Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine

Résumé

Les interactions ADN-protéines sont essentielles pour de multiples processus biologiques. Au cours de l'évaluation des fonctions cellulaires, l'analyse des interactions ADN-protéines est indispensable pour la compréhension de la régulation des gènes. L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil puissant pour analyser ces interactions in vivo.

Résumé

Plusieurs processus cellulaires, y compris la réplication et la réparation de l'ADN, la recombinaison de l'ADN et l'expression des gènes, nécessitent des interactions entre les protéines et l'ADN. Par conséquent, les interactions ADN-protéine régulent de multiples fonctions physiologiques, physiopathologiques et biologiques telles que la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, le contrôle du cycle cellulaire, la stabilité chromosomique, la régulation des gènes épigénétiques et la transformation cellulaire. Dans les cellules eucaryotes, l'ADN interagit avec les protéines d'histone et de nonhistone et est condensé dans la chromatine. Plusieurs outils techniques peuvent être utilisés pour analyser les interactions ADN-protéine, telles que l'Électrophorèse (gel) Mobility Shield Assay (EMSA) et DNase I footprinting. Cependant, ces techniques analysent l'interaction protéine-ADN in vitro , pas dans le contexte cellulaire. L'immunoprécipitation de Chromatine (ChIP) est une technique qui capture des protéines sur leurs sites spécifiques de liaison à l'ADN, ce qui permet d'identifier l'interaction ADN-protéineS dans leur contexte de chromatine. Elle se fait par fixation de l'interaction ADN-protéine, suivie de l'immunoprécipitation de la protéine d'intérêt. Par la suite, le site génomique auquel la protéine était liée est caractérisé. Ici, nous décrivons et discutons ChIP et démontrons sa valeur analytique pour l'identification de la liaison induite par le facteur de croissance transformant-β (TGF-β) du facteur de transcription SMAD2 aux éléments de liaison SMAD (SBE) dans la région promoteur de la tyrosine- Facteur de cellules souches (SCF) du ligand du récepteur de protéine kinase (c-KIT).

Introduction

Dans le noyau des eucaryotes, l'ADN interagit avec les protéines d'histone et les protéines non-héroniques et est condensé dans la chromatine. Dans le contexte physiologique, pathophysiologique et biologique cellulaire, les fonctions cellulaires sont contrôlées spatialement et temporairement par l'expression des gènes coordonnés par la chromatine. Les interactions ADN-protéines jouent un rôle essentiel dans la régulation des processus cellulaires, tels que la replication, la recombinaison et la réparation de l'ADN, ainsi que l'expression des protéines. Par conséquent, l'analyse des interactions ADN-protéine est un outil indispensable dans l'évaluation de l'expression des gènes et de la fonction cellulaire.

Plusieurs techniques existent pour évaluer les interactions ADN-protéine in vitro , telles que l'essai de déplacement de mobilité de l'électrophorèse (gel) et la couche d'ADNase I ^{1 , 2} . Cependant, ces techniques n'analysent pas l'interaction protéine-ADN dans la chromatine et le contexte cellulaire. ChIP iUne technique qui capture des protéines liées à leurs sites spécifiques de liaison à l'ADN et facilite ainsi l'identification des interactions ADN-protéines dans le contexte de la chromatine. La technique a d'abord été développée par Gimour et Lis pour l'évaluation de la liaison de l'ARN polymérase II à des gènes spécifiques dans Escherichia coli et Drosophila melanogaster ^{3 , 4} . Il se fait par fixation des complexes ADN-protéine, suivi de l'extraction de la chromatine et du cisaillement de l'ADN dans des fragments de ~ 200 paires de bases (pb). Ensuite, la protéine d'intérêt liée à l'ADN est isolée par immunoprécipitation. Après l'inversion de la réticulation ADN-protéine, l'ADN est purifié et analysé. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour l'analyse des sites de liaison aux protéines et dépendent de la séquence d'acide nucléique du site de liaison de protéines dans le gène cible ⁵ . Dans les cas où la séquence d'ADN est connue, Pol standardOn peut appliquer des réactions en chaîne de l'ymerase (PCR), en utilisant des paires d'amorces spécifiques flanquant le site de liaison connu. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) peut également être utilisée ⁶ . Dans les cas où la séquence est inconnue, le ChIP peut être combiné avec des microarrays d'ADN (ChIP-on-chip), un séquençage d'ADN (ChIP-seq) ou des techniques de clonage ^{7 , 8 , 9} .

La voie TGF-β présente de puissantes fonctions de suppression de tumeur et constitue une voie clé dans la différenciation cellulaire. Il est activé par la liaison du ligand TGF-β1 à son complexe récepteur apparenté, ce qui entraîne la phosphatation serine des facteurs de transcription SMAD2 / 3. Après leur association avec le médiateur commun, SMAD4, le complexe SMAD se transforme en noyau et se lie au SBE dans la région promotrice des gènes cibles, où il régule les gènes contrôlant le cycle cellulaire, l'apoptose et la différentiation cellulairesur. La réponse transcriptionnelle à la stimulation TGF-β est le type de cellule et le contexte spécifique ¹⁰ . Récemment, nous avons décrit une boucle de réaction positive entre le TGF-β et la voie c-KIT ¹¹ . Dans ce modèle, le SMAD2 activé par TGF-β1 se lie au promoteur du ligand c-KIT et induit son expression et sa sécrétion. Par la suite, le ligand c-KIT active le récepteur c-KIT de manière auto-para-crinique. L'activation du récepteur c-KIT entraîne la phosphorylation STAT3 Tyr ⁷⁰⁵ via JAK1 / 2. Après l'activation de STAT3 et la translocation nucléaire, STAT3 se lie au gène du ligand TGF-β1 et régule son expression.

Ici, nous démontrons le rôle essentiel de l'analyse ChIP pour l'identification de la liaison SMAD2 au promoteur du ligand du récepteur c-KIT et pour l'identification du Transducteur de signal (et) Activateur (de) Transcription 3 (liaison STAT3 au TGF-β1- gène).

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparez les solutions suivantes fraîches pour chaque expérience.
   1. Pour la solution de fixation , préparer 37% de formaldéhyde et l'entreposer à la RT. Diluez-le dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à une concentration finale de 1,42%.
      ATTENTION: Le formaldéhyde est classé comme irritant, corrosif, mutagène, tératogène et cancérogène. Ne pas ingérer. Ne pas respirer les gaz / fumées / vapeurs / aérosols. En cas de ventilation insuffisante, porter un appareil respiratoire approprié. Eviter le contact avec la peau et les yeux. Tenir à l'écart des incompatibles, tels que les agents oxydants, les agents réducteurs, les acides, les alcalis et l'humidité.
   2. Pour la solution d'arrêt-solution de glycine, préparer une glycine 0,125 M dans une solution 1x PBS et la conserver à la température ambiante.
   3. Pour la solution de grattage cellulaire, préparer une solution 1x PBS dans dH ₂ O et la conserver sur de la glace. Directement avant l'utilisation, ajouter un inhibiteur de protéinase fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) tO une concentration finale de 0,5 mM.
      ATTENTION: PMSF est classé comme corrosif et toxique; Porter des vêtements de protection et l'utiliser dans un endroit ventilé.
   4. Directement avant d'utiliser le tampon de lyse cellulaire (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM et NP40 à 0,5%), ajouter 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; Solution mère 100X dans du diméthylsulfoxyde (DMSO): 104 mM 4- ( Chlorhydrate de 2-aminoéthyl) benzènesulfonyle (AEBSF), aprotinine 80 uM, bestatin 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptine 2 mM et pepstatine A 1,5 mM et PMSF 0,5 mM.
   5. Directement avant d'utiliser le tampon de lyse nucléaire (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, 10 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) et 1% de SDS), ajouter 1X PIC et 0,5 mM de PMSF.

2. Fixation et cisaillage de la cellule

1. Cultiver les cellules à une confluence de 70 à 80% sur des plaques de culture tissulaire de 10 cm. Stimuler les cellules selon les objectifs expérimentaux.
2. Retirer le milieu de culture tissulaire, ajouter 5 ml de solution de fixation et incuberLes cellules pendant 10 min à la RT sur une plateforme tremblante.
3. Retirez la solution de fixation et lavez les cellules deux fois avec 10 ml de PBS glacé 1x.
4. Retirez le 1x PBS, ajoutez 5 ml de solution de solution de glycine et arrêtez les cellules pendant 5 min à la RT sur une plateforme tremble.
5. Retirez la solution de solution de glycine et lavez les cellules deux fois avec 10 ml de 1x PBS glacé.
6. Retirez le 1x PBS, ajoutez 2 ml de solution de grattage cellulaire et récoltez les cellules à l'aide d'un grattoir cellulaire. Transférer les cellules récoltées dans un tube conique sur de la glace.
7. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 600 xg et 4 ° C.
8. Retirer le surnageant, remettre à nouveau le culot dans 1 mL de tampon de lyse cellulaire 1X et incuber sur de la glace pendant 30 min. Alternativement, congéluez la pastille dans de l'azote liquide et rangez-la à -80 ° C.
9. Une fois que le culot est remis en suspension dans le tampon de lyse cellulaire, transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur à drosse glacée et lâchez pendant 10 coups en utilisant un pan de type BE pour la perturbation cellulaire.
10. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugeuse et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 2,400 xg et 4 ° C.
11. Jeter le surnageant, remettre à nouveau le culot dans 350 μL de tampon de digestion des noyaux et incuber les échantillons pendant 5 min à 37 ° C.
12. Ajouter la nuclease micrococcique (1 U / μL) et mélanger par vortex. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 5-20 min; Mélanger les échantillons toutes les 2 minutes par inversion.
    REMARQUE: Le temps et la concentration de l'enzyme diffèrent entre les lignées cellulaires et peuvent nécessiter une optimisation dans les cas de cisaillement enzymatique sous-optimal.
13. Alternativement, réaliser le cisaillement de la chromatine par sonication en utilisant des sonicateurs disponibles dans le commerce.
    REMARQUE: les conditions de sonication nécessiteront une optimisation. Un protocole d'exemple d'optimisation est fourni ci-dessous en utilisant un volume d'échantillon de 300 μL et une puissance de traitement d'échantillon de 25%.
    1. Après l'étape 2.10, jeter le surnageant et ré-endiguer le nCulot purifié dans 1,0 ml de tampon de cisaillement commercial.
    2. Alimentez 300 μL de la pastille nucléaire remis en suspension dans trois tubes de microcentrifugeuse de 1,7 ml. Placez-les sur de la glace.
    3. Cisailler les 3 parties aliquotes de la chromatine fixe à 25% de puissance en utilisant 3 conditions différentes pour déterminer les conditions de sonication optimales:
       5 impulsions de 20 s chacune, avec un repos de 30 s sur la glace entre chaque impulsion.
       10 impulsions de 20 s chacune, avec un repos de 30 s sur la glace entre chaque impulsion.
       20 impulsions de 20 s chacune, avec un repos de 30 s sur la glace entre chaque impulsion.
    4. Continuez avec l'étape 2.15, comme indiqué ci-dessous.
14. Après l'incubation avec la nuclease micrococcique, ajouter 7 μl d'EDTA 0,5 M glacé pour arrêter la réaction.
15. Centrifuger les échantillons avec l'ADN ciselé pendant 10 min à 16 200 xg et 4 ° C.
16. Transférer le surnageant contenant de l'ADN ciselé à un tube de microcentrifugeuse frais. Aliquote 50 μL dans un tube de microcentrifugeuse séparé pour confirmer le suCisaillement ciblé de l'ADN (section 3). Utilisez le volume restant immédiatement pour l'immunoprécipitation (section 4) ou rangez-le à -80 ° C.

3. Confirmation de l'efficacité du cisaillement

1. Ajouter 150 μl de dH ₂ O exempt de nuclease et 10 μL de NaCl 5 M à l'aliquote de 50 μL de la chromatine cisaillée à partir de l'étape 2.16.
2. Incuber les échantillons à 65 ° C pendant 4 h pour inverser les réticulations.
3. Ajouter 2 μL de RNase A (10 μg / μL) et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min.
4. Ajouter 10 μL de protéinase K (0,5 μg / μL) et incuber les échantillons à 42 ° C pendant 90 minutes.
5. Pour la purification de l'ADN, effectuer une extraction au phénol / chloroforme ¹² .
   1. Ajouter de l'eau libre de nuclease à un volume final de 200 μL. Ajouter 200 μL de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) à l'échantillon et vortex pendant 20 s.
   2. Centrifugeuse à la pièceDurée de 5 min à 16 000 x g. Retirez délicatement la phase aqueuse supérieure et transférez-la sur un tube frais. Assurez-vous de ne pas transporter de phénol pendant le pipetage.
   3. Ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M (NH ₄ OAc), pH 5,2, et mélanger en faisant tourner le tube plusieurs fois avec un doigt. Ajouter 2,5 volumes d'éthanol 100% glacé et mélanger par vortex pendant 5 s. Incuber l'échantillon O / N à -20 ° C, ou pendant au moins 1 h à -80 ° C.
   4. Centrifuger l'échantillon pendant 30 min à 4 ° C et 16 000 xg pour granuler l'ADNc.
   5. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter 1 ml de RT, 70% d'éthanol et inverser le tube plusieurs fois.
   6. Centrifuger l'échantillon pendant 2 min à 4 ° C et 16 000 x g. Retirez soigneusement le surnageant.
   7. Sécher la pastille pendant 5-10 min à la température ambiante. Remettre en suspension la pastille dans 30 μL de dH ₂ O.
6. Utiliser une aliquote de 5 et 10 μL de l'ADN purifié pour une électrophorèse sur gel avec un TAE à 1%Gel d'agarose.
   NOTE: Un cisaillement correct de la chromatine se traduit par un schéma d'ADN de 200 à 1 500 pb. Si le cisaillement échoue, déterminer les conditions de cisaillement optimales pour les cellules spécifiques en modifiant le temps d'incubation de l'étape de cisaillement (étape 2.12) à 5, 10 et 15 min.
7. Utilisez l'échantillon restant pour analyser la concentration d'ADN de l'échantillon. Calculer inversement la concentration d'ADN dans l'échantillon de chromatine ciselé (étape 2.16); Utiliser les mêmes quantités d'ADN pour chaque groupe de traitement pour l'immunoprécipitation (section 4).

4. Immunoprécipitation

1. Combinez 10 à 25 μg de la chromatine cisaillée et réticulée (étape 2.16) avec 25 μL de billes magnétiques de la protéine G de classe ChIP, 10 μL de tampon de dilution d'immunoprécipitation (solution mère: 0,01% de SDS, 1,1% de Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM et NaCl 167 mM) et 1 ul de PIC.
2. Après 4 h d'incubation, ajouter 1-10 μg d'anticorps (le concentré d'anticorpsDépendra de l'affinité de l'anticorps; Il devrait d'abord être utilisé selon les recommandations du fabricant et optimisé expérimentalement si nécessaire) à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et ajouter dH ₂ O à un volume final de 100 μL.
   NOTE: Au lieu de la méthode d'immunoprécipitation directe décrite ci-dessus, la méthode d'immunoprécipitation indirecte peut être utilisée en combinant d'abord la chromatine avec les anticorps et en ajoutant par la suite des billes magnétiques protéines G.
3. Incuber les échantillons sur un rotator de bout en bout pendant 4-12 h à 4 ° C.

5. Elution

1. Placez les tubes sur un support magnétique. Une fois que les grains magnétiques s'accumulent sur le côté du tube, retirez et jettez soigneusement le surnageant.
2. Laver les billes trois fois avec 800 μl de tampon de lavage 1 (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM d'EDTA pH 8, 20 mM de Tris-HCl, pH 8 et 150 mM de NaCl); Mélanger en inversant le tube plusieurs fois. Placez le tube sur le support magnétique aEt retirer soigneusement et jeter le tampon de lavage une fois que les grains magnétiques s'accumulent sur le côté du tube.
3. Laver les billes une fois avec 800 μl de tampon de lavage 2 (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM d'EDTA, pH 8, 20 mM de Tris-HCl pH 8 et 500 mM de NaCl); Mélanger en inversant le tube plusieurs fois. Placez le tube sur le support magnétique et retirez soigneusement et jeter le tampon de lavage une fois que les grains magnétiques s'accumulent sur le côté du tube.
4. Remettre en suspension les billes dans 50 μl de tampon d'élution (SDS à 1% et NaHCO ₃ 100 mM) et incuber les échantillons sur un rotator de bout en bout pendant 15 minutes à la RT.
5. Placez les tubes sur un support magnétique, et une fois que les perles magnétiques se rassemblent sur le côté du tube, transférez le surnageant à un tube frais.
6. Ajouter 6 μL de NaCl 5 M, inverser la réticulation et 2 μL de protéinase K (0,5 μg / μL). Après avoir mélangé les échantillons, incuber les échantillons pendant 2 h à 65 ° C.
7. Pour la purification de l'ADN, effectuer une pheExtraction nol / chloroforme ¹² (étape 3.5) et resuspendent ensuite le culot dans 30 μL de dH ₂ O.
   NOTE: Les échantillons peuvent être directement analysés pour les sites de liaison aux protéines (section 5) ou peuvent être conservés à -20 ° C.

6. Analyse du site de liaison

1. Effectuer une analyse pour des sites de liaison spécifiques dans une séquence d'acide nucléique connue en utilisant PCR ou qRT-PCR. Pour la conception des amorces, suivre les protocoles conventionnels de PCR ou qRT-PCR. Concevez les amorces pour synthétiser un amplicon de 150 à 400 pb qui relie le site de liaison aux protéines d'intérêt ( figure 1 ).
2. Mettre en place la PCR en utilisant quatre modèles d'ADN différents pour assurer la spécificité: i) ADN de ChIP immunoprécipité avec l'anticorps d'intérêt, ii) ADN de ChIP immunoprécipité avec un anticorps IgG non spécifique, iii) ADN d'entrée, et iv) H ₂ O en tant que Contrôle négatif pour la PCR pour exclure la contamination. Dans le cas de la stimulation de la voie, Choisissez un cinquième modèle en utilisant un ensemble différent d'amorces spécifiques à un site de liaison connu de la protéine immunoprécipitée.
   NOTE: Dans le cas de l'analyse du promoteur du ligand c-KIT, utiliser une PCR conventionnelle pour démontrer la liaison SMAD induite par le TGF-β au SBE dans la région promoteur du ligand c-KIT. En tant que témoin positif, effectuer une PCR sur l'inhibiteur de l'activateur plasminogène-1 (PAI-1) comme cible connue de la liaison SMAD induite par le TGF-β.

Résultats

La liaison du ligand TGF-β1 à son complexe récepteur apparenté entraîne la phosphatation sérique de facteurs de transcription SMAD2 / 3, suivie de leur association avec le médiateur commun, SMAD4. Le complexe SMAD se transforme en noyau. Le TGF-β peut réguler la transcription des gènes, soit directement par liaison SMAD aux SBE dans les régions régulatrices des gènes cibles, soit indirectement par l'expression régulée par la SMAD d'activateurs transcriptionnels ou de répresseurs qui régu...

Discussion

Dans ce rapport, nous démontrons la liaison induite par le TGF-β1 de SMAD2 à un SBE dans le promoteur du ligand c-KIT et la liaison induite par TGF-β1 de STAT3 à sa séquence de reconnaissance dans le gène du ligand TGF-β1. Nous démontrons la liaison induite par les cytokines des deux facteurs de transcription en utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine.

L'immunoprécipitation de la chromatine est un outil puissant pour démontrer la liaison directe d'une protéine d'inté...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules HepG2	ATCC	HB-8065
Cellules Hep3B	ATCC	HB-8064
TGF-&beta ; 1	R& D Systems	101-B1	Utilisé à une concentration de 10 ng/mL
Anticorps anti-SMAD2	Technologie de signalisation cellulaire	5339	Quantité utilisée/IP : 3 & micro ; g
Anticorps anti-STAT3	Technologie de signalisation cellulaire	4904	Quantité utilisée/IP : 3 & micro ; g
Protéine ChIP-IT g Perles magnétiques	Motif actif	53033
Cocktail inhibiteur de protéase Motif	actif	37490
Technologie de signalisation cellulaire	des nucléases micrococciques	10011
Amorce directe PCR : PAI-1			Séquence : 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Amorce inverse PCR : PAI-1			Séquence : 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Amorce directe PCR : SCF			Séquence : 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'   ;
Amorce inverse PCR : SCF			Séquence : 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Amorce directe PCR : TGF-&beta ; 1 (STB-1)			Séquence : 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGGGCATGTT-3'   ;
amorce inverse PCR : TGF-&beta ; 1 (STB-1)			Séquence : 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'   ;
Amorce directe PCR : TGF-&beta ; 1 (STB-2)			Séquence : 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'   ;   ;   ;   ;
amorce inverse PCR : TGF-&beta ; 1 (STB-2)			Séquence : 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'   ;   ;