Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer une lignée chondrogénique à partir de sang périphérique humain (PB) via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant une méthode sans intégration, qui comprend la formation de corps embryoïde (EB), l'expansion des cellules fibroblastiques et l'induction chondrogénique.

Résumé

Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules sanguines périphériques (PBC) comme cellules de semences pour produire des chondrocytes via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une méthode sans intégration. Après la formation de corps embryoïdaux (EB) et l'expansion des cellules fibroblastiques, les iPSC sont induits pour la différenciation chondrogénique pendant 21 jours dans des conditions exemptes de sérum et exemptes de xénon. Après l'induction des chondrocytes, les phénotypes des cellules sont évalués par des analyses morphologiques, immunohistochimiques et biochimiques, ainsi que par l'examen quantitatif en PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique. Les granulés chondrogénés présentent une coloration au bleu alcien positive et au bleu de toluidine. L'immunohistochimie de la coloration au collagène II et X est également positive. La teneur en glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) et les marqueurs de différenciation chondrogénique COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 et AGGRECAN sont significativement régulés à la hausseGranulés rogéniques par rapport aux hiPSC et aux cellules fibroblastiques. Ces résultats suggèrent que les PBC peuvent être utilisés comme cellules de graines pour générer des iPSC pour la réparation du cartilage, ce qui est spécifique au patient et rentable.

Introduction

Le tissu cartilagineux a une très faible capacité d'auto-réparation et de régénération. Diverses interventions chirurgicales et traitements biologiques sont utilisés pour restaurer le cartilage et la fonction articulaire, avec des résultats insatisfaisants. Le développement récent de la technologie des cellules souches peut changer l'ensemble du champ de réparation du cartilage ¹ . Diverses cellules souches ont été étudiées comme cellules de semences, mais les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) semblent être le choix le plus prometteur, car elles peuvent fournir de nombreux types de cellules spécifiques du ....

Protocole

Le protocole pour la génération de hiPSC des PBC peut être trouvé dans notre étude précédente ⁵ . L'étude a été approuvée par le Conseil d'examen institutionnel de notre institution.

1. Formation du corps embryoïde (EB)

1. Faire 50 mL de milieu HiPSC: Milieu Eagle modifié modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 15% de remplissage sérique knockout (KSR), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1 × acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol 55 μM, 2 mM L -glutamine et 8 ng / mL de facteur de croissance de fibroblastes basique (bFGF).
2. Faire un milieu de formation de 50 ml de EB: DMEM supplément....

Résultats

Différenciation chondrogénique des hiPSC:

Le milieu de formation de EB et le milieu de culture basal ont été utilisés pour différencier les hiPSC dans la lignée de mésenchyme. Une méthode de culture multi-étapes a été utilisée ( figure 1 ). Tout d'abord, les hiPSC ont été spontanément différenciés via la formation d'EB pendant 10 jours (D10, Figure 2A ). Deuxième.......

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole pour générer des chondrocytes de PBC via iPSC. Étant donné que les PBC sont plus fréquents et largement utilisés dans le domaine clinique, ils sont présentés comme une alternative potentielle pour la reprogrammation. Dans cette étude, des vecteurs épisomaux (EV) ont été utilisés pour reprogrammer les PBC dans les iPSC, suivant la méthode établie par Zhang et al. ¹¹ . Cette approche sans intégration n'implique pas l'intégration de la génotoxicité.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Milieu basal utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB
Remplacement sérique knockout (KSR)	Invitrogen	10828028	Un complément de milieu plus défini, sans FBS, utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB
Sérum bovin fœtal (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Utilisé pour la culture hiPSC et le milieu de formation EB, offre une excellente valeur pour la cellule culture
Acides aminés non essentiels	Chemicon	TMS-001-C	Utilisé comme supplément de croissance dans tous les milieux de culture cellulaire, pour augmenter la croissance et la viabilité cellulaires
L-glutamine	Invitrogen	TMS-002-C	Un acide aminé nécessaire à la culture cellulaire
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)	Peprotech	100-18B	Une cytokine utilisée pour soutenir la pluripotence et l’auto-renouvellement des hiPSCs
Dispase	Invitrogen	17105041	Utilisé pour la dissociation des hiPSC pour la sous-culture
DMEM	Gibco	C11960	Milieu basal utilisé pour le milieu de culture MSC
0,1 % de gélatine	Millipore	ES-006-B	Utilisé pour la fixation des cellules sur les boîtes
0,25 % trypsine/EDTA	Gibco	25200072	Utilisé pour la dissociation cellulaire
DPBS	Gibco	14190250	Une solution saline équilibrée utilisée pour le lavage cellulaire ou un réactif préparant
2-mercaptoéthanol	invitrogen	21985023	Utilisé comme supplément de croissance dans tous les milieux de culture cellulaire.
ITS	invitrogen	41400045	Insuline, Transferrin, Solution de sélénium.Utilisé pour la différenciation chondrogénique.
Acide ascorbique	Sigma	4403	Connu sous le nom de vitamine C. Il aide à la croissance active et a des propriétés antioxydantes.
Pyruvate de sodium	Gibco 11360070		Ajouté au milieu de culture cellulaire comme source d’énergie en plus du glucose.
Facteur de croissance transformant-bêta 1	Peprotech	AF-100-21C	Une cytokine qui régule la prolifération cellulaire, la croissance et la différenciation chondrogénique.
Anticorps polyclonaux de lapin contre le collagène II	Abcam	ab34712	Cet anticorps réagit avec les collagènes de type II, qui sont spécifiques des tissus cartilagineux.
Anticorps monoclonaux de souris contre le collagène X	Abcam	ab49945	Cet anticorps réagit avec le collagène de type X, qui est un produit de chondrotocytes hyperthrophiques.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Pour le montage et le stockage à long terme des lames
Bleu de toluidine	Sigma	89640	Utilisé pour la détection des protéoglycanes.
Bleu Alcian	Amresco	#0298	Utilisé pour la détection des glucosaminoglycanes.
Papain	Sigma	P4762-25MG	Utilisé pour digérer les granulés chondrogènes.
Bleu de diméthylène	Sigma	341088-1G	Utilisé pour quantifier les glycosaminoglyans
Sulfate de chondroïtine sel de sodium du cartilage de requin	Sigma	C4384-250MG	Utilisé pour tracer la courbe standard pour la mesure de la teneur en sGAG.
Qubit dsDNA HS assay	kit Invitrogen	Q32851 (100)	Utilisé pour déterminer le contenu en ADN
TRIzol	Invitrogen	15596018	Utilisé pour l’isolement de l’ARN à partir de cellules
Système de transcriptase inverse	Promega	A3500	Utilisé pour convertir l’ARN en cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix	Kapa	KK4601	Utilisé pour la PCR en temps réel

le