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Mini-Invasive Muscle enrobage (MIME) - une nouvelle Technique expérimentale pour faciliter des donateurs-Cell-Mediated myogenèse

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DOI :

10.3791/55731

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24 août 2017

 ,  , 
1Department of Health Care Sciences, Physical Therapy Program, College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent une nouvelle technique expérimentale que nous appelons minimalement Invasive Muscle Embedding (MIME), qui repose sur la preuve que le tissu musculaire squelettique contienne des cellules myogènes viables pouvant faciliter la myogenèse donneur-cell-mediated lorsqu’elles sont implantées dans un muscle de l’hôte.

Résumé

Le muscle squelettique possède la capacité régénérative en raison des tissus-résident, muscle génératrices de fibre (myogènes) cellules satellites (SCs), qui peuvent former de nouvelles fibres musculaires dans de bonnes conditions. Bien que SCs peuvent être récoltées de tissu musculaire et cultivés in vitro, les cellules myoblastes qui en résultent ne sont pas très efficaces pour promouvoir la myogenèse lorsque transplantés dans le muscle de l’hôte. Chirurgicalement exposant le muscle de l’hôte et le greffage des segments de tissus musculaires de bailleurs de fonds, ou les fibres musculaires isolées avec leurs SCs sur le muscle de l’hôte, favorise la myogenèse mieux par rapport à la transplantation de myoblastes. Nous avons développé une nouvelle technique que nous appelons minimalement Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME consiste à passer une aiguille chirurgicale dans le muscle de l’hôte, le dessin d’un morceau de tissu musculaire donateurs par le biais de la piste de l’aiguille et puis en laissant le tissu donneur incorporé dans le muscle de l’hôte, afin qu’il peut agir comme une source de SCs pour le muscle de l’hôte. Ici, nous décrivons en détail les étapes impliquées dans l’exercice de MIME dans un modèle de souris immunodéficientes qui exprime une protéine fluorescente verte (GFP) dans toutes ses cellules. Immunodéficience chez la souris hôte réduit le risque de rejet immunitaire du tissu donneur et expression de la GFP permet de faciliter l’identification de l’hôte les fibres musculaires (GFP +) et les dérivés du donneur-cellulaire des fibres musculaires (GFP-). Notre pilote suggèrent que MIME peut être utilisé pour implanter un muscle extenseur de longus (EDL) digitorum d’une souris de donateurs dans le muscle jambier antérieur (ja) d’une souris de l’hôte. Nos résultats suggèrent aussi que quand une myotoxine (chlorure de baryum, BaCl2) est injecté dans le muscle de l’hôte après MIME, il y a preuve de la myogenèse dérivés du donneur-cellule dans le muscle de l’hôte, avec environ 5 %, 26 %, 26 % et 43 % des fibres dans un seul hôte TA musculaire ne montrant aucune contribution de l’hôte, hôte minime contribution, contribution modérée hôte et contribution maximale hôte, respectivement.

Introduction

Le muscle squelettique en bonne santé, même si post-mitotique, possède la capacité régénérative excellente en raison de la présence de tissu-résident myogènes cellules appelées cellules satellites (SCs)1,2; et examiné dans3,4. Toutefois, dans des conditions pathologiques causées par les dystrophies musculaires, traumatismes ou vieillissement accéléré, la régénération musculaire ne pourrait pas suivre la dégradation musculaire, et ainsi, la perte progressive des fibres musculaires produit5. Bien que des méthodes efficaces ont été développés pour isoler les SCs du muscle et augmenter leur culture pour générer un grand nombre de myoblastes (et par la suite les myotubes), les tentatives pour générer des nombres physiologiquement pertinents des fibres musculaires dans le muscle de l’hôte ont a produit seulement un minimum de succès6. Comme avec beaucoup d’autres types de cellules, lorsque les myoblastes sont injectés seuls dans les tissus de l’hôte, la plupart des cellules ne pas greffer7,8. Nous avons montré que la stimulation électrique neuromusculaire (NMES) facilite myogenèse dérivés du donneur-cellule dans le muscle de souris déficientes en régénération hôte qui a été injecté avec des myoblastes humaine8. D’autres ont démontré que chirurgicalement greffe biopsie musculaire ou fibres musculaires simples avec SCs ci-joint, faciliter la myogenèse modérée même sans NMES, suggérant qu’il serait plus avantageux que l’implantation d’implanter l’ensemble des fibres musculaires avec SCs cellules myogènes seul9,10. Étant donné que le donneur ou le tissu musculaire machiné greffés sur muscle hôte produit de meilleurs résultats que la transplantation de cellules seuls, il est possible que des tissus ou des structures ressemblant à des tissus pourraient fournir des indices cruciaux pour greffe de cellule donatrice ; un concept qui devient de plus en plus évident dans les études de thérapie cellulaire impliquant diverses cellules types10,11,12.

Des données récentes suggèrent que SCs provenant d’êtres humains plus de 2 semaines post-mortem génèrent des myotubes en culture13. Par conséquent, nous avons l’intention d’évaluer si l’implantation de muscle récolté des tissus post mortem dans un hôte vivant va inverser la perte de fibres musculaires. Nous avons développé une nouvelle technique appelée MIME pour implanter des tissus musculaires donneur dans le tissu musculaire squelettique d’un hôte vivant afin de promouvoir la myogenèse dérivés du donneur-cellule. MIME implique de passer une aiguille chirurgicale dans le muscle de l’hôte pour créer une piste de l’aiguille ; dessin d’un petit segment du tissu musculaire donateurs par le biais de la piste de l’aiguille ; laissant le tissu donneur incorporé dans le muscle de l’hôte ; et fermer les trous d’aiguille avec un adhésif de tissu. Après que pratiquer la technique chez les souris euthanasiés étudié dans d’autres expériences, nous ont désormais exécutées MIME dans des souris vivantes qui sont immunodéprimés et ubiquitaire exprimer une protéine fluorescente verte (GFP), et suivi à 3 et 14 jours post-MIME. Au MIME après 3 jours, nous confirmons que muscle EDL de donateurs souris (GFP-) implanté dans souris hôte muscle TA (GFP +), reste dans le muscle de l’hôte. Au MIME après 14 jours, après BaCl2 myotoxine blessure d’induire des dommages et la myogenèse, nous confirmons qu’environ 5 %, 26 %, 26 % et 43 % des fibres dans un seul hôte muscle TA Voir l’aucune contribution de l’hôte, la contribution de l’hôte minimale, l’hôte modérée contribution maximale à l’hôte et contribution, respectivement. Nucléation centrale (un marqueur de la dégénérescence et régénération subséquente) voit dans environ 95 % des fibres musculaires TA après injection de MIME et myotoxine.

Nous étudions les muscles de TA 14jours après MIME + BaCl2 parce que ce point dans le temps capture le stade intermédiaire de régénération, lorsqu’une majorité des fibres régénérées sont nucléés centralement. Nous étudions GFP + souris comme hôtes de MIME, afin que lorsque nous avons finalement transplanter musculaires provenant de cadavres humains dans souris hôte, nous serons en mesure de distinguer facilement les fibres musculaires d’origine hôte et donateurs. Nous utilisons la souris muscle EDL comme le tissu donneur expérimental, puisque les fibres de ce muscle ont montré un plus grand potentiel myogénique que TA muscles9. Le muscle EDL est également synergique au muscle TA et composition de fibre de type similaire. Nos données préliminaires suggèrent que le MIME est capable de faciliter la myogenèse dérivés du donneur-cellule dans le muscle de l’hôte.

Protocole

toutes les études portant sur des animaux vivants sont agréés par l’Institution animalier et utilisation Comité (IACUC) de Wayne State University, Detroit, Michigan, USA et sont en conformité avec le Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals ( 8e édition, 2011, publié par National Academies Press, 500 cinquième rue, 285 Lockbox, NW, Washington, DC 20055, USA). Selon les protocoles approuvés de IACUC, procédures impliquant la douleur et/ou détresse ont été réalisées sous anesthésie générale, qui est induite et maintenue par inhalation isoflurane (1,5 à 5 % d’effet). L’anesthésie a été vérifiée par manque de retrait à l’orteil de pincement et de fentes palpébrales ou réponses de vibrisses (le pourcentage d’isoflurane a été augmenté au besoin pour maintenir l’effet). En raison de la nature invasive des protocoles, une " embouts stériles " technique a été suivie. Alors que les animaux était sous anesthésie, gelée de pétrole a été appliquée aux yeux à prévenir le dessèchement. Aucun des traitements spéciaux n’étaient nécessaires ; Cependant, gel de l’alimentation a été fournie aux animaux pendant 24 h suivant les procédures impliquant l’anesthésie générale. l’enquêteur est approuvé par l’IACUC de retenir l’analgésie après MIME, étant donné que la procédure n’implique pas chirurgicalement exposant l’hôte musculaire, parce qu’il est limité à un seul membre postérieur et n’affecte pas le fonctionnement normal, et parce que de nombreux médicaments analgésiques courants sont connus pour affecter la régénération du muscle normal.

1. Modèles animaux

  1. souris hôte pour MIME
    1. souris utilisation NSG-GFP (8-10 semaines, mâle) comme hôte pour le muscle greffes études.
      Remarque : Ces souris sont des hôtes idéales pour les greffes allogénique muscle parce qu’ils n’ont pas des lymphocytes T et B matures et fonctionnelle des cellules de NK sont déficients dans la signalisation des cytokines et ont été utilisés par d’autres pour les cellules non musculaires allografting ou xénogreffe < sup Class = « xref » > 14. Expression de la GFP omniprésente permet pour faciliter l’identification de l’hôte (GFP +) et les dérivés du donneur-cellule (GFP-) fibres musculaires.
  2. Souris de donateurs pour MIME
    1. utilisation C57BL/6J souris (12-16 semaines) que les souris donneur.
      Remarque : Ces souris sont souris donneur parce qu’ils ont un génome entièrement cartographiée, ne sont pas connus pour avoir une pathologie du muscle squelettique, sont facilement disponibles et plus économiques et n’expriment pas GFP.

2. Préparation des tissus musculaires donneur

  1. lier les Sutures directeurs et muscles EDL de récolte donneur
    1. euthanasier les souris donneur par dislocation cervicale et thoracotomie faites sous anesthésie générale, administré par une table vaporisateur isoflurane entraînée par l’oxygène thérapeutique (inhalation isoflurane ; 2-5 % d’effet).
    2. Pour accéder aux muscles EDL, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la peau sur la surface antérieure de la jambe. Localiser le muscle TA dans la jambe antérieure et le retirer pour visualiser le muscle de l’EDL qui se trouve derrière le muscle TA. Faites glisser la pointe d’une paire de pinces derrière le muscle de l’EDL et appliquer une traction douce pour voir si les orteils s’étendre (cela confirme que le muscle est l’EDL).                                                                                                                                                          
      Remarque : zone de tissu donneur devrait être chirurgicalement, préparé aseptiquement avant la récolte.
    3. Utilisation ~ segments de 10 cm de soie de 4-0, suture tressée, non résorbable, stérile et faire deux doubles noeuds d’appliquer les sutures directeurs pour les tendons proximales et distales du muscle EDL. ( figure 1 a).
    4. Couper le tendon distal des EDL, reflètent le muscle EDL et couper le tendon proximal.
    5. Place le donateur EDL muscles dans une boîte de Pétri remplie avec une solution de Ringer souris.

3. Préparation souris hôte de MIME

  1. anesthésie
    1. Placer la souris hôte sous anesthésie générale (inhalation isoflurane ; 1,5 à 5 % d’effet), administré par un vaporisateur isoflurane table entraîné par l’oxygène thérapeutique.
    2. Induire l’anesthésie dans une chambre à induction et transférer ensuite la souris à un cône de nez pour maintenir l’anesthésie lors de l’exécution d’autres procédures sur l’animal. Fournir un appui thermique avec un gel isotherme, coussin chauffant, tandis que l’animal est sous anesthésie.
  2. Préparation de la peau
    1. pour retirer l’animal ' s de la fourrure, appliquez une crème dépilatoire sur la face antérieure de la patte arrière gauche. La jambe droite sert une jambe de contrôle pour les procédures suivantes.
    2. Congé la crème dépilatoire sur pendant 2 min. Clean au large de la crème dépilatoire ainsi que le détaché fourrure avec des lingettes imbibées dans le phosphate buffered saline (PBS). Après le retrait de la fourrure, frotter la peau avec trois lingettes alternance de povidone-iode récurer solution et 70 % d’éthanol.
  3. Création d’une piste de l’aiguille dans le muscle de l’hôte TA
    1. passer une aiguille chirurgicale (1 en long) de calibre 18 à travers le centre de l’hôte muscle TA le long du muscle ' axe long s ( Figure 1 b). Passer l’aiguille dans un sens céphalo-caudale, sur toute la longueur du muscle TA et à travers le centre de la poitrine du muscle ( Figure 1 b).
      Remarque : L’objectif de cette étape est de créer une piste de l’aiguille, dans lequel un morceau de muscle donneur peut être incorporé. Incorporant le tissu du donneur dans le centre du muscle TA potentiellement permettrait aux SCs des tissus donneur de migrer et de faciliter la myogenèse dans l’ensemble de l’armée entière muscle TA.
  4. Tissu donneur Embedding dans la piste de l’aiguille d’hôte muscle TA
    1. une fois l’aiguille chirurgicale au sein de l’hôte muscle TA, passer les sutures directeurs à une extrémité du tissu donneur par la lumière de l’aiguille chirurgicale dans un direction caudo-céphaliques ( Figure 1).
    2. Tirer le tissu du donneur par l’intermédiaire de la piste de l’aiguille car l’aiguille est retirée du muscle en direction céphalique caudo hôte TA.
    3. Utiliser les sutures directeurs à l’extrémité caudale et céphalique du tissu donneur pour ajuster le placement du tissu donneur. S’assurer que le tissu du donneur est situé au sein de l’hôte muscle TA ( Figure 1).
    4. Une fois le placement de tissu donneur est optimisé, couper les sutures directeurs, effectuer aucun réglage final sur le placement de tissu donneur avec une pointe fine pince.
    5. Joint cutanée plaies d’aiguille ( Figure 1E -F) en se rapprochant du bord de la plaie avec une pince et en appliquant la colle tissu vétérinaires avec la pointe d’une aiguille chirurgicale 27-g.

4. Injection intramusculaire de myotoxine à induire la dégénérescence musculaire concertée et régénération

  1. après MIME, injecter 50-60 µL de 1,2 % BaCl 2 (myotoxine) dans l’hôte muscle TA pour induire des lésions des fibres musculaires dans le muscle de l’hôte et le tissu du donneur imbriquées 15.
    1. BaCl injecter 2 à 3 sites sur toute la longueur de l’hôte TA musculaire (proximal, médians et distaux un tiers du ventre muscle).
      NOTE : Injection myotoxins comme BaCl 2, cardiotoxins et notexin dans le muscle squelettique induit des dommages concertée fibre musculaire suivi de régénération 16.

5. Après procédure animalier

  1. après MIME et BaCl 2 injection, nettoyer la souris hôte ' s hind gauche jambe avec de l’éthanol et appliquez une fine couche de vaseline pour protéger la peau.
  2. Après les soins de la peau après procédure, supprimer la souris de l’hôte de la coiffe.
  3. Placer la souris dans une cage de récupération solitaire sans literie. Fournir soutien thermique à l’animal de récupération grâce à un coussin de gel isotherme chauffant placé sous la moitié de la cage de récupération.
    Remarque : Une moitié n’est pas chauffée donc cet animal peut s’éloigner du coussin chauffant si nécessaire.
  4. Après que la souris de l’hôte a complètement récupéré de l’anesthésie, retourner l’animal de sa cage originale. Remettre les animaux dans l’animalerie jusqu'à ce que les expériences de suivi sont effectuées. Contrôler la souris de l’hôte au quotidien jusqu'à ce qu’elle est prête pour le suivi – exemple : à 3 ou 14 jours après le MIME. Suite de MIME, animaux est surveillées par le personnel de laboratoire aussi bien par le personnel vétérinaire – cela consiste principalement à évaluer si les animaux est lumineuses, alerte et réactif ; et aussi évaluer si les animaux montre des signes évidents de douleur ou éprouvez des difficultés de déplacement, de nourrir, de boire et de toilettage.

6. Collection de tissus

  1. muscle hôte récolte
    1. euthanasier les souris hôte par dislocation cervicale et thoracotomie faites sous anesthésie générale, administré par un vaporisateur isoflurane table conduit par oxygène thérapeutique ( par inhalation isoflurane ; 2-5 % d’effet). l’enquêteur a également l’homologation IACUC aux muscles de TA récolte sous anesthésie générale avant euthanasie.
    2. pour accéder les muscles hôte TA, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la peau sur la surface antérieure de la jambe. Localiser le muscle TA dans la jambe antérieure, couper le tendon distal, reflètent le muscle et couper les pièces jointes les muscles proximaux (voir la section 2.1).
    3. Recueillir les gauchers (expérimental) et droit (contrôle) TA muscles.
  2. Snap gel muscles récoltés
    1. peser les muscles récoltés en plaçant sur le papier de peser et balance.
    2. Tremper brièvement les muscles en huile minérale pour cryoprotection. Tache au large de l’huile en excès.
      3. Muscles de la
    3. Place sur le papier d’aluminium et composant logiciel enfichable geler les muscles en les plongeant rapidement dans l’azote liquide rempli un Dewar. Transférer les échantillons à cryovials marqués et stocker les échantillons dans un congélateur à-80 ° C pour des études ultérieures.

7. Des études histologiques

  1. Cryosectioning le tissu musculaire pour recueillir des coupes sériées de cross
    1. transférer les échantillons du congélateur à-80 ° C à un cryostat en les plaçant dans un Dewar contenant de l’azote liquide.
    2. Dans le cryostat, gérer un échantillon à la fois. Avec une lame de rasoir froide (lame stocké dans cryostat), couper l’échantillon deux fois au ventre milieu du muscle TA pour produire un segment du muscle qui est environ 1-2 mm d’épaisseur. Conserver ce segment pour rendre les sections cryostat et retourner les parties restantes du muscle à son cryovial.
    3. Avec la température de coupe optimale (OCT) composé de congélation, sécuriser le segment épaisseur de tissu sur un disque de spécimen du cryostat. Placez le disque de spécimen sur le porte-échantillon.
    4. Rough-face l’échantillon par couper 20 µm sections. Recueillir quelques 20 µm pans sur lames de verre pour les sections cryostat.
    5. Si la qualité des 20 sections µm est satisfaisante, modifier l’épaisseur de coupe à 5 µm et recueillir quelques mèches pour évaluer la qualité. Si les 5 sections µm sont satisfaisantes en qualité, recueillir des coupes sériées. Collecter les sections 2-3 par lame et collecter suffisamment sections pour 3 diapositives.
    6. Recueillir les sections de l’expérimental (gauche) et les muscles de TA commande (à droite) de chaque animal.
  2. Expression de la GFP étudier
    Remarque : désigner un ensemble de diapositives préparées (section 7.1) pour étudier l’expression de la GFP dans les fibres musculaires.
    1. S’appliquent ~ 50 µL d’anti-décoloration moyenne sur les sections et une lamelle de verre. Sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec vernis à ongles transparent.
    2. à l’aide du microscope lumineux et fluorescent (voir Table des matières), étudier les sections avec un 10 X objectif et un filtre approprié pour la visualisation de GFP.
      1. Collecter des images numériques (~ 15) de la superposition des champs visuels pour couvrir la totalité coupe transversale du muscle TA. Recueillir les images de contraste de phase pour chacun des champs visual en passant de fluorescence à la mode de contraste de phase sur le microscope.
    3. Ouvrir les images avec un logiciel d’imagerie approprié qui peut de tuiles différentes images pour produire une seule image composite ; par exemple, utiliser la " photomerge " option sous le Menu fichier dans le logiciel d’imagerie énumérés dans la Table des matières.
    4. Ouvrir les images de fluorescence GFP avec un logiciel d’analyse image approprié (par exemple, ImageJ). Cercle les fibres musculaires individuels à l’aide de la " outil ROI " et enregistrer l’intensité de Fluorescence signifie pour chaque fibre.
      1. Calculer l’intensité maximale GFP (Fluorescence) en calculant la moyenne de l’intensité de Fluorescence signifie de 10 fibres qui montrent la forte expression de la GFP et ont une morphologie normale. Calculer le % intensité maximale de GFP pour chaque fibre en divisant l’intensité de fluorescence signifie pour chaque fibre de l’intensité maximale de la GFP et en multipliant par 100. Compiler les résultats de l’analyse GFP pour chaque muscle TA tel qu’illustré dans Figure 3E.
  3. Étudiant emplacement intégrité et induit de fibres musculaires par immunofluorescence labeling desmine et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), respectivement.
    NOTE : Désigner un ensemble de diapositives préparées, comme indiqué ci-dessus, afin d’étudier l’étiquetage desmine dans les fibres musculaires. Les sections
    1. fix avec paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 10 min. Lavez les sections trois fois avec du PBS.
      ATTENTION : Porter des équipement de protection individuelle (EPI) approprié lors de la manipulation lors de la manipulation de paraformaldéhyde.
    2. Sections de bloc avec 3 % d’albumine sérique bovine dilué dans du PBS contenant 0,01 % Triton-X100 pendant 30 min. Cette solution de saturation est dénommée le diluant primaire.
    3. Diluer le lapin anti-desmine l’immunoglobuline G (IgG) dans le diluant primaire (1 : 200).
    4. Lorsque le blocage est terminé, appliquer l’anticorps primaires dilués sur les sections et incuber jusqu’au lendemain au réfrigérateur à 4 ° C. Lavez les sections une fois (5 min) avec du PBS contenant 0,1 % X-100 Triton. Cette solution est appelée ci-après le premier tampon de lavage.
    5. Laver les sections 3 fois (5 min par lavage) avec PBS.
    6. Préparer l’anticorps secondaire en diluant de chèvre anti-IgG (conjugué à un colorant fluorescent rouge) dans du PBS contenant 0,01 % de lapin Triton X-100.
    7. Appliquer l’anticorps secondaire dilué sur les sections et incuber à température ambiante (~ 23 ° C) pendant 60 min.
    8. Laver les sections une fois (5 min) avec le premier tampon de lavage. Laver les sections 3 fois (5 min par lavage) avec PBS.
    9. Appliquer DAPI pour 3 min. Lavez les sections 3 fois (1 min par lavage) avec du PBS. Appliquer ~ 50 µL de milieu anti-fondu sur les sections et appliquer la lamelle de verre. Sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec vernis à ongles transparent.
    10. à l’aide du microscope lumineux et fluorescent (voir Table des matières), l’étude le colorant fluorescent de coupes sériées avec un 10 X objectif et un filtre approprié pour la visualisation de rouge.
    11. Recueillir les images numériques (~ 15) de la champ visuel qui se chevauchent pour couvrir la totalité coupe transversale du muscle TA. Recueillir les images de fluorescence du DAPI étiquetage pour chacun des champs visual en optant pour le paramètre de filtre approprié.
    12. Ouverte et analyser les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie approprié comme décrit aux étapes 7.2.3 - 7.2.4.
      NOTE : Étudier des images pour identifier, les fibres musculaires sont endommagée (desmine négatif), dont les fibres musculaires ont centrale nucléation (desmine positive les fibres qui ont marquées au DAPI noyaux situés dans leur propre pays plutôt qu’en périphérie) et, quelles parties de la section avoir une inflammation et/ou fibrose (les zones qui ont plusieurs noyaux marquées au DAPI regroupés, mais sont dépourvues de fibres musculaires).

Résultats

Au MIME après 3 jours, le donateur EDL est implantés par MIME est contenu dans le compartiment de muscle TA hôte (Figure 2 a–C). Comme prévu, les sections efficaces des muscles de souris, donneur de TA étudié sous l’optique de la fluorescence, ne montrent pas de fluorescence verte parce qu’ils n’expriment pas de GFP (Figure 2D). En revanche, les sections efficaces du muscle TA souris hôte qui ne sont pas implantés avec tissu du donneur, montrent une fluorescence verte uniforme dans les fibres musculaires de TA, comme les fibres expriment GFP (Figure 2E). Dans les sections efficaces des muscles implantés par MIME avec le tissu musculaire donneur, il y a une ligne de démarcation entre l’hôte les fibres musculaires (GFP +) et les fibres musculaires donneur (GFP-). Les images de contraste de phase des champs visual illustrés à la Figure 2D–F sont présentés en Figure 2E'–F' et suggèrent qu’il existe en effet des fibres musculaires présentes dans les régions où il n’y a aucun GFP signal.

À 14 jours après MIME et BaCl2 injection, en étudiant la série cross sections du muscle TA qui restent non ou sont marquées avec des anticorps anti-desmine (Figure 3), nous apprenons que le signal de la GFP est exprimé par toutes les fibres musculaires dans le musculaires non traités provenant de souris de l’hôte, mais pas dans le muscle imprégnées de MIME (marquage rouge desmine détecte viable des fibres musculaires). Dans le muscle d’hôte TA traité par injection2 MIME et BaCl, la myogenèse dérivés du donneur-cellule est évidente de la présence de nombreuses fibres musculaires desmin(+) qui ne montrent aucun signal discernable de la GFP (Figure 3–D, 3C ' –D'). Chimérique des fibres musculaires résultant de la fusion probable des cellules myogènes hôte et les donateurs peuvent être détectées par le bas à des niveaux modérés de fluorescence GFP exposées par ces fibres. Nombreuses fibres chimériques apparaissent à travers le diamètre entier de la muscle TA suggérant que le donateur SCs sont capables de faire migrer plusieurs centaines de micromètres au sein de l’épimysium du muscle hôte. Quantification de la GFP + fibres est illustrée à la Figure 3E. La figure 4 montre des images de coupes sériées de croix d’un ensemble MIME + BaCl2 traité TA muscle fort grossissement.

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Figure 1 . Étapes impliquées dans minimalement Invasive Muscle Embedding (MIME).
MIME est réalisée sous anesthésie générale. Il consiste à placer environ 10 mg de muscle donneur (souris de donateurs EDL) dans une solution Ringer liant les sutures directeurs à ses extrémités (A). Une aiguille de calibre 18 est passée par l’intermédiaire de l’axe longitudinal du muscle hôte (B) et le tissu du donneur est aspiré au travers de la piste de l’aiguille (C). Le tissu du donneur est gauche incorporé dans le muscle de l’hôte (D), les sutures directeurs sont coupées et les trous d’aiguille sont scellés avec de la colle tissu (E). Les blessures d’aiguille scellé sont indiqués par des flèches (F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 . Études du Muscle TA 3 jours après le MIME.
Muscle de l’hôte recueilli 3 jours après le MIME ; Remarque l’aiguille marques sur hôte TA (flèches ; A-B). Outre les données confirment que la souris donneur embarqués EDL est confortablement installée dans le compartiment de muscle TA (B-C). Images de fluorescence du muscle TA coupes montrent aucune fluorescence verte dans le muscle TA sauvage (D), fluorescence vert vif dans le muscle TA NSG-GFP (E)et une distinction entre l’hôte et donneur musculaires dans le muscle TA NSG-GFP à 3 jours post-MIME (F). Les images de contraste de phase des champs visual de D-F figurent au D'-F ', respectivement. La ligne rouge dans les séries F et F' indique la ligne de démarcation entre les tissus de l’hôte et les bailleurs de fonds. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 . Études du Muscle TA 14jours après MIME.
Les données recueillies 14jours après MIME sont présentés. Le signal rouge est de marquage par immunofluorescence de la desmine (un signal positif pour la desmine signifie que les fibres musculaires sont viables), le signal bleu de DAPI (noyaux de taches), et le signal vert est de GFP. Dans le muscle TA commande (membre postérieur droit) récolté sur la souris de l’hôte, comme prévu, presque toutes les fibres musculaires sont positives pour la desmine, suggérant que ces fibres musculaires sont viables (A; signal rouge). En outre, selon la coloration DAPI, il est évident que noyaux de presque toutes les fibres musculaires se trouvent en périphérie, comme serait prévu dans le muscle sain (A; signal bleu). Coupes sériées du muscle TA de contrôle montrent que, presque toutes les fibres musculaires sont vert vif, ce qui implique qu’ils sont positifs pour la GFP. Dans le MIME + BaCl2 -traités muscle TA (membre postérieur gauche), myogenèse donneur-cell-mediated témoigne de la présence de nombreuses fibres musculaires desmin(+) qui ne montrent aucune fluorescence GFP détectable (C-D, C'-D'). Fibres musculaires Desmin(+) avec faible à modérée fluorescence GFP (chimériques fibres musculaires) sont présents sur le diamètre du muscle TA entier, suggérant que, MIME procure donneur SCs qui peuvent migrer à l’intérieur l’épimysium du muscle TA et promouvoir dérivés du donneur-cellule myogenèse. A'-D' sont fort grossissement des images des régions dans les cases bleues en A-D. Dosage des fibres GFP(+) et fibres centralement nucléées apparaissent dans E. Barreaux de l’échelle = 100 µm (A-D) et 50 µm (A "-D"). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 . Preuve des dommages étendus et régénération 14 jours après l’Injection de2 MIME et BaCl.
Fort grossissement, coupes sériées de croix d’un ensemble MIME + BaCl2 traité TA muscle sont présentés. Les données montrent que bon nombre des fibres musculaires, qui sont modérément ou fortement GFP + ont situé les noyaux (A-B; rouge signal a provient de la desmine, signal bleu a fait du DAPI, et signal vert b provient de GFP). Ces données suggèrent que la dégénérescence et la régénération après injection2 BaCl n’affecte pas l’expression de la GFP. Dans ce contexte, la présence de centralement nucléées fibres musculaires dans les muscles de TA2 traité MIME + BaCl, avec expression peu ou pas de la GFP, suggère que ces fibres sont le résultat probable de la myogenèse (ou régénération) avec une contribution significative de GFP - cellules myogènes. Ces observations peuvent être vérifiées plus loin dans les images de fort grossissement des champs sélectionnés (C-F; C et D et E et F, respectivement, sont superposés des régions de coupes sériées de croix ; codage couleur des frontières de l’image de désigner l’emplacement de ces régions a et B). Barreaux de l’échelle = 100 µm (A-B) et 50 µm (C-F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour cette nouvelle technique expérimentale appelée MIME, mis au point dans notre laboratoire, pour implanter des tissus musculaires donneur dans le tissu musculaire hôte. Il s’agit d’une adaptation d’un muscle ouvert greffage technique qui a déjà fait ses preuves pour être efficace dans la promotion des donateurs-cell-mediated myogenèse dans un hôte muscle9,10,17.

MIME vise ne pas à permettre la prise de greffe du donneur tissu musculaire lui-même dans le muscle de l’hôte (nous avons actuellement ne sais pas si c’est le cas), mais plutôt de fournir une source de donateurs SCs qui peuvent contribuer à la myogenèse dans le muscle de l’hôte dans des conditions qui stimulent m régénération d’uscle. Notre espoir est qu’après que MIME a été optimisé et testé dans les études précliniques et de base, il pourrait fournir des indications précieuses pour guider les thérapies cliniques visant à augmenter la régénération musculaire dans les muscles squelettiques qui ont subi la perte musculaire myogène.

Il existe de nombreuses questions qui n’ont pas encore répondu au sujet comment MIME pourrait se traduire par une thérapie clinique, par exemple : comment nous contrôleraient la qualité du tissu du donneur ? Comment nous contrôleraient rejet immunitaire des cellules et de tissus de donneurs ? Le tissu du donneur disparaît après avoir fourni les cellules de la myogenèse ou laisse-t-il derrière une cicatrice fibreuse ? Le type de fibre de muscle donneur et/ou hôte affecte-t-elle la myogenèse donneur-cell-mediated ? Quels muscles bénéficient pratiquement MIME ? Actuellement, nous élargissons nos études pour évaluer si le MIME est sûr et efficace, identifier des traitements complémentaires qui peuvent augmenter la myogenèse dérivé donneur et répondre aux nombreuses questions, énumérés ci-dessus.

À l’issue de nos tests de la greffe allogénique à-souris avec MIME, notre étape suivante consiste à exécuter l’homme-à-souris MIME avec des tissus provenant de cadavres humains pour évaluer le potentiel myogénique des tissus musculaires provenant de cadavres. Nous prévoyons que ces expériences ne conduisent à une nouvelle ligne de recherche fondamentale et translationnelle, ce qui implique les tissus musculaires de bailleurs de fonds, qui sont inscrits dans des initiatives comme le programme de legs Body pour l’éducation et le programme de don de vie pour le don d’organes .

Les données représentatives présentées dans ce manuscrit suggèrent qu’il y a 14 jours après la MIME, plusieurs myofibres viables qui manquent de GFP ou qui ont un faible niveau de GFP. Notre interprétation de ces données est que les cellules satellites GFP et les donateurs ont contribué à la myogenèse dans le muscle de l’hôte. Nous avons réalisé cette expérience en vue de l’implantation de tissus provenant de cadavres humains dans un muscle de souris hôte. Afin de démontrer sans équivoque que les cellules satellites donateurs contribuent à la myogenèse dans le muscle d’hôte suite MIME, il serait utile d’implanter des tissus de donneurs qui exprime un journaliste fluorescent, qui peut être aisément distingué des GFP (p. ex., rouge protéine fluorescente exprimant de tissu donneur implanté dans GFP + muscle hôte).

Cette technique est principalement limitée par la nature des SCs présents dans le tissu du donneur. Si les SCs dans le tissu du donneur sont viables, que la technique est susceptible de faciliter les donateurs-cell-mediated myogenèse, tandis que s’ils ne sont pas viables, myogenèse ne puisse se produire. Toutefois, étant donné que SCs sont très résistants et sont viables pour environ 2 semaines post-mortem, il est fort probable qu’à des fins expérimentales, le tissu du donneur qui est implanté à quelques minutes après la récolte facilitera la myogenèse donneur-cell-mediated13 . En outre, comme mentionné ci-dessus, il est possible que, depuis le tissu de muscle entier (qui contient le SCs, les fibres musculaires matures, ainsi que muscle-résident fibroblastes), est incorporé dans le muscle de l’hôte, vous risquez de fibrose. Toutefois, cette hypothèse doit être examiné empiriquement. La littérature sur les lésions musculaires dus aux contractions préjudiciables, cryoinjury et myotoxins expérimentale, suggère que les cellules immunitaires (principalement des macrophages) sont capables de dégager des débris cellulaires des fibres endommagées et transformant efficacement le 18de la matrice extracellulaire. Par conséquent, il est possible qu’après l’injection de2 MIME et BaCl, aussi longtemps que les cellules immunitaires de l’hôte peuvent visiter à dégénérescence donateurs les fibres musculaires, ils pourraient claire débris, laissant derrière eux juste le donateur SCs. Enfin, l’étendue de la myogenèse dérivé donneur dépend de la quantité de tissu de muscle donneur qui est incorporé dans le muscle de l’hôte. Afin que le compartiment de muscle de hôte à être complètement repeuplé par des dérivés du donneur-cellule myofibres, il faudrait une méthode comme X - ou une irradiation gamma à l’ablation des muscle hôte SCs et nécessitent également des procédures répétées de MIME.

Il a été démontré que chirurgicalement exposant un muscle de l’hôte et un morceau de tissu donneur sur le muscle de l’hôte de suture peuvent faciliter la myogenèse donneur-cell-mediated9,10,17. Cette approche chirurgicale ouverte a été utilisée dans le passé pour suivre la progression de la myogenèse et de générer des modèles murins de maladies musculaires humaines. L’aspect novateur de la technique MIME est qu’elle est peu invasive et n’implique pas exposer chirurgicalement le muscle de l’hôte. Cela réduit le risque d’infection iatrogène et le degré d’inconfort chez l’animal hôte, rendant par conséquent plus possible d’effectuer de la MIME à plusieurs reprises sur le même muscle hôte si nécessaire.

Nous prévoyons que la technique MIME pourrait être un perfectionnement adapté à l’approche chirurgicale ouverte qui est actuellement suivie pour implanter des tissus musculaires donneur dans une souris hôte. Cela pourrait accélérer la génération de modèles de souris humanisée, en intégrant la biopsie musculaire humaine dans le muscle de souris de l’hôte. En outre, d’après nos données préliminaires de greffage à-souris, nous prévoyons que MIME sera efficace dans la réalisation des donateurs-cell-mediated myogenèse provenant de tissus de donneurs cadavériques humain tant que donateurs SCs sont viables. Enfin, grâce à des tests supplémentaires et validation, nous espérons que la technique MIME aidera à développer de nouvelles thérapies afin de faciliter les donateurs-cell-mediated myogenèse chez les humains atteints de maladies musculaires.

Le succès de la technique MIME est critique dépend de l’incorporation précisément le tissu du donneur dans le compartiment aponévrotique (épimysium) du muscle hôte. Seulement si le tissu du donneur est placé dans le compartiment de muscle hôte, qu’il sera en mesure de fournir des SCs au muscle hôte de manière précise. Si le tissu du donneur est placé à l’extérieur du muscle de l’hôte, il est peu clair quant à ce qui serait son sort. Dans notre modèle expérimental pour MIME, nous utilisons le muscle TA comme le muscle de l’hôte, car il est proéminent et superficiellement placé dans la face antérolatérale de la cuisse. La taille, l’orientation et la position anatomique du muscle TA, le rend facile de confirmer que le tissu du donneur est placé correctement dans le muscle d’hôte TA après MIME. Dans cet article, nous avons fourni des preuves expérimentales que le tissu du donneur realimentation secteur intégrée au sein de l’hôte le muscle TA au MIME après 3 jours et qu’il est donneur-cell-mediated myogenèse dans le muscle de l’hôte au MIME après 14 jours.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été rendu possible par une subvention de pilote de l’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research and Training (AR3T) et un paquet de démarrage Faculté de Wayne State University à pot. AR3T est pris en charge par le Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders et Stroke (NINDS), National Institute of Biomedical Imaging et bioingénierie (NIBIB ) des instituts nationaux de la santé en vertu de la sentence P2CHD086843 numéro. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris NSG-GFPThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)Stock #021937Souris hôtes immunodéficientes qui expriment de manière ubiquitaire la protéine fluorescente verte
C57BL/6J sourisThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)  ;Stock #000664Souris donneuses de contrôle
Vaporisateur de table à l’isoflurane  ;VetEquip (Livermore, CA)Item #901801Système d’anesthésie inhalée
Magic depilatory creaSoftsheen Carson (New York, NY)N/ACrème dépilatoire sans rasoir
4-0 Soie, noire, tressée, sutures non résorbablesRoboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)SUT106631Sutures de guidage pour tissu de donneur
Adhésif pour tissu vétérinaire VetBond3M (Maplewood, MN)Catalogue #1469SbAdhésif vétérinaire pour tissus sans suture Chlorure
de baryumRicca Chemical Company (Arlington, TX)Produit #R0854000-500A 854-16  ;Myotoxine pour induire des lésions musculaires et stimuler la régénération
Coussin chauffant en gel isotherme Deltaphase  ;Braintree Scientific (Braintree, MA)  ; Article #39DPCoussin chauffant pour fournir un soutien thermique aux animaux sous anesthésie
HM525NX cryostat   ;ThermoFisher (Waltham, MA)Catalogue #HM525NX  ;Cryostat pour faire des sections de muscle congelées
Vectashield Antifade Medium VectorLaboratories, Inc. (Burlingame, CA)Numéro de catalogue : H-1000Milieu anti-décoloration pour préserver la fluorescence dans les échantillons marqués par immunofluorescence
Anticorps anti-desmine pour lapinLabvision Thermo Scientific (Fremont, CA)RB9014PAnticorps anti desmine pour le marquage immunofluorescent
Chèvre anti lapin Alexa 568 AnticorpsThermoFisher (Waltham, MA)Catalogue # : A-21069Anticorps secondaire anti-lapin de chèvre pour le marquage immunofluorescent de la desmine
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)  ;Seracare (Milford, MA)Catalogue #5930-0006 ou 71-03-01Réactif pour le marquage fluorescent des noyaux
Axio Scope.A1 microscopeCarl Zeiss (Peabody, MA)  ;Produit #Axio Scope.A1Microscope à lumière et à fluorescence
Photoshop CS4Adobe Systems (San Jose, CA)Photoshop CS4pour la mosaïque d’images
Image JNational Institutes of Health (Bethesda, MD)Image J pour Windows Système d’exploitation 64 bitsLogiciel d’imagerie pour l’analyse quantitative de fluorescence
Logiciel d’imagerie

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

R g n ration du muscle squelettiquetransplantation de cellules satellitesmod le de souris immunod ficientesuivi de l expression de la GFPinjection de chlorure de baryummuscle extenseur long des doigtsmuscle tibial ant rieurtrajet d aiguille chirurgicale
Mini-Invasive Muscle enrobage (MIME) - une nouvelle Technique expérimentale pour faciliter des donateurs-Cell-Mediated myogenèse
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