Article de méthode

Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

DOI :

10.3791/55697

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13 juin 2017

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1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.

Résumé

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Les lésions du cerveau et de la moelle épinière peuvent conduire à un handicap permanent et à la mort car il n'est toujours pas possible de régénérer les neurones sur de longues distances et de les reconnecter avec précision à une cible appropriée. Ici, une procédure est décrite pour lancer rapidement, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Les taux d'extension atteints atteignent plus de 1,2 mm / h, 30 à 60 fois plus vite que les taux in vivo des axones à plus forte croissance du système nerveux périphérique (0,02 à 0,04 mm / h) 28 et 10 fois plus rapides que précédemment signalés pour le même Type neuronal à un stade de développement antérieur 4 . Premièrement, les populations isolées de neurones d'hippocampe de rat sont cultivées pendant 2-3 semaines dans des dispositifs microfluidiques pour positionner précisément les cellules, ce qui permet une micromanipulation facile et une reproductibilité expérimentale. Ensuite, les perles recouvertes de poly-D-lysine (PDL) sont placées sur des neurites pour former un conteneur adhésifLes actes et la micromanipulation par pipette sont utilisés pour déplacer le complexe résultant de neurites-perles. À mesure que le cordon est déplacé, il élimine un nouveau neurite qui peut être étendu sur des centaines de micromètres et connecté fonctionnellement à une cellule cible en moins de 1 h. Ce processus permet une reproductibilité expérimentale et une facilité de manipulation tout en contournant des stratégies chimiques plus lentes pour induire une croissance des neurites. Les mesures préliminaires présentées ici démontrent un taux de croissance neuronal dépassant largement les facteurs physiologiques. La combinaison de ces innovations permet l'établissement précis de réseaux neuronaux en culture avec un degré de contrôle sans précédent. C'est une méthode novatrice qui ouvre la porte à une multitude d'informations et d'informations sur la transmission et la communication du signal dans le réseau neuronal, tout en étant une aire de jeux pour explorer les limites de la croissance neuronale. Les applications et expériences potentielles sont répandues avec des implications directes pour les thérapies qui visent à reconnecter les neuronesL après un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives.

Introduction

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Les blessures au système nerveux central adulte (SNC) peuvent entraîner un handicap permanent en raison de mécanismes multiples qui limitent la repousse axonale 1 . Après une blessure, de nombreux axones CNS ne forment pas un nouveau cône de croissance et ne parviennent pas à monter une réponse régénératrice efficace 2 . En outre, les dommages et les tissus cicatriciels entourant les lésions du SNC inhibent de manière significative la croissance axonale 1 , 2 , 3 . Les thérapies actuelles pour favoriser la régénération du SNC après une blessure se sont concentrées sur l'amélioration du potentiel de croissance intrinsèque du neurone blessé et sur le masquage des inhibiteurs de l'extension axonale associée aux débris de myéline et à la cicatrice gliale 1 , 3 . Malgré cela, la capacité de régénérer les axones longs vers des cibles distantes et de former des synapses fonctionnelles appropriées reste sévèrement limitée 4 , 5 , 6 , 7 .

Dans le présent travail, les microbilles, la micromanipulation par pipette et les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour lancer rapidement, allonger et connecter avec précision de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Des travaux antérieurs ont montré que les perles revêtues de poly-D-lysine (PDL-beads) induisent une adhérence membranaire suivie par le regroupement des complexes de vésicules synaptiques et la formation de boutons presynaptiques fonctionnels 8 . Il a également été démontré que lorsque le cordon PDL s'écarte mécaniquement après la différenciation présynaptique, le groupe de protéines synaptiques suit le cordon, en initiant un nouveau neurite 9 . La procédure suivante exploite ce fait avec la capacité de culture des neurones embryonnaires de l'hippocampe de rats dans des régions organisées sur une lamelle en utilisant des dispositifs microfluidiques de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour renvoyer précisément un neuronecircuit.

Ces dispositifs microfluidiques PDMS sont non toxiques, optiquement transparents et se composent de deux chambres connectées par un système de microcanaux. Une fois assemblé sur une lamelle, chaque dispositif sert de moule pour guider la croissance neuronale et maintenir des cultures neuronales saines sur des motifs précis pendant plus de 4 semaines in vitro .

Ici, un cadre est présenté pour étudier les limites d'extension et de fonctionnalité du nouveau neurite. Des neurites nouveaux et fonctionnels sont créés et positionnés de manière à pouvoir (re) câbler des réseaux neuronaux de manière contrôlable. Les taux d'extension atteints sont supérieurs à 20 μm / min par rapport aux distances à l'échelle millimétrique et les connexions fonctionnelles sont établies. Ces résultats montrent, de façon inattendue, que la capacité intrinsèque de ces neurites pour l'allongement est beaucoup plus rapide qu'on ne le pensait auparavant. Cette approche mécanique proposée contourne les stratégies chimiques lentes et permet une connexion contrôlée à une cible spécifique. ThLa technique ouvre de nouvelles avenues pour l'étude in vitro de nouvelles thérapies pour restaurer la connectivité neuronale après une blessure. Il permet également la manipulation et le câblage des réseaux neuronaux pour étudier les aspects fondamentaux du traitement du signal neuronal et de la fonction neuronale in vitro .

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Protocole

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Toutes les procédures détaillées ci-dessous ont été approuvées par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et sont conformes aux lignes directrices du Conseil canadien des soins animaux.

1. Normalisation des cultures neuronales à l'aide de dispositifs microfluidiques: assemblage de périphériques

  1. Sélectionnez un périphérique microfluidique approprié pour l'expérience souhaitée. Pour connecter les neurones au sein d'une même population, utilisez Neuro Devices ( Figure 1 ) et pour connecter les neurones dans différentes populations, utilisez les Dispositifs de Co-Culture ( Figure 6 ).
  2. Nettoyez et préparez le nombre souhaité de lamelles stériles ou de plats de fond de verre. Pour obtenir de meilleurs résultats sur des surfaces en plastique, utilisez des plats de 35 mm, des verres de 25 mm ou des plats de fond de verre de 35 mm. Sélectionnez l'épaisseur du verre en fonction du système d'imagerie, par exemple 0,15 mm.
  3. Mettez la vaisselle ou les lamelles avec 0,5 à 1 ml de PDL 100 μg / mL pendant 2 h ou pendant la nuit à température ambianteAture.
    Remarque: Le protocole peut être mis en pause ici et reprendre le jour suivant si vous le souhaitez. En outre, les vaisselles peuvent être revêtues de PDL dilué par tampon de borate, de poly-L-lysine (PLL), de laminine ou de toute autre molécule d'adhésion cellulaire.
  4. Laver la vaisselle à deux reprises avec de l'eau (ne pas utiliser de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) car les cristaux de sel peuvent bloquer les canaux), enlever tout le liquide et laisser sécher dans un environnement stérile comme une armoire à biosécurité pendant 5-10 minutes ou jusqu'à La surface est complètement sèche.
    Remarque: Veillez à ce que les lamelles soient absolument secs, car tout liquide restant entrainera l'adhérence des systèmes microfluidiques.
  5. Placez des dispositifs microfluidiques avec des motifs orientés vers le haut sous la lumière UV dans un environnement stérile (armoire de sécurité biologique) pendant 10 min. Assurez-vous de suivre les procédures stériles lorsque vous travaillez dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques 10 .
  6. À l'aide de pincettes, placez un appareil microfluidique avec un motif orienté vers le bas en contact avec la housse propreIp / plat. Utilisez les pinces pour appuyer doucement sur l'appareil afin qu'il adhère au verre.
    Remarque: La transparence de la région adhérente sera visible lorsque vous regardez la lumière. Assurez-vous que tous les coins sont en contact avec le verre. Faites ceci pour tous les appareils microfluidiques. Voir la figure 1a .
  7. Pour remplir le dispositif de population unique avec un moyen, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 50 μL de milieu cellulaire complet complété par du B-27 sans sérum (rapport volumique 1:50) et 500 μg / mL de pénicilline / streptomycine / glutamine (collectivement Appelé NBM) au puits supérieur droit, puis ajoute 50 μL supplémentaires au puits en diagonale. Faites ceci pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s'écoule entre les puits. Ensuite, ajouter 50 μL de milieu aux 2 puits restants. Voir la figure 2a .
    1. Pour compléter le multiple de population avec un moyen, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 30 μLDe NBM complète sur les puits droits, se reporter à la figure 6a . Faites ceci pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s'écoule entre les puits. Ensuite, ajouter 50 μL de milieu aux 4 puits restants.
  8. Placez les appareils dans une plaque plus grande avec un plat ouvert avec de l'eau autoclavée (chambre humide) et placez-les dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité) pendant 1-2 h tout en préparant la culture cellulaire. Voir la figure 2b .

2. Galvanisation des neurones dans les systèmes microfluidiques

  1. Suivant le protocole décrit dans la Réf. 8 , obtenir des neurones disjoncteurs hippocampiques ou corticaux à partir d'embryons de rats Sprague Dawley (soit le genre).
  2. Ressusciter les neurones embryonnaires dans NBM à une concentration de 1 à 2 millions de neurones / mL. Vérifier les concentrations cellulaires au microscope en utilisant un hémocytomètre et après la référence 8 . Ajuster la concentration de cellule en accordG à la densité cellulaire souhaitée. Pour augmenter les chances d'obtenir des axones d'hippocampe individuels par canal, déposez 10 000 neurones par appareil. Pour avoir des axones multiples dans le même canal, déposez 60 000 neurones par périphérique.
    Note: Ces nombres varient en fonction du type neuronal utilisé.
  3. Retirez le support des dispositifs microfluidiques sans vidanger les puits. Laissez environ 5 μL dans chacun.
  4. Pour plaquer les cellules dans le dispositif de population unique, ajoutez 50 μL de NBM dans le puits inférieur droit. À ce stade, le fluide s'écoule lui-même pour remplir l'autre puits inférieur. Ajouter 20 μL de la solution de cellule concentrée dans le puits supérieur droit du dispositif microfluidique, comme indiqué sur la figure 1b .
    1. Pour les cellules de plaque dans le dispositif de population multiple, ajouter 20 μL de la solution de cellule concentrée dans chacun des puits droits de la figure 6a .
  5. Vérifier au microscope si les cellulesSont à l'intérieur des chambres et placez les appareils dans l'incubateur pendant 15 à 30 minutes pour favoriser la fixation des cellules sur le substrat.
  6. Vérifiez au microscope s'il y a suffisamment de cellules dans les chambres. Si d'autres sont nécessaires, répétez les étapes 2.4 et 2.5.
  7. Ajouter 50 μL de NBM aux 2 puits supérieurs du dispositif de population unique et 20 μL de NBM dans le même endroit que les cellules ont été injectées dans le dispositif de population multiple. Les médias dépassent légèrement pour former un ménisque positif donnant aux puits un aspect muffin top. Encore une fois, voir la figure 2a .
  8. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité.

3. Maintien des cultures neuronales

  1. Retirez NBM (environ 30 μL avec une pipette) à partir des cellules et appliquez un nouveau NBM préchauffé le jour suivant leur introduction aux appareils (soit 1 heure après l'étape 2).
  2. Vérifiez tous les 2 jours s'il y a suffisamment de moyen dans chaque voie. Si le muffin tOp est bas, ajoutez simplement plus de puits au puits supérieur.
  3. Cellules de culture pendant au moins 7 jours avant l'élimination des dispositifs microfluidiques. Les cellules peuvent survivre dans ces dispositifs pendant plusieurs semaines. Retirez les appareils 1-2 jours avant que les expériences ne soient effectuées sur des échantillons.

4. Suppression des dispositifs microfluidiques

  1. 1 - 2 jours avant l'élimination des dispositifs microfluidiques, ajouter 2 mL de NBM préchauffé à 37 ° C à chaque échantillon de plat, inonder les chambres et maintenir les dispositifs dans l'incubateur.
  2. Utilisez des pinces stériles et une pointe pour enlever les dispositifs microfluidiques des lamelles en laissant une configuration à motifs des neurones. Utilisez la pointe pour maintenir la lamelle en place et la pincette pour serrer le bord de l'appareil dans le coin inférieur gauche du puits. Appliquer délicatement la torsion, soulever le dispositif avec la pince à épiler afin de retirer la lamelle. Voir la figure 2c - 2d .
  3. Tous les 2-3 jours, remplacer haSi le NBM jusqu'à ce que l'échantillon soit utilisé pour des expériences.
  4. Avant d'effectuer des expériences de ré-câblage sur l'échantillon, vérifiez que les neurites dans les canaux de la population unique et les populations neuronales dans le dispositif de population multiple sont isolées en examinant les lacunes entre elles au microscope pour s'assurer qu'il n'y a pas de filaments reliant les populations neuronales.

5. Préparation des perles revêtues de PDL

  1. Ajouter 2 x 50 μL de gouttes de perles de polystyrène 4, 10 ou 20 μm diluées dans de l'eau (1: 500) à 1 mL de PDL (100 μg / mL). Laissez pendant au moins 2 h à température ambiante.
    Remarque: Le protocole peut être interrompu ici et repris le lendemain.
  2. Centrifuger la solution à 8 820 xg pendant 1 min. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber les perles accumulées au fond du récipient.
  3. Laver les billes deux fois avec 1 mL de solution 10 mM HEPES pH 8.4 stérile.
  4. Remettre en suspension les billes revêtues de PDL dans 200 ml d'HEPES 10 mM pH 8,4Solution.

6. Préparation des micropipettes

  1. Préparez des pipettes à partir de tubes capillaires en verre (1 mm de diamètre intérieur, 1,5 mm de diamètre extérieur) à l'aide d'un extracteur d'électrode horizontal. Réglez les réglages afin que la pointe externe de la micropipette tirée soit ~ 2-5 μm. Avant de tirer, assurez-vous que les tubes de verre sont propres.
  2. Fixez les pipettes aux diapositives de verre pour le stockage et assurez-vous que la pointe ne contacte pas la surface de la glissière car la pointe est fragile. Conserver à température ambiante dans un récipient couvert pour protéger contre la poussière. Utilisez les pipettes le même jour où elles sont tirées.

7. Adhésion PDL-perle aux neurones

  1. Ajouter 40 à 60 μL de billes revêtues de PDL préparées à l'étape 5 à une culture cellulaire préparée à l'étape 4. Centrer la pointe de pipette sur les neurones, qui sont légèrement visibles sur la lamelle, et ajouter les perles (voir la figure 3 ).
  2. Retourner l'échantillon à l'incubateur pendant 1 h pour favoriser la formation de syContacts naptiques 8 , 9 .
  3. Après l'incubation, retirer les billes non adhérentes en lavant doucement la culture avec NBM préchauffé.

8. Préparation de la solution saline physiologique (pour les expériences de température ambiante)

  1. Préparer une solution saline physiologique en combinant les ingrédients énumérés dans les références 7 , 8 . Il s'agit de réguler l'environnement cellulaire en dehors de l'incubateur.
  2. Vérifier l'osmolarité et les niveaux de pH comme indiqué dans les références 7 , 8 .
  3. Infléchir continuellement la solution avec O 2 pour minimiser les fluctuations de pH tout en effectuant des expériences.
  4. Chauffer à température ambiante.
  5. Mettre en place le système de perfusion en insérant une extrémité d'un tube en plastique (dimensions facultatives) dans une solution physiologique infiltrée par O 2 et en fixant l'autre eNd à une aiguille insérée dans le porte-échantillon. Placez le tube et la solution plus haut que l'échantillon (voir la figure 4 ).
    1. Débranchez le tube de l'aiguille et connectez-le à une seringue. Utilisez la seringue pour exercer une pression et tirer du liquide, en remplissant le tube. Sceller avec une pince à rouleaux et reconnecter l'aiguille.

9. Micromanipulation de perles

  1. Installez l'échantillon dans une configuration expérimentale de telle sorte que les cellules puissent être accédées par le haut par deux micropipettes montées dans des micromanipulateurs et accessibles optiquement ci-dessous, par exemple avec l'objectif de phase 40X (ouverture numérique de 0,6) d'un microscope optique inversé. Dans cette configuration, montez une caméra CCD pour la capture d'image sur le port latéral du microscope. Connectez chaque pipette à des seringues de 1 mL via des tubes en plastique. À cette étape, remplacer NBM par une solution saline physiologique (1-2 mL) (voir la figure 4 ).
  2. Au cours de l'expérience, Perfusionner continuellement des cellules avec la solution saline physiologique préparée à l'étape 8 à une vitesse de 0,5 à 1 ml / min.
  3. Sélectionnez un PDL-bead non attaché à un neurone dans le champ de vision. Alignez le cordon avec une pointe de micropipette en concentrant sur le cordon puis sur la micropipe. Apportez la pointe le plus près possible du cordon en le surveillant au microscope.
  4. Appliquer une pression négative avec la seringue de 1 ml connectée à la pipette pour retirer le cordon. Maintenir une pression négative tout au long de l'expérience.

10. Tirant les neurones

  1. Sélectionnez un tampon PDL attaché à un neurone dans le champ de vision et attachez-le à la deuxième micropipette à l'aide d'une aspiration comme décrit aux étapes 9.3 à 9.4.
  2. Tirez le complexe PDL-bead-neuron par lentement (~ 0,5 μm / min) en déplaçant le micromanipulateur ou l'échantillon en 1 μm et en pause pendant 5 minutes pour permettre l'initiation des neurites.
  3. Répétez l'étape 10.2 deux fois.
    Note: Les 3 premiers &# 181; m doit être tiré très lentement pour garantir le succès expérimental, qui se produit plus de 95% du temps.
  4. Tirez le complexe PDL-bead-neuron par lentement (~ 0,5 μm / min) en déplaçant le micromanipulateur ou le stade de l'échantillon de 2 μm et en pause pendant 5 minutes pour permettre l'allongement des neurites.
  5. Après une initiation réussie et une extension des neurites pour les premiers 5 μm, tirez le neurite à 20 μm / min sur des distances à l'échelle millimétrique.
    Remarque: Le tirage peut être effectué en continu ou en étapes et à des taux variables. Voir la figure 5b -5c .

11. Raccordement des neurones

  1. Sélectionnez une région riche en neurites et abaissez le complexe PDL-bead-neurite afin qu'il s'en fasse physiquement. Utilisez d'autres perles pour évaluer la hauteur de la pointe au-dessus de la surface de la lamelle. Voir la figure 5d .
  2. Laisser le complexe PDL-bead-neurite en contact avec le neurite cible tout en manipulant le deuxième micropiPette. Abaisser la deuxième pipette avec le deuxième tampon PDL sur le nouveau neurite nouvellement formé, environ 20 μm du premier bourrelet. Utilisez le deuxième tampon PDL pour pousser le nouveau filament de neurite vers la cellule cible.
  3. Tenez les deux perles en place pendant au moins 1 h. Vérifier l'absence de gonflement focal, un épaississement des neurites en contact avec le cordon, au microscope 16 .
  4. Pendant ce temps, utilisez la perfusion pour changer lentement le milieu de l'échantillon de la solution saline physiologique à la NBM pré-réchauffée et équilibrée de CO 2 .
  5. Relâchez le cordon de la deuxième pipette en relâchant l'aspiration. Si le nouveau neurite reste attaché, relâchez également le premier cordon. Voir la figure 5e .
  6. Retirez doucement la solution saline et remplacez-la par NBM (~ 2 mL).
  7. Remettre soigneusement l'échantillon dans l'incubateur pour renforcer la connexion neuronale pour les expériences futures. Cette connexion est stable pour> 24 h 7 .

12. Vérification de la fonctionnalité de la nouvelle connexion via des enregistrements de pinces à patchs à puces intégrés

  1. Suivez les références 7 , 18 , 19 . Pour assembler une installation d'électrophysiologie.
  2. Suivre les références 7 . Pour préparer les électrodes pré et post-synaptiques.
  3. Rassembler les données de pince de patch, à nouveau suivant les références 18 , 19 .
  4. Comparez les résultats avec les signaux naturels 7 pour déterminer le type de connexion.

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Résultats

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Les neurones hippocampiques du rat embryonnaire sont cultivés dans des dispositifs microfluidiques pour permettre un positionnement précis des cellules, des puces PDL et des micromanipulateurs. La première étape consiste à assembler correctement l'appareil microfluidique sur une lamelle ou un plat en verre. Il est essentiel que le dispositif microfluidique soit bien attaché au substrat pour éviter que les cellules quittent les chambres et ne se déplacent sous les parties du dispositif qu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant une micromanipulation standard et des dispositifs microfluidiques innovants, une nouvelle technique a été développée pour initier, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de grandes distances. La micromanipulation par pipette est un outil commun dans la plupart des laboratoires de neurosciences 4 , 13 . Le véritable défi pour obtenir des résultats reproductibles et fiables était la normalisation de cu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'auteur Margaret H Magdesian est le PDG d'Ananda Devices qui produit des instruments utilisés dans cet article.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Yoichi Miyahara pour de nombreuses discussions et idées utiles. MA et PG reconnaissent le financement du CRSNG.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dispositifs de co-cultureAnanda DevicesDisponible dans le commerce chez http://www.anandadevices.com
Dispositifs neurologiquesAnanda DevicesDisponible dans le commerce chez http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm RoundWarner Instruments64-0705
35 mm Plats à fond en verre #0, non revêtus, irradiés aux rayons gammaMatTex IncorporationP35G-0-20-C
Boîte de culture cellulaire de 35 mm, apyrogène, stérileCorning Inc430165 boîte de
Pétri de 95 mm x 15 mm, couvercle coulissant, polystyrène stérileFisherbrandFB0875714G
50 mL Tubes à centrifuger avec graduations imprimées et bouchons platsVWR89039-656
Tube conique en polypropylène de 15 mL, style 17 x 120 mm, apyrogène,faucon stérile
Neurobasal Medium LifeTechnologies21103-049Solution extracellulaire
B-27 Supplément (50X),supplément B-27 sans sérum (50X), sérum sans 17504044Solution extracellulaire
Penniciline, streptomyocine, glutamineThermo Fisher Scientific  ;11995-065Solution extracellulaire
200 &mu ; L PipettorsVWR89079-458
2 - 20 &mu ; L PipettorsEmbouts Résistants aux Aérosols2149P
BD Falcon 3mL Pipettes de Transfert [Non Stériles]BD Falcon357524
GlucoseGibco15023-021Solution extracellulaire
HEPESSigma7365-45-9Solution extracellulaire/Perles
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Solution extracellulaire
KClSigma-Aldrich7447-40-7Solution extracellulaire
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Solution extracellulaire
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Solution extracellulaire
#5 Dumont Dumostar Pince à épiler 11 cmWorld Precision Instruments500233
Outils de dissectionBraun, Aesculap
Poly-D-lysine HydrobromureSigma-AldrichP6407
Microparticules à base de polystyrène, 10 &mu ; mSigma-Aldrich72986
Tubes borosilicatésKing Precision Glass, Inc.14696-2
Extracteur de pipette horizontalSutter InstrumentsMicromanipulateurs P-97
, série PCS-5000Instruments SDMC7600R
1 mL SeringueBD Luer-Lok309628
Microscope inverséOlympus  ;IX71
ObjectifOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
Caméra CCDPhotométrieCascade II : 512
Leibovitz (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Dissection
rats Typsin-EDTA (0,05 %), Phenol redLife Technologies25300054Dissection
de ratsDMEM (1x) Dulbecco’s Modified Eagle Medium [+4,5 g/L de D-glucose, + L-glutamine, + 110 mg/L de pyruvate de sodium]Life Technologies11995-065Dissection de rats
HBSS (1x) Hank’s Balanced Salt Solution [- Chlorure de calcium, - Chlorure de magnésium, - Sulfate de magnésium]Life Technologies14170-112Dissection de rats
352097à flamme brune de

Références

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