour une mesure précise de parasitemia, vérifiez au moins un total de 6.000 érythrocytes, qui peuvent être obtenus en comptant au moins 30 ou 40 grilles microscopiques avec un nombre moyen de 200 ou 150 érythrocytes (RBCs) par grille, respectivement. Comptez le nombre total de RBC dans la première et la dernière grille pour déterminer le nombre moyen de globules rouges pour toutes les grilles.
    4. Comptez le nombre total d'érythrocytes infectés par grille. Les gamétocytes mâles et femelles peuvent être comptés séparément pour déterminer le gamocytemia mais devraient également être inclus dans le nombre total de parasitemia.
    5. Déterminer le pourcentage total de parasitemia en divisant le nombre total d'érythrocytes parasités par le nombre total de RBCs observés. Multipliez ce nombre par 100 pour déterminer le pourcentage de parasitemia.
    6. Déterminer le gamétocytemia en divisant le nombre total de gamétocytes comptés par le nombre total de RBC observés. Multipliez ce nombre par 100 pour déterminer le pourcentage de gamocytemia par souris.
      REMARQUE: La seule méthode fiable de différenciation entre les différents stades sanguins asexués et sexuels est l'utilisation d'un microscope pour évaluer les frottis de sang minces tachés de Giemsa, car chacune des étapes a une morphologie différente, à l'exception des gamocytes immatures, qui sont pour la plupart indiscernables des stades sanguins asexués.
  2. Détermination de la parasitemia de sang-étape par cytométrie d'écoulement pour les souches parasites WT-exprimant des protéines fluorescentes
    1. Étiqueter deux tubes de microcentrifuge pour chaque échantillon de souris, désignant un tube pour une dilution 1:1,000 et l'autre pour une dilution 1:2,000. Ajouter 1,5 l d'héparine 1x au tube de dilution 1:1 000.
    2. À l'aide d'une aiguille de 26 G ou 27 G, piquez la queue de la souris et transférez 1,5 l de sang dans le tube contenant 1,5 l d'héparine 1x (le tube de dilution 1:1 000). Mélanger le sang et l'héparine 1x doucement ensemble en pipetting de haut en bas.
    3. Ajouter 1 497 l de milieu RPMI au tube microcentrifuge, et doucement pipette de haut en bas pour bien mélanger.
    4. Transférer 500 l du mélange du tube de dilution 1:1 000 au tube de dilution 1:2,000. Ajouter 500 l de rpMI moyen au tube 1:2,000 et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas.
    5. Suivez le protocole de démarrage approprié du fabricant pour le cytomètre de débit. Exécutez les échantillons à un débit lent et configurez la détection pour au moins 20 000 événements.
      REMARQUE: Il existe un autre test pratique pour mesurer la parasitemia via le tri tricolore FACS, que les parasites expriment des marqueurs fluorescents ou non34. Cependant, le test décrit ici offre une mesure précise de parasitemia chez les parasites vivants sans l'ajout de colorants liant l'ADN et l'utilisation du tri FACS.
  3. Détermination du taux d'exflagellation des gamètes mâles par microlitre de sang de souris infecté
    1. Préparer un tube microcentrifuge de dilution 1:10 avec 40 l de milieu ookinete incomplet (RPMI , bicarbonate de sodium, hypoxanthine et acide xanthurénique) et 5 l d'héparine 1x.
    2. À l'aide d'une aiguille de 26 G ou 27 G, piquez la queue de la souris et transférez rapidement 5 ll de sang (à l'aide d'une micropipette) dans le tube contenant le support ookinete incomplet , l'héparine. Mélanger délicatement et charger 12 l de 1:10 tube de dilution sanguine sur un hémocytomètre et le laisser à température ambiante (20-24 oC).
    3. Commencez à compter les événements d'exflagellation 9-10 min après avoir préparé la dilution 1:10. Utilisez un microscope léger de contraste de phase avec grossissement 40x.
    4. Multipliez le nombre moyen d'exflagellations comptées par 10, puis multipliez par le facteur de dilution (10) pour déterminer le nombre moyen d'exflagellation par microlitre de sang infecté.
      REMARQUE: Cet analyse mesure le nombre d'exflagellation de gamètes mâles dans un volume de sang de 1 L, qui peut être quantifié à l'aide d'un hémocytomètre. Un milieu ookinete incomplet18 est mélangé avec le sang pour imiter étroitement les conditions pendant lesquelles l'exflagellation se produit à l'intérieur du midgut de moustique peu de temps après un repas de sang.

3. Isolement et traitement des parasites de stade sanguin des érythrocytes infectés et de la préparation congelée de stock

  1. Saignement terminal des rongeurs infectés par ponction cardiaque
    1. Préparer une seringue à aiguilles de 26 G qui contient environ 20 l d'héparine 1x (200 unités/mL) pour recueillir le sang de la souris donneuse par ponction cardiaque.
    2. Utilisez un flux lent de CO2 pour euthanasier la souris avant de saigner. Alternativement, anesthésiez la souris avec l'isoflurane (qui doit être maintenu avant et pendant l'incision de peau pour exposer le coeur).
    3. Poser la souris sur le dos et épingler ses appendices. Faire une petite incision dans la peau près de la base du sternum en tirant la peau avec des forceps et en la coupant avec des ciseaux. Retirez la peau à l'emplacement de l'incision pour exposer le diaphragme et le haut de la cavité abdominale.
    4. Maintenez la base de la cage thoracique avec des forceps et coupez à travers le diaphragme pour entrer dans la cavité thoracique; veillez à ne pas endommager le cœur ou les poumons. Épinglez la cage thoracique pour exposer le cœur.
    5. Perforez doucement le cœur et tirez lentement vers le haut sur le piston de seringue pour recueillir 1 ml de sang et le transférer à un tube de microcentrifuge.
  2. Préparation des stocks congelés à partir de sang infecté
    1. Saigner les souris (voir la section 3.1) avec des parasites sanguins qui sont entre environ 2% et 5%, avec une quantité significative d'étapes de l'anneau et pas autant de gamétocytes.
    2. Mélanger la portion désirée de sang avec la solution de congélation (10% de glycérol dans la solution d'Alsever) dans un rapport de 1:2 et stocker dans des flacons cryogéniques. Congeler dans l'azote liquide.
  3. Isolement et purification des parasites sanguins pour l'extraction de l'ADN, de l'ARN et des protéines
    1. Souris saignées (voir la section 3.1) avec des parasites sanguins qui sont supérieurs à 0,5%.
    2. Préparer une seringue de 10 ml en enlevant le piston et en insérant un petit coton-tige. Emballez le coton jusqu'au fond de la seringue. Remplissez-le de cellulose jusqu'à ce que le niveau de cellulose atteigne la marque de 3 ml, mais ne dépasse pas la marque de 4 ml sur la seringue.
    3. Fixez la seringue dans un clip sur un support d'anneau et placez un tube de collecte des déchets en dessous. Ajouter 5 ml de PBS à la seringue et laisser couler dans le tube à déchets.
    4. Préparer les stocks congelés si nécessaire, en utilisant seulement 100-300 l de sang. Ajouter le reste du sang infecté (400-700 l) à la colonne. Recueillir le flux à travers avec un tube à déchets jusqu'à ce que les gouttelettes commencent à devenir rouge. Une fois que les gouttelettes commencent à tourner au rouge, placez un nouveau tube de collecte de 14 ml sous la seringue pour recueillir le flux à travers.
    5. Une fois que le débit commence à ralentir, ajouter du PBS à la seringue et recueillir le flux à travers dans le tube de 15 ml jusqu'à ce qu'un volume total de 14 ml a été atteint. Recueillir le flux restant à travers avec un tube à déchets.
    6. Centrifuger le tube de 14 ml avec le mélange sang/PBS pendant 8 min à 250 x g sans freins. Retirer le supernatant et ajouter 14 ml de saponine réfrigérée (50 mg de saponine dans 50 ml de PBS). Pour déloger la pastille, inverser le tube plusieurs fois et vortex si nécessaire.
    7. Centrifuger le tube pendant 8 min à 1 217 x g sans freins. Retirez le supernatant, en laissant environ 0,5 ml de la solution au-dessus de la pastille.
    8. Resuspendre le granule dans la solution à l'aide d'une micropipette et le transférer dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 500 l de PBS au tube de 14 ml pour laver les parasites résiduels qui restent dans le tube. Ajoutez ceci au même tube de microcentrifuge.
    9. Centrifugeuse du tube pendant 2 min à 6 010 x g. Retirez le supernatant et suspendez 1 ml de PBS. Centrifugeuse de 2 min à 9 391 x g.
    10. Procédez à extraire l'ADN génomique, l'ARN total et la protéine.
      1. Pour l'extraction génomiquede l'ADN, retirez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille dans 200 L de PBS, puis suivez tout protocole approprié d'extraction d'adnçage.
      2. Pour l'extraction totaled'ARN, retirez le supernatant, resuspend et vortex la boulette dans 1 ml de n'importe quelle solution à base d'isothiocyanate de phénol et de guanidine ou tout autre réactif approprié et, ensuite, suivez n'importe quel protocole approprié de l'extraction totale d'ARN.
      3. Pour l'extraction totalede protéines, retirez le supernatant, suspendez la pastille dans un volume approprié de colorant de chargement de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) ou tout autre réactif approprié et, ensuite, suivez n'importe quel protocole approprié de traitement total des protéines.

4. Tests d'infection par les moustiques

REMARQUE: Le moustique est le principal hôte des parasites du paludisme où la reproduction sexuelle a lieu. L'infection des souris pour transmettre des parasites du paludisme aux moustiques est réalisée par une injection IV d'au moins 1 million de stades sanguins, suivie par l'alimentation d'une souris infectée (de chaque génotype qui affiche le taux d'exflagellation du gamète mâle le plus élevé) à Anophèle moustiques dans une cage au jour 3 post-infection de souris. L'injection IV avec 1 million de parasites de stade sanguin chez les souris traitées à la phénylhydrazine assurera le développement du gamétocyte mâle et femelle à un taux plus rapide et plus élevé. Les moustiques infectés par P. yoelii et P. berghei sont incubés à 24 oC et 20-21 oC, respectivement, afin de permettre le meilleur développement possible des stades de moustique6 .

  1. Alimentation et détermination du nombre d'ookinetes par moustique
    1. Femelle adulte affamée Anopheles stephensi ou a. gambiae moustiques (4-7 jours) pendant 8-12 h avant l'alimentation. Permettre aux moustiques adultes de se nourrir pendant au moins 15 min sur les souris anesthésiées infectées (injectées avec une dose appropriée de kétamine/xylazine) avec le taux d'exflagellation le plus élevé (mesuré à la section 2.3).
      REMARQUE: La solution de travail de la kétamine/xylazine est préparée par la dilution 1:5 de la solution de stock dans l'injection saline et IP de 100 L par souris. Pour une solution de bouillon de 10 ml, 1 ml de xylazine (100 mg/ml) est ajouté à 9 ml de kétamine (100 mg/ml).
    2. Enlever les moustiques femelles non nourris et les moustiques mâles avec un aspirateur buccaux.
    3. À 18-20 h après l'alimentation, recueillir 20-30 moustiques et les placer dans le congélateur pendant pas moins de 10 min pour assurer la mort. À l'aide d'une portée de dissection binoculaire, disséquer 20 à 30 mi-guts remplis de sang avec deux aiguilles de 26 G ou 27 G ou une aiguille et des forceps dans le milieu de dissection RPMI ou PBS et transférer les mi-guts dans un tube microcentrifuge contenant 200 L de RPMI ou de PBS (Méthode de dissection veuillez consulter la section 4.3).
    4. Centrifugele rauque du tube de collecte pour 1 min à 700 x g. Broyer les mi-guts granulés à l'aide d'un pilon. Répétez cette étape.
    5. Transférer 50 L du tube des miguts moulus à un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter 200 l de RPMI ou PBS pour créer une dilution de 1:5.
    6. Transférer 12 l à un hémocytomètre et l'incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre au contenu de se déposer.
    7. Déterminer le nombre moyen d'ookinetes à l'aide d'un microscope léger avec un contraste de phase et un grossissement de 40x.
    8. Multipliez le nombre moyen d'ookinetes matures par 10, puis par le facteur de dilution de 5 pour déterminer le nombre total moyen d'ookinetes.
    9. Divisez le nombre moyen d'ookinetes par le nombre de moustiques nourris au sang disséqués pour déterminer le nombre d'ookinetes par moustique nourri par le sang.
  2. Détermination du nombre d'oocystes précoces pour les souches de parasites de genre WT exprimant des protéines fluorescentes
    REMARQUE: Le but de cet essai est de déterminer le nombre de parasites vivants exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) qui a établi une infection complète des miguts de moustique et a formé les oocysts sphériques tôt. Cet essai détermine si les ookinetes (leur développement estimé dans l'essai précédent) ont accompli leurs fonctions par le traversal par les cellules épithéliales de midgut de moustique et la transformation aux oocysts tôt sur le côté basal de lamina du midgut épithélia ou pas. C'est un autre essai qui fait un grand usage des parasites exprimant GFP, car compter les oocysts tôt à ce stade sera presque impossible sans immunostaining fastidieux.
    1. Disséquer les mi-guts (voir la section 4.1) de 20-30 moustiques nourris au sang, au jour 3 ou 4 post-moustique-alimentation (pmf) pour P. yoelii 17X-NL, et au jour 6 ou 19 h f pour P. berghei ANKA, avec deux aiguilles de 26 G ou 27 G ou une aiguille et des forceps en RPMI ou PBS dissection m edium (Pour la méthode de dissection s'il vous plaît voir la section 4.3).
    2. Étendre de 40 à 50 l de milieu de dissection sur la ligne médiane horizontale du bord plus long de la glissière de verre. Transférer les mi-guts à cette ligne, un à la fois, pendant la dissection, et ajouter plus de milieu aux mi-guts, si nécessaire, pour éviter le dessèchement.
    3. Placez un slip doucement sur les mi-guts disséqués et scellez-le avec du vernis à ongles.
    4. En utilisant l'objectif 10x ou 20x du microscope à fluorescence avec le filtre à fluorescence verte, compter le nombre d'oocystes précoces sur chaque intermédiaire, dans au moins 20 miguts.
  3. Détermination du nombre de sporozoites d'oocystes par moustique
    1. Disséquer les mi-guts d'au moins 20-30 moustiques avec deux aiguilles de 26 G ou 27 G ou une aiguille et des forceps dans le milieu de dissection RPMI ou PBS et de recueillir les intermédiaires disséqués dans 200 'L de RPMI.
    2. Maintenez les segments inférieurs de l'abdomen fermement en place avec une aiguille (ou forceps) et poussez légèrement le thorax dans une direction ascendante avec l'autre aiguille à la jonction entre le thorax et l'abdomen. Faites des poussées soigneusement courtes jusqu'à ce que le thorax se sépare de l'abdomen. Dès que la séparation commence le midgut blanc apparaîtra étiré, puis le midgut sera coupé de l'extrémité de l'œsophage en utilisant la même aiguille qui a été utilisé pour séparer le thorax. Si elle est toujours attachée à l'abdomen, la même aiguille peut être utilisée pour tirer le midgut loin de l'abdomen. Transférer les mi-guts de tous les moustiques dans le tube de collecte en les recueillant dans le milieu avec une aiguille, un à la fois.
    3. Centrifuger le tube de collecte pendant 1 min à 700x g pour régler les mi-guts au fond du tube de collecte et les moudre avec un pilon. Répétez cette étape.
    4. Transférer 12 l à un hémocytomètre et l'incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre à son contenu de se déposer.
    5. Comptez les sporozoites d'oocyst à l'aide d'un objectif 40X d'un microscope léger. Utilisez des dilutions 1:5 et/ou 1:10 si les débris de moustiques empêchent le comptage précis des sporozoites ou si le nombre de sporozoites est trop élevé pour être compté avec précision.
    6. Calculer le nombre total moyen de sporozoites d'oocystes en multipliant le nombre moyen de sporozoites par 10 et, ensuite, en multipliant ce nombre par le facteur de dilution, le cas échéant, et par le volume total (200 l).
    7. Diviser le nombre total moyen de sporozoites par le nombre de moustiques disséqués pour calculer le nombre moyen de sporozoites d'oocystes par moustique.
      REMARQUE: Une erreur commune pour mesurer le succès ou la productivité de l'infection de stades de moustique est le comptage du nombre d'oocysts aux stades postérieurs du développement d'oocyst. Cela est dû à certains oocysts étant vacuolated à des points de temps plus tard du développement d'oocyst, et d'autres ne développent pas des sporozoites, même sur le même midgut. La meilleure méthode et la plus fiable pour déterminer la productivité de l'infection par les stades des moustiques est le comptage du nombre moyen de sporozoites d'okyskysmides aux jours 10-12 post-infection par les moustiques pour P. yoelii et aux jours 12-14 post-moustique-infection pour P. berghei.
  4. Détermination du nombre de sporozoites de glande salivaire par moustique
    note:L'évaluation finale de l'achèvement complet du développement des stades des moustiques est réalisée en estimant le nombre de sporozoites qui ont envahi la glande salivaire, qui sont les stades transmissibles et infectieux pour les vertébrés. L'invasion de la glande salivaire est établie après l'achèvement du développement de sporozoite d'oocyst, épuisent dans l'hémolymphe, attachement à la lame basale des cellules acinar de glande salivaire, et traversal des cellules acinar pour atteindre les glandes salivaires Conduits5 Annonces. Par conséquent, cet exemple est aussi une évaluation du succès de tous ces processus ou non. Néanmoins, une estimation des nombres de sporozoite hémailienne permettrait la différenciation entre les défauts dans l'évacuation des oocysts et les défauts dans l'invasion des glandes salivaires35 Annonces. La purification des sporozoites salivaires de glande permet de mener des essais fonctionnels multiples sur la motilité de sporozoite et les phénotypes d'invasion. Les sporozoites de glande salivaire peuvent également être employées pour l'infection in vivo des souris et dans des études de vaccination36 Annonces,37 Ans, états-unis (. En outre, les étapes les plus reproductibles disponibles pour établir une invasion in vitro de stade de foie ou un essai de développement est par l'utilisation des sporozoites salivaires de glande.
    1. Disséquer les glandes salivaires de 50-100 moustiques femelles, aux jours 14-16 pmf pour P. yoelii et aux jours 17-20 pmf pour P. berghei, de préférence avec deux 26 G ou 27 G aiguilles, en RPMI ou DMEM milieu maintenu sur la glace et complété par 5% de sérum bovin fœtal (FBS) ou/bovine albumine de sérum (BSA) pour les sporozoites de P. yoelii ou 3% FBS/BSA pour p. berghei sporozoites. Si les sporozoites doivent être utilisées dans les essais in vitro d'hépatome, ajouter 1% de pénicilline/streptomycine au milieu de dissection. Il existe généralement deux méthodes pour la dissection des glandes salivaires. La première méthode prend beaucoup de temps, mais conduit à la dissection des glandes salivaires avec très peu ou pas de tissus contaminants. La deuxième méthode prend moins de temps, mais conduit à la collecte d'une quantité importante de tissus contaminants. La première méthode est détaillée ici.
    2. Maintenez les segments supérieurs de l'abdomen en place avec le côté vétusté d'une aiguille et poussez soigneusement la tête très légèrement (en pousses très courtes) à la jonction entre la tête et le thorax dans une direction ascendante jusqu'à ce que la tête soit soigneusement séparée du thorax sans déchirant les glandes salivaires vitreuses, les glandes salivaires exposées sont alors séparées de la tête avec la même aiguille qui a poussé la tête vers le haut.
    3. La glande salivaire disséquée sera soulevée du milieu de dissection à l'aide d'une pipette Pasteur en verre court.
    4. Lorsque toutes les glandes salivaires ont été disséquées et récoltées, le talent placera le tube contenant les mi-guts dans la centrifugeuse (1min, 700 x g).
    5. Compter les sporozoites à l'aide d'un hémocytomètre sous un microscope léger réglé au contraste de phase 2 et au grossissement de 40x. Si le nombre de moustiques disséqués de 40, diluer les glandes salivaires à 1:5 ou 1:10, selon le rendement prévu de l'infectiosité (déterminé dans des essais antérieurs).
    6. Multipliez le nombre moyen de sporozoites par 10 et le facteur de dilution (le cas échéant). Multipliez par le volume total pour déterminer le nombre moyen de sporozoites salivaires. Divisez par le nombre de moustiques femelles disséqués pour déterminer la moyenne des sporozoites salivaires par moustique.
      REMARQUE: Le problème avec la dissection des glandes salivaires est leur petite taille et l'aspect transparent vitreux. Ainsi, il est très difficile d'isoler les glandes salivaires et, par conséquent, ils sont généralement disséqués comme une somme forfaitaire avec d'autres tissus de la partie frontale du thorax, qui est également important pour protéger les glandes salivaires de la rupture au cours de la collecte.

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Résultats

Le succès de l'application d'outils et de techniques génétiques inversés aux parasites du paludisme a révolutionné le domaine de la recherche sur le paludisme, avec la possibilité d'ajouter, de supprimer ou de modifier des segments génomiques spécifiques de plusieurs espèces de Plasmodium 39. Fait important, des loci génomiques dispensables ont été identifiés et utilisés avec succès pour introduire des marqueurs de protéines de fluorescence chez les rongeu...

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Discussion

Malgré la similitude de la biologie générale de leurs cycles de vie avec celle des parasites du paludisme humain, les modèles de paludisme à souris présentent également de nombreuses différences avec les espèces humaines de Plasmodium qui limiteraient leur utilisation comme modèles in vivo fiables. Par exemple, à l'exception des parasites atténués vivants comme vaccins, toutes les études de vaccins avec sous-unité et ADN et d'autres vaccins ont donné d'excellents résultats dans le modèle de souris, mais...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ahmed Aly est soutenu par le financement de l'Université Bezmialem Vakif par le ministère turc du Développement 2015BSV036, et par le financement fourni par l'École de Santé Publique et de Médecine Tropicale de l'Université de Tulane, et par le financement des NIH-NIAID pour R21Grant 1R21AI111058-01A1.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
HéparineSigma375095-100KU
Acide xanthuréniqueSigmaD120804-5G
HypoxanthineSigmaH9377-25G
Solution d’AlseverSigmaA3551-500ML
Bicarbonate de sodiumSigmaS5761-500G
PhénylhydrazineSigmaP26252-5G
GlycérolSigmaG5516-500ML
GiemsaSigmaGS1L-1L
26 g x 3/8 Aiguille de glissement de précision,  ;Becton Dickinson305110
Seringue TB 1 mL, 26 G x 3/8 SeringueBecton Dickinson309625
1 cc, U-100 27 GBecton Dickinson329412
Isoflurane, USBPiramal2667- 46- 7
PBS, pH 7,4Gibco10010049
RPMIGibco22400105
DMEMGibco11995065
Pencillin/StreptomycinGibco10378016
Sérum de veau fœtalGibco10082147
Fibre de verre WoolCorning3950
à insuline

Références

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