Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer une lignée chondrogénique à partir de sang périphérique humain (PB) via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant une méthode sans intégration, qui comprend la formation de corps embryoïde (EB), l'expansion des cellules fibroblastiques et l'induction chondrogénique.

Résumé

Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules sanguines périphériques (PBC) comme cellules de semences pour produire des chondrocytes via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une méthode sans intégration. Après la formation de corps embryoïdaux (EB) et l'expansion des cellules fibroblastiques, les iPSC sont induits pour la différenciation chondrogénique pendant 21 jours dans des conditions exemptes de sérum et exemptes de xénon. Après l'induction des chondrocytes, les phénotypes des cellules sont évalués par des analyses morphologiques, immunohistochimiques et biochimiques, ainsi que par l'examen quantitatif en PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique. Les granulés chondrogénés présentent une coloration au bleu alcien positive et au bleu de toluidine. L'immunohistochimie de la coloration au collagène II et X est également positive. La teneur en glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) et les marqueurs de différenciation chondrogénique COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 et AGGRECAN sont significativement régulés à la hausseGranulés rogéniques par rapport aux hiPSC et aux cellules fibroblastiques. Ces résultats suggèrent que les PBC peuvent être utilisés comme cellules de graines pour générer des iPSC pour la réparation du cartilage, ce qui est spécifique au patient et rentable.

Introduction

Le tissu cartilagineux a une très faible capacité d'auto-réparation et de régénération. Diverses interventions chirurgicales et traitements biologiques sont utilisés pour restaurer le cartilage et la fonction articulaire, avec des résultats insatisfaisants. Le développement récent de la technologie des cellules souches peut changer l'ensemble du champ de réparation du cartilage ¹ . Diverses cellules souches ont été étudiées comme cellules de semences, mais les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) semblent être le choix le plus prometteur, car elles peuvent fournir de nombreux types de cellules spécifiques du patient sans provoquer de réactions de rejet ² . En outre, ils peuvent surmonter la nature proliférante limitée des cellules adultes et maintenir leur auto-renouvellement et leurs capacités pluripotentes. En outre, le ciblage des gènes peut être utilisé pour changer le génotype pour obtenir des types spécifiques de chondrocytes.

Les fibroblastes ont été largement utilisés pour générer des iPSC car leurs potentiels de reprogrammation ont également été bien étudiés.Cependant, il reste encore des limites qui doivent être surmontées, telles que la biopsie douloureuse des patients et la nécessité d' une expansion in vitro des fibroblastes, ce qui peut entraîner des mutations génétiques ³ . Récemment, les PBC ont été jugés avantageux pour la reprogrammation ⁴ ; De plus, ils étaient couramment utilisés et stockés abondamment. Il est possible qu'ils puissent réorienter l'étude de la peau. Cependant, selon le meilleur de notre connaissance, il existe peu de rapports sur la reprogrammation du PBC suivi d'une différenciation en chondrocytes.

Dans l'étude actuelle, nous utilisons les PBC comme source alternative en les reprogrammes dans les iPSC, puis en différenciant les iPSC dans la lignée chondrogénique à travers un système de culture de pastilles afin d'imiter la formation de chondrocytes.

Protocole

Le protocole pour la génération de hiPSC des PBC peut être trouvé dans notre étude précédente ⁵ . L'étude a été approuvée par le Conseil d'examen institutionnel de notre institution.

1. Formation du corps embryoïde (EB)

1. Faire 50 mL de milieu HiPSC: Milieu Eagle modifié modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 15% de remplissage sérique knockout (KSR), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1 × acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol 55 μM, 2 mM L -glutamine et 8 ng / mL de facteur de croissance de fibroblastes basique (bFGF).
2. Faire un milieu de formation de 50 ml de EB: DMEM supplémenté avec 15% de KSR, 5% de FBS, 1x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et 2 mM de L-glutamine.
3. Faire 50 ml de milieu de culture basal: DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 1 x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et 2 mM de L-glutamine.
4. Préparez 10 ml de solution de solution, 1 mg / ml dans le DMEM éliminatoire.
5. CultuRe HiPSCs sur des boîtes de culture tissulaire de 60 mm avec des cellules nourricières ( c'est-à-dire une monocouche de cellules de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées). Lorsque les cellules sont confondues à 80-90%, dissociez les cellules avec dispase et passez les hiPSC 1: 3 tous les 4-5 jours. Placez les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO ₂ .
6. Dissectionnez les colonies hiPSC indifférenciées en morceaux plus petits (environ 50 à 100 μm de diamètre) à l'aide d'une aiguille en verre tirée par le feu lorsque les iPSC sont confluent de 80 à 90%. Généralement, utilisez des colonies hiPSC dans un plat de 60 mm pour générer des EB dans une boîte de Petri de 100 mm.
   1. Culturez moins de 100 petits morceaux de colonies dans une boîte de Petri 100 mm non adhérente contenant 10 ml de milieu de formation d'EB. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO ₂ .
7. Remplacer environ 25% du milieu initial par une quantité égale du milieu de culture basal tous les 2 jours. Inclinez le plat pour laisser les EB se déposer. Retirez délicatement 3 mLDu milieu supérieur et ajouter 4 mL de milieu de culture basal frais. Ne pas déranger les EB.
   NOTE: Les EB sont caractérisés morphologiquement par les morceaux de colonies, prenant une apparence ronde avec des bordures lisses au microscope.
8. Après 10 jours de culture dans la boîte de Petri non adhérente, recouvrir un nouveau plat de culture tissulaire de 100 mm avec 4 ml de gélatine à 0,1% pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation.
9. Transférer le milieu plus EB à partir d'une boîte de Petri 100 mm non adhérente à un tube conique de 15 ml. Laissez les EB sédimenter pendant 4-5 min. Aspirer soigneusement le surnageant et laisser moins de 0,5 ml de moyen plus EB
10. Émerger moins de 100 EB sur un plat de culture tissulaire de 100 mm, revêtu de gélatine, avec 10 ml de milieu de culture basal. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO ₂ .

2. Formation de pellets cellulaires et différenciation de chondrocytes

1. Faire 10 ml de trypsine 0,25% / acide éthylènediaminetétracétique (EDTA). Faire 80 mL de basAl: DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 1x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et L-glutamine 2 mM.
2. Faire 10 mL de milieu de différenciation chondrogénique: DMEM (glucose élevé) additionné de 10% de solution d'insuline-transferrine-sélénium (STI), 0,1 μM de dexaméthasone, 1 mM d'acide ascorbique, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng / mL de facteur de croissance transformant- Beta 1 (TGF-β1).
3. Rafraîchir le milieu avec 10 mL de milieu de culture basal après 48 h. Ensuite, rafraîchir le milieu tous les trois jours avec 10 mL de milieu de culture basal.
   REMARQUE: Après 10 jours de culture, les excroissances cellulaires fibroblastiques auraient dû se développer à partir des EB.
   1. Enduire les plats de 100 mm avec 4 mL de gélatine 0,1% pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation. Jeter le surnageant de cellules et laver les cellules avec la solution salée tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) une fois.
   2. Recueillir les cellules avec 3 ml de trypsine à 0,25% / EDTA à 37 ° C pendant 5 min et neutraliser à 4 mL de milieu de culture de base.
4. Dissociez les cellules en cellules simples en pipetant de 5 à 10 fois et en les passant par une maille de nylon de 70 μm. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 xg pendant 5 min. Re-semer les cellules sur un nouveau plat de culture de tissu revêtu de gélatine de 100 mm avec 10 ml de milieu de culture basal.
5. Rafraîchir le milieu avec 10 mL de milieu de culture basal après 48 h. Ensuite, rafraîchir le milieu tous les trois jours avec 10 mL de milieu de culture basal.
   NOTE: Les cellules acquièrent une morphologie homogène, fibroblastique.
6. Lorsque ~ 90-100% de confluence est atteinte ( c.-à-d. Environ 5-7 jours), récoltez les cellules avec 3 ml de trypsine / EDTA à 0,25% à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser avec 4 ml de milieu de culture basal. Dissocier les cellules en cellules simples en pipetant vers le haut et vers le bas 5 fois. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules.
   1. Placez 3 x 10 ⁵ cellules dans un tube de polypropylène de 15 ml. Centrifugeuse à 200 xgPendant 5 min à température ambiante (RT). Ré-suspendre les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation chondrogénique.
7. Récentrifuger les cellules à 300 xg pendant 3 min et maintenir les cellules sous forme de petites pastilles. Mettre le tube dans l'incubateur à 37 ° C et 5% CO ₂ pendant 21 jours. Ne pas visser fermement le couvercle et laisser échouer le gaz.
8. Remplacer 3/4 du milieu de culture tous les trois jours par un milieu de différenciation chondrogénique frais.
   REMARQUE: Après 21 jours de culture, on a formé des granulés chondrogéniques hiPSC (hiPSC-Chon). Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), comme témoin positif, sont également collectées et cultivées dans le milieu de différenciation chondrogénique pendant 21 jours pour former des granulés chondrogéniques (hMSC-Chon).

3. Analyse de la différenciation chondrogénique

1. Préparer 10 ml de 10% de formol tampon neutre.
2. Préparez 50 ml de réactif bleu alcien 0,1% et 50 ml de réactif bleu toluidine à 1%.
3. PrDépasser 1 ml des anticorps primaires: anticorps polyclonaux de lapin contre le collagène II (1:50) ou des anticorps monoclonaux de souris contre le collagène X (1:50). Préparer également des anticorps secondaires anti-lapin ou souris.
4. Faire 1 mL de solution de papaïne: 10 U / mL dans du PBS avec de l'acétate de sodium 0,1 M, de l'EDTA 2,4 mM et de la L-cystéine 5 mM.
5. Faire 100 ml de solution de colorant au bleu de diméthylméthylène (DMMB): 100 μL de 16 mg / l de 1,9-diméthylméthylène bleu, 40 mM de glycine, 40 mM de NaCl et 9,5 mM de HCl; PH 3.0.
6. Évaluer la différenciation chondrogénique par le bleu alcian et les taches bleues de toluidine des sections de pastilles.
   1. Réparez une pastille de HLPSC-Chon ou une pastille de HMSC-Chon dans 1 mL de 10% de formol tampon neutre pendant 24 h.
   2. Transférer la pastille à 1 ml d'éthanol à 70% dans de l'H ₂ O. Déshydrater la pastille avec 1 ml d'une série d'éthanol graduée ( c.-à-d., 25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 min chacun).
   3. Clarifier la pastille dans 1 mL de 100% de xylène trois fois. InfiltratE la pastille avec de la paraffine pendant 1 h dans un four à 65 ° C. Incorporer la pastille dans des blocs de paraffines avec un moule de base de 7 x 7 x 5 mm ³ , suivant des procédures histologiques de routine ⁶ .
   4. Faire des sections adjacentes par microtome avec une épaisseur d'environ 4 μm ⁷ . Adhérer les sections sur les lames de verre.
   5. Séchez les diapositives pendant 2 h à 60 ° C dans un four. Déparaffiner les sections en trois cycles (3 min chacun) en utilisant 100% de xylene.
   6. Utilisez une série d'alcool décroissante pour la réhydratation ( c.-à-d., 100, 100, 95, 95, 70, 50 et 25% en H ₂ O, 3 min chacun), puis effectuez un rinçage final avec de l'eau désionisée pendant 5 min.
   7. Tachez les sections avec 0,1% de réactif alcian bleu ou 1% de colorant au bleu de toluidine pendant 4-5 h, puis rincez-les avec de l'eau distillée.
   8. Déshydrate avec une série d'éthanol graduée ( c.-à-d., 25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 minutes chacune) suivie de trois st. ConsécutifsEps de clarification dans 100% de xylène. Monter les diapositives et les visualiser sous un microscope.
7. Effectuer l'immunohistochimie.
   REMARQUE: Des sections de pastilles supplémentaires sont encore évaluées par immunohistochimie.
   1. Après déparaffinisation et réhydratation, amener les diapositives à ébullition dans de l'EDTA 1 mM, pH 8,0 (imperméable à l'eau dans de l'eau bouillie par autoclave). Laissez-les reposer pendant 8 minutes à une température inférieure à l'ébullition, puis laissez les glissières refroidir à la température ambiante.
   2. Rincer les lames avec de l'eau désionisée 3 fois. Incuber les sections dans une solution à 3% de H ₂ O ₂ dans du methanol à la RT pendant 15 minutes pour bloquer l'activité de peroxydase endogène.
   3. Rincer les toboggans avec de l'eau désionisée et les immerger dans du DPBS pendant 5 min. Appliquer 50 à 100 μl d'anticorps primaire dilué (1:50) convenablement aux sections sur les lames, puis les incuber dans une chambre humidifiée à la température ambiante pendant 1 h.
   4. Lavez les diapositives 3 fois (5 minutes chacune) avec du DPBS. Incuber la saMâche avec les anticorps secondaires correspondants ( c. -à- d. Anti-lapin ou souris) pendant 15 minutes à la RT.
   5. Lavez les diapositives 3 fois (pendant 5 minutes chacune) avec du DPBS. Effectuer la détection DAB sous un microscope.
   6. Laver les diapositives avec DPBS 3 fois (2 minutes chacune). Contrôler les noyaux cellulaires en immergeant les glissières dans l'hématoxyline pendant 1 à 2 minutes. Déshydrater avec une série d'éthanol graduée (25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 min chacun) suivie de trois étapes consécutives de clarification avec du xylene. Enfin, montez les diapositives et visualisez-les sous le microscope.
8. Détecter le contenu sGAG.
   1. Recueillir des pastilles chondrogéniques dans une solution de papaïne à 60 ° C pendant 2 h.
   2. Déterminer le contenu d'ADN en utilisant le kit d'analyse de dsDNA et le système de fluoromètre. Mesurer le contenu sGAG en le mélangeant avec une solution de colorant DMMB sous une mesure d'absorbance à 525 nm ⁸ .
   3. Calculer la concentration de sGAG par rapport à une courbe standard deSulfate de chondroïtine de requin.
9. Effectuer l'analyse par PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique dans les granulés HiPSC-Chon.
   1. Récoltez 3-4 des mêmes granulés chondrogéniques en ajoutant 500 μL de réactif d'extraction glacé à un tube. Vortex à fond. Incuber l'échantillon pendant 5 min à la température ambiante.
   2. Ajouter 0,1 ml de chloroforme. Vortex l'échantillon pendant 15 s et incuber à la RT pendant 3 min. Centrifuger l'échantillon pendant 15 min à 12 000 xg et 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 250 μL) dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
   3. Ajouter 25 μl d'acétate de sodium et 1 μl de glycogène à l'échantillon. Précipiter l'ARN en le mélangeant avec 250 ul d'alcool isopropylique. Bien mélanger. Incuber l'échantillon à la température ambiante pendant 10 min.
   4. Centrifugez pendant 10 min à 12 000 xg et 4 ° C. Retirez complètement le surnageant. Laver la pastille d'ARN deux fois avec 500 μL d'éthanol à 75%.
   5. Centrifugeuse pendant 5 minÀ 7 500 xg et 4 ° C. Retirez l'éthanol restant et séchez à l'air libre la pastille d'ARN pendant 5 à 10 minutes. Dissoudre l'ARN dans 10 μL d'eau exempte de nuclease.
   6. Convertissez l'ARN en ADNc en utilisant un système de transcriptase inverse. Soumettre les échantillons d'ADNc à la PCR en temps réel en utilisant le mélange maître du kit qPCR (2x) et un système de PCR en temps réel ⁹ .
      NOTE: Les séquences d'amorces sont:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Résultats

Différenciation chondrogénique des hiPSC:

Le milieu de formation de EB et le milieu de culture basal ont été utilisés pour différencier les hiPSC dans la lignée de mésenchyme. Une méthode de culture multi-étapes a été utilisée ( figure 1 ). Tout d'abord, les hiPSC ont été spontanément différenciés via la formation d'EB pendant 10 jours (D10, Figure 2A ). Deuxièmement, le...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole pour générer des chondrocytes de PBC via iPSC. Étant donné que les PBC sont plus fréquents et largement utilisés dans le domaine clinique, ils sont présentés comme une alternative potentielle pour la reprogrammation. Dans cette étude, des vecteurs épisomaux (EV) ont été utilisés pour reprogrammer les PBC dans les iPSC, suivant la méthode établie par Zhang et al. ¹¹ . Cette approche sans intégration n'implique pas l'intégration de la génotoxicité...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Milieu basal utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB
Remplacement sérique knockout (KSR)	Invitrogen	10828028	Un complément de milieu plus défini, sans FBS, utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB
Sérum bovin fœtal (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB, offre une excellente valeur pour la cellule culture
Acides aminés non essentiels	Chemicon	TMS-001-C	Utilisé comme supplément de croissance dans tous les milieux de culture cellulaire, pour augmenter la croissance et la viabilité cellulaires
L-glutamine	Invitrogen	TMS-002-C	Un acide aminé nécessaire à la culture cellulaire
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)	Peprotech	100-18B	Une cytokine utilisée pour soutenir la pluripotence et l’auto-renouvellement des hiPSCs
Dispase	Invitrogen	17105041	Utilisé pour la dissociation des hiPSC pour la sous-culture
DMEM	Gibco	C11960	Milieu basal utilisé pour le milieu de culture MSC
0,1 % de gélatine	Millipore	ES-006-B	Utilisé pour la fixation des cellules sur les boîtes
0,25 % trypsine/EDTA	Gibco	25200072	Utilisé pour la dissociation cellulaire
DPBS	Gibco	14190250	Une solution saline équilibrée utilisée pour le lavage cellulaire ou un réactif préparant
2-mercaptoéthanol	invitrogen	21985023	Utilisé comme supplément de croissance dans tous les milieux de culture cellulaire.
ITS	invitrogen	41400045	Insuline, Transferrin, Solution de sélénium.Utilisé pour la différenciation chondrogénique.
Acide ascorbique	Sigma	4403	Connu sous le nom de vitamine C. Il aide à la croissance active et a des propriétés antioxydantes.
Pyruvate de sodium	Gibco 11360070		Ajouté au milieu de culture cellulaire comme source d’énergie en plus du glucose.
Facteur de croissance transformant-bêta 1	Peprotech	AF-100-21C	Une cytokine qui régule la prolifération cellulaire, la croissance et la différenciation chondrogénique.
Anticorps polyclonaux de lapin contre le collagène II	Abcam	ab34712	Cet anticorps réagit avec les collagènes de type II, qui sont spécifiques des tissus cartilagineux.
Anticorps monoclonaux de souris contre le collagène X	Abcam	ab49945	Cet anticorps réagit avec le collagène de type X, qui est un produit de chondrotocytes hyperthrophiques.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Pour le montage et le stockage à long terme des lames
Bleu de toluidine	Sigma	89640	Utilisé pour la détection des protéoglycanes.
Bleu Alcian	Amresco	#0298	Utilisé pour la détection des glucosaminoglycanes.
Papain	Sigma	P4762-25MG	Utilisé pour digérer les granulés chondrogènes.
Bleu de diméthylène	Sigma	341088-1G	Utilisé pour quantifier les glycosaminoglyans
Sulfate de chondroïtine sel de sodium du cartilage de requin	Sigma	C4384-250MG	Utilisé pour tracer la courbe standard pour la mesure de la teneur en sGAG.
Qubit dsDNA HS assay	kit Invitrogen	Q32851 (100)	Utilisé pour déterminer le contenu en ADN
TRIzol	Invitrogen	15596018	Utilisé pour l’isolement de l’ARN à partir de cellules
Système de transcriptase inverse	Promega	A3500	Utilisé pour convertir l’ARN en cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix	Kapa	KK4601	Utilisé pour la PCR en temps réel