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Article de méthode

Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

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DOI :

10.3791/55715

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17 mai 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour isoler et cultiver des rudiments métasphoriques à partir d'embryons de souris.

Résumé

Le but de ce protocole est de décrire une méthode de dissection, d'isolement et de culture des rudiments métanéphriques de souris.

Au cours du développement du rein des mammifères, les deux tissus progéniteurs, le bourgeon urétéral et le mésenchyme métasphorique, communiquent et induisent réciproquement des mécanismes cellulaires pour former éventuellement le système collecteur et les néphrons du rein. Au fur et à mesure que les embryons de mammifères se développent par voie intra-utérine et qui sont inaccessibles à l'observateur, une culture d'organe a été développée. Avec cette méthode, il est possible d'étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses et le comportement cellulaire pendant l'organogenèse rénale. En outre, l'origine des malformations rénales congénitales et des voies urogénitales peut être étudiée. Après une dissection minutieuse, les rudiments métanéphriques sont transférés sur un filtre qui flotte sur un milieu de culture et peuvent être conservés dans un incubateur de culture cellulaire pendant plusieurs jours. Cependant, il faut savoir que les conditions sontArtificielle et pourrait influencer le métabolisme dans le tissu. En outre, la pénétration des substances d'essai pourrait être limitée en raison de la matrice extracellulaire et de la membrane basale présents dans l'explant.

Un des principaux avantages de la culture des organes est que l'expérimentateur peut avoir un accès direct à l'organe. Cette technologie est peu coûteuse, simple et permet un grand nombre de modifications, telles que l'ajout de substances biologiquement actives, l'étude des variantes génétiques et l'application de techniques avancées d'imagerie.

Introduction

Le rein de mammifère est dérivé de deux structures primordiales d’origine mésodermique : le bourgeon urétéral épithélial tubulaire et le mésenchyme métanéphrique. Lors de la néphrogenèse, le bourgeon urétéral envahit le mésenchyme métanéphrique et se ramifie pour former le système collecteur. Le mésenchyme métanéphrique donne naissance aux éléments épithéliaux des néphrons. Ces processus se produisent de manière précisément chronométrée et spatialement coordonnée et sont initiés par des mécanismes inductifs réciproques. Les deux composants tissulaires communiquent et affectent la morphogenèse cellulaire de l’autre.

Dans les années 1920, c’est Boyden qui a réalisé l’obstruction in vivo du canal mésonéphrique chez le poulet, fournissant la première indication d’interactions inductives lorsque les blastèmes néphriques séparés ne parviennent pas à différencier1. À peu près à la même époque, les premières tentatives réussies de culture de rudiments néphriques de poulet dans une goutte suspendue ont été publiées. Par la suite, la culture d’organes a été développée pour étudier les interactions tissulaires dans l’organogenèse des mammifères. Dans les années 1950, Grobstein a mis au point une technique dans laquelle des rudiments métanéphriques pouvaient être cultivés sur un filtre. Cette technique a été modifiée par Saxén, qui a placé le filtre sur un écran de type Trowell dans une parabole de culture1. Au fil des ans, de nombreuses modifications et applications de la culture d’organes ont émergé. La méthode décrite ici est basée sur la technique de Saxén mais est simplifiée, car les filtres flottent librement sur le milieu et le diamètre du puits de culture dépasse à peine le diamètre du filtre, limitant ainsi les mouvements indésirables du filtre.

La culture d’organes entiers est un outil classique, bon marché et simple mais puissant pour étudier les processus cellulaires et la communication intercellulaire au cours de l’organogenèse. La culture d’organes permet de traiter avec des agents biologiques, tels que des facteurs de croissance, des anticorps, des oligonucléotides antisens, des virus et des peptides, ainsi qu’avec des composés pharmaceutiques et d’autres produits chimiques. De plus, la fonction des gènes peut être étudiée à l’aide d’explants dérivés de souris génétiquement modifiées ou à l’aide d’une technologie d’inactivation génique inductible, telle que le système Cre-loxP. Cela permet d’étudier les mutations génétiques qui causent la létalité embryonnaire avant le développement du rein. La culture d’organes peut également être combinée avec un marquage fluorescent pour le traçage de la fonction des gènes ou de la lignée et des techniques d’imagerie modernes, qui permettent une surveillance en temps réel du comportement cellulaire 2.

Dans l’exemple spécifique fourni ici, l’effet de la signalisation du récepteur Eph activé par EphrinB2 sur la morphologie ramifiée du bourgeon urétéral a été étudié. La morphologie des souris EphA4/EphB2 à double knock-out suggérait plusieurs défauts graves dans le développement des reins, qui étaient détectables dès le 11e jour embryonnaire (E11) et impliquaient le bourgeon urétéral, l’uretère et le canal néphrique commun3. La signalisation via les récepteurs Eph nécessite le regroupement du dimère-récepteur ligand4. Pour suractiver la signalisation Eph, les rudiments rénaux d’embryons de souris E11.5 ont été cultivés en présence d’EphrinB2-Fc recombinante groupée. L’éphrine B2 est un ligand connu pour le récepteur EphA4, qui est exprimé dans les extrémités des bourgeons urétéraux3.

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Protocole

Les souris ont été maintenues selon la réglementation suédoise et la législation de l'Union européenne (2010/63 / UE). Toutes les procédures ont été effectuées selon les directives du Comité suédois d'éthique (permis C79 / 9, C248 / 11 et C135 / 14). Les procédures à l'Université de Heidelberg portant sur des matières animales ont été approuvées par le Regierungspräsidium Karlsruhe et les agents de protection des animaux à l'Université de Heidelberg.

1. Préparation des réactifs et des matériaux pour la culture

REMARQUE: Utilisez un capot à flux laminaire pour minimiser la contamination.

  1. Le jour de la dissection, la protéine d'éphrine chimère recombinante Fc seule ou recombinante est fusionnée à Fc humaine en la mélangeant avec des anticorps contre la chèvre Fc anti-humains à un rapport molaire de 1: 5 dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Incuber pendant 1 h à 37 ° C 5 .
  2. Préparer le milieu de culture en complétant l'Eagle Eagle modifié par Dulbecco: NutrientMélange F-12 (DMEM / F12) avec 1% de pénicilline / streptomycine (v / v), 1% de glutamine (v / v), 1% d'insuline-transferrine-sélénium (v / v), 50 μg / mL d'holo- La transferrine et 1,5 μg / ml d'amphotéricine.
    REMARQUE: 10 ml de milieu sont suffisants pour 16 embryons.
  3. Ajouter une solution d'éphrine recombinante en grappe à une concentration finale de 20 μg / ml sur le milieu de culture. Utilisez le Fc humain en cluster comme contrôle.
  4. Préparer des plaques de culture en ajoutant 500 μl de milieu de culture à chaque puits d'une plaque stérile, non revêtue, à base de polystyrène à fond plat et à 4 puits.
  5. En utilisant des pinces stériles, placez soigneusement un filtre à membrane en polycarbonate avec une taille de pore de 5 μm par puits sur le dessus du milieu. Transférer la plaque préparée à l'incubateur (37 ° C / 5% de CO 2 ). Assurez-vous que le filtre reste sec sur la surface supérieure et les flotteurs.
    REMARQUE: Un filtre suffit pour deux anilènes rénaux.
  6. En utilisant une lame de rasoir, couper environ 30 pointes de pipette (volume: 100 μL) approximatelY 1 mm de la pointe pour aboutir à une ouverture plus large. Placez les embouts dans une crémaillère à pipette.

2. Dissection de Rudiments Metanephriques à E11.5

  1. Sacrifiez une souris enceinte chronométrée à E11.5 par dislocation cervicale (ou utilisez une méthode approuvée par le comité local d'éthique).
  2. Supprimer l'utérus et les embryons, comme décrit par Brown et al 6 . Sur ce point, travailler sous un microscope à dissection.
  3. En utilisant la pince à horlogerie n ° 5, couper l'embryon directement sous les pattes antérieures. Utilisez un plat de Petri frais pour chaque embryon. Retirer les jambes et la queue de l'embryon. Pour ce faire, prenez le tissu à enlever avec une paire de pince à horlogerie n ° 5 et utilisez les pointes d'une deuxième paire pour couper.
  4. Pour enlever la masse d'organe ventrale, utilisez les pointes d'une pince pour ouvrir latéralement la paroi du corps de l'embryon dans une direction rostrale à caudale.
    1. Couper superficiellement, parallèlement à tL'aorte dorsale. Utilisez l'aorte dorsale remplie de sang et donc visible pour l'orientation. Séparez soigneusement la partie ventrale de la paroi du corps de la partie dorsale en utilisant les pointes de la pince fermée et retournez l'embryon. Coupez la paroi du corps latéralement dans une direction rostral à caudale et utilisez l'aorte dorsale pour l'orientation, comme pour le côté précédent.
  5. Une fois que la paroi du ventral a été séparée du corps dorsal, saisissez-la avec une paire de pince et tirez soigneusement pour l'enlever, avec la masse de l'organe.
    REMARQUE: l'anilène métanéphrique reste habituellement attaché à la paroi du corps dorsal. Ce sont des structures ovales, de 200 μm de long situées au niveau des membres postérieurs.
  6. Tenez la paroi du corps dorsal avec une paire de pince, avec le côté ventral vers le haut. À l'aide de l'autre pince, saisissez l'aorte dorsale à son extrémité rostrale et épluchez soigneusement l'aorte dorsale de la paroi du corps dorsal.
    NOTE: Les deux reins métasphériques restent habituellement attachésÀ l'aorte dorsale.
  7. À l'aide d'une paire de pinces, coupez vers le riz anlagen pour éliminer l'aorte. Ensuite, séparez soigneusement les deux anols du rein en utilisant les pointes de la pince.
  8. Éloignez soigneusement les tissus indésirables du rein anlagen en utilisant les pointes de la pince. Veillez à ne pas endommager le mésenchyme, car les dommages peuvent entraîner une mauvaise croissance et l'exclusion de l'explant à partir d'analyses ultérieures.
  9. Transférer le rein anlagen séparément à l'aide d'une pipette à microlitres et d'une pointe de pipette large-ouverte dans 10 μL de PBS au filtre à membrane en polycarbonate dans une plaque à 4 puits.
    REMARQUE: En raison de la tension de surface, l'explant sera recouvert d'une mince couche de milieu. Un filtre suffit pour deux anilènes rénaux.
    1. Placez chacun des deux anilènes rénaux au centre de chaque moitié respective du filtre. Transférer la plaque à l'incubateur à 37 ° C / 5% de CO 2 . Laisser la plaque dans l'incubateur jusqu'à ce que la rud metanephricLes imites du prochain embryon sont prêtes à être placées sur le filtre.
  10. Répétez les étapes 2.3-2.9.1 pour chaque embryon.
    REMARQUE: avec une certaine pratique, la procédure de dissection prend environ 5 min par embryon.
  11. Incuber le rein anlagen pendant 3 jours à 37 ° C / 5% de CO 2 .

3. Préparation des réactifs pour la fixation et la coloration

  1. Pour préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS sans calcium et magnésium (p / v), dissoudre le PFA à 60 ° C dans du PBS, en agitant continuellement. Refroidissez à température ambiante et utilisez un filtre en papier pour enlever les particules restantes. Aliquote et conservez à 4 ° C pour une utilisation immédiate ou un gel pour un stockage à long terme.
    ATTENTION: le PFA est toxique. Portez l'équipement de protection individuelle spécifié dans les normes de sécurité locales et travaillez dans une hotte aspirante. Jeter les déchets en suivant les directives institutionnelles et en utilisant les conteneurs de déchets désignés.
  2. Pour préparer une solution de perméabilisation, diluer Triton X-100Dans du PBS sans calcium et magnésium à 0,3% (v / v).
  3. Pour préparer une solution de blocage, ajouter 5% (v / v) de sérum de chèvre et 0,1% de Triton X-100 à PBS sans calcium et magnésium. Ajouter de l'azoture de sodium à une concentration finale de 0,02% (p / v). Conserver à 4 ° C.
    ATTENTION: L'azide de sodium est toxique. Manipuler l'azide de sodium conformément à la réglementation locale sur la sécurité et la protection de l'environnement.
    NOTE: Lorsque vous utilisez des anticorps pour la coloration, utilisez un sérum de 5% parmi les espèces dont l'anticorps secondaire a été dérivé pour obtenir une solution de blocage.
  4. Diluer l'agglutinine biotinylée de Dolichorus biflorus 1: 200 dans la solution bloquant. Diluer la streptavidine conjuguée Alexa488 1: 200 dans la solution de blocage.
  5. Pour préparer un milieu d'incorporation prêt à l'emploi (voir la table des matériaux), ajouter 0,1 g de mucoadhésif à base d'alcool polyvinylique à l'eau / ml à 25% (p / v) de glycerol dans du Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Chauffer à 50 ° C sous agitation continue pendant 1 h, refroidir et régler le pH à 8,0-8,5 en utilisant 1M NaOH. Évitez les concentrations de NaOH plus élevées. Ajouter 100 μg / mL de N-propylgallate et thimerosal à une concentration finale de 0,02% (p / v). Mélanger pendant 30 minutes à température ambiante.
    ATTENTION: Le thimerosal est toxique. Manipulez-le conformément à la réglementation locale sur la sécurité et la protection de l'environnement.
    1. Remplissez le milieu d'incorporation dans des tubes de 50 ml, équilibrez le rotor et centrifugez à 3,200 xg et la température ambiante pendant 10 min. Décrivez la solution transparente dans des tubes de 15 mL et jeter la pastille. Aliquotez et conservez à -20 ° C pendant plusieurs semaines. Une fois décongelée, maintenir la solution à 4 ° C. Chaud à ~ 30 ° C immédiatement avant utilisation.
  6. Préparez autant de diapositives en verre que les filtres avec des explants doivent être montés. Pour cela, collez deux petits lamelles, 18 x 18 mm, de chaque côté de la glissière en verre à l'aide d'un adhésif instantané, laissez un espace de ~ 15 mm pour le filtre entre les deux.

4. Fixation et coloration

  1. Après une période de culture de 3Jours in vitro (div), retirer les plaques de l'incubateur et aspirer soigneusement le milieu de culture de chaque puits à l'aide d'une micropipette. Assurez-vous de ne pas toucher le filtre et de garder la pointe en direction de la paroi du puits.
  2. Ajouter 500 μL de PFA à 4% / PBS à chaque puits. Les filtres flottent sur le fixateur. À l'aide d'une micropipette, ajoutez soigneusement le fixateur PFA pour immerger les filtres. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
    REMARQUE: Pour toutes les étapes suivantes, il faut prendre soin de ne pas laver les explants du filtre. Gardez l'ouverture de la pointe de la pipette vers le mur du puits.
  3. Retirez le PFA et rincez deux fois avec 500 μL de PBS, en immergeant le filtre. Ajouter 500 μL de solution de perméabilisation à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
  4. Rincer deux fois avec 500 μL de PBS et ajouter 500 μl de solution bloquant à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
  5. Remplacez la solution de blocage par250 μL d'agglutinine biotinylée de Dolichorus biflorus diluée à 1: 200 dans une solution bloquant et incubée à 4 ° C pendant 24 h.
  6. Enlever la solution d'agglutinine Dolichorus biflorus et rincer deux fois avec 500 μL de PBS par puits.
  7. Ajouter 250 μL de streptavidine conjuguée avec Alexa488 dilué 1: 200 dans la solution de blocage et incuber à 4 ° C pendant 24 h. Alternativement, incuber à température ambiante pendant 2 h.
    REMARQUE: Un meilleur rapport signal / bruit est obtenu lorsque l'on incube à 4 ° C.
  8. Rincer deux fois avec 500 μL de PBS par puits. En utilisant une pince, transférez les filtres sur les lames de verre préparées, avec les explants vers le haut. Monter avec ~ 50-100 μL de support d'encastrement. Couvrir avec des lamelles de 60 mm de long n ° 1.5. Laisser la solution du milieu d'incorporation se solidifier pendant 2 h à température ambiante dans l'obscurité. Procédez à l'imagerie ou rangez les diapositives, emballées dans du papier d'aluminium, à 4 ° C jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'image.
  9. Image avec un microscope épifluorescent large champ 7 </ Sup> couplé à une lampe Hg et utiliser une unité miroir pour l'excitation bleue (passe-bande d'excitation, 460 - 495 nm, miroir dichromatique, 505 nm et bande passante d'émission, 510 à 550 nm) et 20X lentilles Plan-Apochromat, 0,75 numériques ouverture.

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Résultats

L'anlagen rénale métasphorique a été dérivé de souris enceintes enceintes Black-6 chez E11.5 et ont été cultivées. Après 3 jours, le bourgeon urétéral s'est ramifié jusqu'à 5 fois, entraînant une ramification du bourrelet urétéral initialement en forme de T. Chaque explant a été photographié et les nombres de segments et de points d'extrémité ont été quantifiés pour déterminer les générations de ramifications et pour calculer le nombre de points d'extrémité par branch...

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Discussion

Ce manuscrit décrit une méthode pour isoler l'anlagen méthanephrique en développement de l'embryon de souris et pour cultiver les rudiments d'organes. Cette méthode est une technique standard, développée par Grobstein 8 et Saxén 9 , 10 , et a été adaptée et modifiée par beaucoup d'autres 11 , 12 . Le succès de la méthode dépend principalement de la durée de la diss...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs remercient Leif Oxburgh et Derek Adams de partager généreusement leurs connaissances, Leif Oxburgh pour les commentaires utiles sur le manuscrit, et Stefan Wölfl et Ulrike Müller pour leur soutien technique et Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer et Viola Mayer pour l'aide dans le laboratoire. Ce travail a été soutenu par Development, The Company of Biologists (to CP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140148
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061
DPBS, calcium, magnésiumThermo Fisher Scientific14040117utilisation pour la dissection
holo-Transferrine humaineSigma-AldrichT0665
Insuline-Transtransferrine-Sélénium (ITS -G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
Amphotéricine B solutionSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Azoture de sodiumSigma-AldrichS8032
ThimérosalSigma-AldrichT5125
Gallate de propyleSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GlycérolSigma-AldrichG5516
Biotinylé Dolichorus Biflorus AgglutininVector LaboratoriesB-1035
Alexa488 conjuguée StreptavidineJackson Immuno Research016-540-084
Souris recombinante Ephrin-B2 Fc Chimère Protein, CFR& D Systems496-EB
Recombinant Humain IgG1 Fc, CFR& D Systems110-HG-100
Anticorps IgG Fc humains de chèvreR& D SystemsG-102-C
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphateSigma-AldrichP4417à utiliser pour la fixation et l’immunomarquage
Dumont #5, biologie
pointes, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PS2 paires de pinces sont nécessaires
Ciseaux à iris, droits, 12 cmagnthos.se03-320-120
Pince à pansements,
droite, délicate, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Boîtes de Pétri Nunclo Filtreà
Delta ; m, 13 mm, blanc, uniMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidishes
4 puits, fond plat		Sigma-AldrichD6789-1CS
Verre de protection de microscope 24 x 50 mm d’épaisseur. N°1.5H 0.17+/-0.005 mmnordicbiolabs107222
Lunettes de protection N°1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Lames ~76 x 26 x 1, 1/2-w. rectifié uninordicbiolabs1030418
VWR Razor BladesVWR55411-055
Tubes à centrifuger 50 mL Tubes à centrifugerSigma-AldrichCLS430828
15 mLSigma-AldrichCLS430055
Whatman, grade 113V, crêpéSigma-AldrichWHA1213125
Mircoscope de recherche à platine fixeOlympusBX61WI
Noir 6 souris consanguines, mâle, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Noir 6 souris consanguines, femelle, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Stéréomicroscope GreenoughLeicaLeica S6 E
membrane isopore 150679 TMTP01300 traité Nunclo Papier filtre qualitatif plissé

Références

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  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
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  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
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  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
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  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
  13. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

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