Article de méthode

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

DOI :

10.3791/55738

⸱

1 juin 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (ETC) transduit l'énergie dérivée de la décomposition de divers combustibles dans la monnaie bioénergétique de la cellule, l'ATP. L'ETC est composé de 5 complexes de protéines massives, qui s'ajoutent également aux supercomplexes appelés respirasomes (CI, C-III et C-IV) et synthasomes (CV) qui augmentent l'efficacité du transport d'électrons et de la production d'ATP. Diverses méthodes ont été utilisées depuis plus de 50 ans pour mesurer la fonction ETC, mais ces protocoles ne fournissent pas d'informations sur l'assemblage de complexes individuels et de supercomplexes. Ce protocole décrit la technique de l'électrophorèse sur gel de gel de polyacrylamide (PAGE), méthode qui a été modifiée il y a plus de 20 ans pour étudier la structure du complexe ETC. L'électrophorèse native permet la séparation des complexes ETC dans leurs formes actives, et ces complexes peuvent ensuite être étudiés à l'aide d'immunoblot, d'essais en gel (IGA) et de purification par électroélution. En combinant le reLes résultats de la PAGE de gel native avec ceux d'autres essais mitochondriaux, il est possible d'obtenir une image complète de l'activité ETC, son assemblage et démontage dynamique, et comment cela régule la structure et la fonction mitochondriales. Ce travail traitera également des limites de ces techniques. En résumé, la technique de la PAGE native, suivie de l'immunoblot, de l'IGA et de l'électroélution, présentée ci-dessous, est un moyen puissant d'étudier la fonctionnalité et la composition des supercomplexes ETC mitochondriales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'énergie mitochondriale sous forme d'ATP n'est pas seulement essentielle pour la survie cellulaire, mais aussi pour la régulation de la mort cellulaire. La génération d'ATP par phosphorylation oxydante nécessite une chaîne fonctionnelle de transport d'électrons (ETC, Cx-I à IV) et une ATP synthase mitochondriale (Cx-V). Des études récentes ont montré que ces grands complexes de protéines sont organisés en supercomplexes, appelés respirasomes et synthasomes 1 , 2 . Il est difficile d'analyser l'assemblage, la dynamique et la régulation de l'activité de ces complexes et supercomplexes massifs. Alors que les mesures de consommation d'oxygène prises avec une électrode d'oxygène et des dosages enzymatiques menés à l'aide d'un spectrophotomètre peuvent donner des informations précieuses sur l'activité du complexe ETC, ces analyses ne peuvent pas fournir d'informations concernant la présence, la taille et la composition de sous-unité du complexe de protéines ou des supercomplexes impliqués. Cependant, le développement de natif bleu et clair (BN et CN, respectivement) PAGE 3 a créé un outil puissant pour révéler des informations importantes sur la composition complexe et le montage / démontage et sur la régulation dynamique de l'organisation supramoléculaire de ces complexes respiratoires vitaux dans des conditions physiologiques et pathologiques 4 .

L'assemblage de ces complexes en supercomplexes d'ordre supérieur semble réguler la structure et la fonction 5 mitochondriales. Par exemple, l'assemblage respirasome augmente l'efficacité du transfert d'électrons et la génération de la force motrice du proton à travers la membrane interne mitochondriale 5 . En outre, l'assemblage des synthasomes augmente non seulement l'efficacité de la production d'ATP et le transfert d'équivalents d'énergie dans le cytoplasme 2 , mais il forme également la membrane interne mitochondriale dans les crêtes tubulaires 6 , </ Sup> 7 . Les études d'assemblage de supercomplexes lors d'un développement cardiaque dans des embryons de souris montrent que la génération de supercomplexes contenant du Cx-I dans le cœur commence à environ le jour embryonnaire 13,5 8 . D'autres ont montré que la quantité de supercomplexes contenant du Cx-I diminue dans le cœur en raison du vieillissement ou des blessures par ischémie / reperfusion 9 , 10 ou peut jouer un rôle dans la progression des maladies neurodégénératives 11 .

Ce protocole décrit des méthodes pour le gel natif PAGE qui peuvent être utilisées pour étudier l'assemblage et l'activité des complexes ETC et des supercomplexes. Le poids moléculaire approximatif des supercomplexes mitochondriaux peut être évalué en séparant les complexes de protéines dans des gels de polyacrylamide CN ou BN. La PAGE CN permet également la visualisation de l'activité enzymatique de tous les complexes mitochondriaux directement dans le gel (dosage en gel;IGA) 12 . Ce travail démontre l'activité des respirasomes en soulignant la capacité du Cx-I à oxyder le NADH par IGA et la présence de synthasomes en raison de l'activité d'hydrolyse ATP de Cx-V par IGA. Les complexes multiples et les supercomplexes contenant Cx-I et Cx-V peuvent également être démontrés en transférant les protéines sur des membranes de nitrocellulose et en effectuant un immunoblot. L'avantage de cette approche est que BN ou CN PAGE sépare généralement les complexes de protéines en fonction de leur taille et de leur composition physiologiques; Le transfert vers une membrane préserve ce motif de bandes. L'analyse de complexes de protéines dans une PAGE BN ou CN peut également être effectuée en utilisant 2D-PAGE (voir Fiala et al 13 pour une démonstration) ou par centrifugation 14 , 15 de densité de saccharose. Pour analyser plus avant une bande spécifique, elle peut être excisée de la BN PAGE, et les protéines de ce complexe protéinique peuvent être purifiéesD en les électroelutant dans des conditions natives. L'électroélution native peut être effectuée en quelques heures, ce qui pourrait faire une différence significative pour la diffusion passive (telle qu'utilisée dans la référence 16) des protéines d'un gel dans le tampon environnant.

En résumé, ces méthodes décrivent plusieurs approches qui permettent de caractériser davantage les supercomplexes de poids moléculaire élevé des membranes mitochondriales.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des coeurs à partir de souris C57BL / 6N (type sauvage). Les souris ont été anesthésiées avec du CO 2 avant la dislocation cervicale et toutes les procédures ont été effectuées en stricte conformité avec la Division de la médecine animale de laboratoire de l'Université de Rochester et conformément à la loi de l'État, à la loi fédérale et à la politique des NIH. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Rochester (Comité universitaire sur les ressources animales).

1. CN et BN PAGE

REMARQUE: Tous les équipements utilisés pour BN et CN PAGE doivent être exempts de détergent. Pour ce faire, lavez tous les équipements avec de l'acide chlorhydrique 0,1 M, puis rincez abondamment avec de l'H 2 O désionisé.

  1. Préparation
    1. Préparer un tampon anodique constitué de 25 mM d'imidazole, pH 7,0, à 4 ° C; Conserver à 4 ° C.
    2. Préparez un tampon cathodique pour CN ou BN PAGE.
      1. Pour le CN PAGE, utiliser 7,5 mM d'imidazole et 50 mM de tricine; Ajouter 0,5 g de désoxycholate de sodium et 0,2 g de lauryl maltoside par litre de tampon. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
      2. Pour BN PAGE, utiliser 7,5 mM d'imidazole et 50 mM de tricine et ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C. Conserver à 4 ° C.
      3. Pour le tampon cathodique BN bleu clair, utiliser de l'imidazole 7,5 mM et de la tricine 50 mM. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et ajouter 20 mg de Coomassie par litre de tampon. Conserver à 4 ° C.
    3. Préparer le tampon d'extraction (EB) avec 50 mM de NaCl, 50 mM d'imidazole, 2 mM d'acide aminocaproïque et 1 mM d'EDTA. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    4. Préparez un tampon de gel 3x (utilisé pour les gels BN et CN) avec 75 mM d'imidazole et 1,5 M d'acide aminocaproïque. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    5. Préparer un tampon de chargement (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glycerol et 5 mL de H 2 O. Entreposer dans la piècetempérature.
    6. Préparez le bleu de Coomassie en ajoutant 50 mg de Coomassie à 1 mL d'acide 6-aminohexanoïque 500 mM. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    7. Préparer 20 mM et 200 mM de lauryl maltoside dans H 2 O. Faire des aliquotes de 200 μL et les conserver congelées. Décongeler le détergent avant utilisation.
3% à 8% (mini) 4% à 10% (maxi)
0,5 gels (lumière) 0,5 gels (lourds) 0,5 gels (lumière) 0,5 gels (lourds)
AAB (ml) 0,42 1.3 2.5 7.7
Tampon CN / BN (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (ml) 2,7 1.4 14 6.3
Glycérol (g) 0 0,47 0 2.5
Volume (ml) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 dix dix

Tableau 1: Quantités d'ingrédients nécessaires pour verser 1 mini- ou Maxi-PAGE. Les volumes utilisés dans ce tableau sont calculés pour 1 mini- ou 1 maxi-gel, 1,5 mm d'épaisseur. Le volume d'AAB repose sur une solution stock de 40%. Light et heavy se réfèrent au concentratDe AAB. APS et TEMED sont ajoutés après chaque colonne du mélangeur gradient est rempli avec une solution AAB.

  1. Verser et geler des gels
    REMARQUE: Utilisez un gradient de 3-8% ou 4-10% d'acrylamide / bisacrylamide (AAB) pour les gels CN ou BN, respectivement. Le tableau 1 résume les quantités de tampon, AAB, H 2 O, le glycérol, le sulfate d'ammonium (APS) et la tétraméthyléthylènediamine (TEMED) utilisé pour un mini-gel (85 mm de large x 73 mm de haut x 1,5 mm d'épaisseur) ou maxi-gel (160 Mm large x 200 mm de haut x 1,5 mm d'épaisseur). Les assemblages de plaques de verre avec des gels CN ou BN peuvent être réfrigérés dans un sac avec quelques ml de 1x tampon de gel ou enveloppés dans une serviette en papier mouillée avec 1x tampon de gel pour stockage. Les gels sont stables pour une utilisation jusqu'à une semaine.
    1. Pour verser le gel, placez le mélangeur à gradient sur une plaque d'agitation élevée pour s'assurer que le gel s'écoule par gravité dans la chambre de gel préparée.
    2. Remplir la chambre de sortie du mélangeur gradient avec 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) de la solution lourde (avec une concentration accrue d'AAB).
    3. Ouvrez délicatement la connexion de la bague d'arrêt entre la chambre lourde et légère et permettez une goutte de solution de passer de l'autre côté.
      REMARQUE: ceci entraîne des bulles d'air du tube de raccordement et du robinet, ce qui empêchera l'écoulement entre les deux chambres. Cela ne peut pas être fait si les deux côtés ont déjà été remplis, car la pression égale empêchera la bulle de se déplacer.
    4. Remplissez l'autre chambre du mélangeur gradient avec 4,72 / 25 ml (mini / maxi) de la solution légère.
    5. Placez une barre d'agitation dans la chambre de sortie avec la solution lourde et commencez à remuer. Utilisez une vitesse de barre d'agitation qui ne provoque pas de bouillonnement.
    6. Ajoutez rapidement APS et TEMED à chaque chambre pour lancer la polymérisation.
    7. Ouvrez la connexion entre les deux chambres du mélangeur gradient et permettez le mélange pendant quelques secondes avant d'ouvrir la chambre de sortie pour verser le gel.
      REMARQUE: gravité avecIl enverra les deux chambres également, et le mélange de la lumière dans la solution lourde diminuera lentement la densité d'acrylamide du fond vers le haut du gel. Utilisez le contenu entier qui se trouve dans le mélangeur gradient pour verser le gel.
      1. À la fin, montez soigneusement le peigne, avec les puits à l'intérieur du gel pour éviter le mélange de bulles et de couches.
    8. Laver immédiatement le mélangeur à gradient avec de l'éthanol pour rincer tout gel. Rincer à l'eau et verser le second gel. Laissez les gels polymériser (généralement moins de 20 min est nécessaire pour les mini-gels).
    9. Pour faire fonctionner les gels, montez-les dans la pince de l'assemblage de l'électrode et remplissez la chambre centrale / supérieure avec un tampon cathodique CN ou bleu clair. Attendez quelques minutes pour vérifier les fuites avant d'ajouter un tampon d'anode à la chambre extérieure / inférieure.
      1. Retirez délicatement les peignes et lavez les puits avec un tampon cathodique à l'aide d'une seringue ou d'une pipette.
      2. Faites fonctionner les gels dans une chambre froide (4 ° C) ou complètement emballés dans de la glace.
        1. Pour la mini-PAGE du CN, utilisez 100 V pour la première heure et 200 V jusqu'à fin, habituellement 1 h 1-1. Sinon, exécutez la mini-PAGE du CN à 30-40 V pendant la nuit.
          NOTE: L'accent est mis ici sur les complexes de protéines de poids moléculaire élevé, de sorte que les complexes de protéines avec un poids moléculaire inférieur à 140 kDa seront éliminés du gel. Des temps de fonctionnement plus courts pour l'électrophorèse peuvent être utilisés pour conserver des complexes de faible masse moléculaire.
        2. Pour BN maxi-PAGE, utilisez 100 V et exécutez les gels pendant la nuit (environ 18 h).
          REMARQUE: le courant sera très faible (<15 mA), donc une alimentation électrique capable de gérer ces conditions est nécessaire. À ce stade, les gels peuvent être utilisés pour l'IGA ou l'immunoblot. Dans certains cas, des bandes ou des voies peuvent être découpées des gels à l'aide d'une lame de rasoir sur une plaque de verre pour une électroélution.
  2. La préparation des échantillons
    REMARQUE: les supercomplexes mitochondriaux liés à la membrane doivent être extraits deE membrane interne mitochondriale. Pour préserver les supercomplexes mitochondriales, utiliser des mitochondries fraîchement isolées ou des échantillons qui ont été congelés et décongelés une seule fois. Les calculs / volumes ci-dessous sont donnés pour les mini-gels (le puit d'un peigne de 10 po dans un gel d'une épaisseur de 1,5 mm peut contenir jusqu'à 35-40 μL) et des maxi-gels (le puit d'un peigne de 15 po jusqu'à 200 μL). En outre, sauvegardez une aliquote de chaque échantillon (habituellement 10 μl), à exécuter sur un gel SDS dénaturant pour la détection du canal anion dépendant de la tension (VDAC), en tant que commande de chargement.
    1. Placez une quantité appropriée ( par exemple, 10 à 50 μg de protéines pour les mini-gels et 50 à 200 μg pour les maxi-gels) de mitochondries isolées ou d'homogénéisation tissulaire dans des microtubges et centrifugez à 17 000 xg pendant 10 à 15 minutes à 4 ° C.
      REMARQUE: Cette étape supprime certaines des protéines mitochondriales solubles et / ou cytosoliques.
    2. Aspirer et jeter le surnageant et ajouter le tampon d'extraction à la quantité désiréePour charger sur le gel. Ressusciter doucement le sédiment sur la glace. Si désiré, ajouter un mélange général d'inhibiteur de protéase à ce stade.
      NOTE: Selon l'équipement utilisé ici, 30 μL ont été utilisés pour un mini-gel et 100 μL pour un maxi-gel, limitant le rapport protéine / tampon à pas plus de 2 μg de protéines à 1 μL de tampon.
    3. Ajouter un détergent ( p. Ex., 2 μg de lauryl maltoside / 1 μg de protéines, voir les résultats et les discussions des représentants pour plus d'informations).
      NOTE: Généralement, lauryl maltoside est utilisé, mais le digitonin peut également être utilisé.
    4. Incuber sur de la glace pendant 20 min. Mélanger doucement au début et de temps en temps pendant l'incubation en triturant et / ou en agitant le tube.
    5. Centrifuger à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les fragments de membrane et de tissu.
    6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour les échantillons du CN, ajouter 1 μL de LB pour chaque 10 μL de volume d'échantillon; Le volume total de l'échantillon devrait être une applicationEnviron 40 μL pour un mini-gel et 130 μl pour un maxi-gel. Pour les échantillons de BN, ajouter Coomassie aux échantillons afin que le rapport du colorant au détergent soit de 1: 4 (p / p).
    7. Chargez 30 et 120 μL des échantillons dans les puits du mini- ou maxi-gel, respectivement. Utilisez les 10 μL restants de chaque échantillon pour le gel SDS dénaturant pour détecter VDAC comme un contrôle de chargement.
    8. Pour préparer les marqueurs de poids moléculaire, dissolvez 1 flacon d'un mélange d'étalonnage de poids moléculaire élevé (voir la Table des matériaux pour plus d'informations) dans 60 μL de tampon de gel BN / CN et ajouter 120 μL de H 2 0 et 20 μL de KG. Chargez 15 μL par voie.
    9. Exécutez les gels comme indiqué à l'étape 1.2.9.2.

2. Dosages en gel pour Cx-I et Cx-V

NOTE: Les tests sont effectués à température ambiante. Prenez des photos, des analyses ou des images des bandes en développement pour obtenir de la documentation. (Important) Les protéines ne peuvent pas être transféréesO membranes de nitrocellulose après avoir complété une IGA.

  1. Test Cx-I
    1. Préparation.
      1. Préparer un tampon de dosage de Tris 5 mM dans H 2 O, avec un pH de 7,4; ranger à température ambiante.
      2. Dissoudre 10 mg de NADH dans 1 ml de tampon de dosage. Conserver en parties aliquotes de 100 μL à -20 ° C jusqu'à l'utilisation; Éviter le gel et la décongélation.
      3. Peser 25 mg de Nitroblue tetrazolium dans un microtube.
      4. Préparer le fixateur en diluant 5 mL d'acide acétique dans 95 mL de H 2 O; ranger à température ambiante.
    2. Effectuer l'analyse.
      1. Mélanger 10 ml de tampon de dosage avec 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentration finale: 2,5 mg / mL) et 100 μL de 10 mg / mL de NADH (0,1 mg / mL). Ajoutez ceci à l'ensemble du gel, d'une voie ou d'une zone d'intérêt excisée à partir d'un gel CN.
        REMARQUE: ceci peut se faire dans un contenant transparent en plastique ou en verre. Veuillez noter que ce test ne peut pas être effectué après BN PAGE.
      2. Suivez le développement de bandes bleues après une agitation douce (rocker) pendant> 3 min.
      3. Fixer le gel dans 10 à 20 ml de solution d'acide acétique ou laver dans du Tris 5 mM, pH 7,4 pour arrêter la réaction. Prenez des photos pour la documentation (voir la table des matières).
  2. Test Cx-V
    REMARQUE: Le dosage de Cx-V doit être effectué en utilisant des gels de CN ou de BN additionnels, où l'on incube avec 5 μg / mL d'oligomycine (un inhibiteur de Cx-V) pour démontrer une activité indépendante de Cx-V.
    1. Préparation.
      1. Préparer un tampon de dosage avec Tris 35 mM et glycine 270 mM; Ajustez le pH à 8,3 à température ambiante. Stocker le tampon congelé dans des aliquotes de 50 ml, mais vérifier le pH après la congélation et la décongélation.
      2. Préparer MgSO4 1 M dans H 2 O; Conserver à 4 ° C jusqu'à l'utilisation.
      3. Peser 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 dans un microtube.
      4. Pesez 60 mg d'ATP dans un microtube.
      5. Dissoudre 1 mg de oLigomycine dans 1 mL d'éthanol. Conserver à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
      6. Préparer un fixateur en mélangeant 50 ml de methanol avec 50 ml de H 2 O; ranger à température ambiante.
    2. Effectuer l'analyse.
      1. Incuber un gel, une voie ou une zone d'intérêt d'un gel BN ou CN pendant 2 h avec une agitation douce (rocker) dans 10-20 ml de tampon d'essai ± 5 μg / mL d'oligomycine (50-100 μL de 1 mg / Ml dans l'éthanol) à température ambiante.
      2. Après l'incubation, remplacer le tampon avec 14 mL de tampon de dosage frais et ajouter, dans l'ordre, 190 μL de MgSO4 1 M (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg d'ATP ( 8 mM) et 75 uL d'oligomycine (le cas échéant).
      3. Incuber avec une agitation douce (rocker) et regarder un précipité blanc, car les bandes sur les gels traités à l'oligomycine donneront des bandes non dépendantes de Cx-V.
        REMARQUE: L'apparition du précipité peut prendre plusieurs heures.
      4. Fixer le gel dans le methanol-( Par exemple, 50% de méthanol), car les solutions acides dissolvent le précipité de plomb. Photographiez les résultats.
        REMARQUE: Le précipité de plomb n'interfère pas avec la coloration de Coomassie des gels.

3. Transfert de protéines vers des membranes de nitrocellulose ou de difluorure de polyvinylidène (PVDF)

  1. Préparer un tampon de transfert de Tris 25 mM et de glycine 200 mM. Ajuster le pH à 8,3 et ajouter 0,0005 g / L de SDS et 200 ml / L de méthanol. Ranger à température ambiante.
    1. Couper une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (taille des pores: 0,45 μm) avec une lame de rasoir ou des ciseaux à une taille légèrement supérieure à celle du gel.
      NOTE: Les membranes de nitrocellulose permettent la coloration de Ponceau S pour évaluer le chargement des protéines, tandis que les membranes PVDF produisent des bandes plus nettement définies.
  2. Protocole.
    1. Faire tremper la membrane de nitrocellulose, le papier filtre et les éponges pour unAu moins 10 minutes en mémoire tampon de transfert. Placez la membrane PVDF dans du methanol à 100% pendant 15 s ou selon la recommandation du fabricant avant de la placer dans un tampon de transfert. Placez la cassette ouverte du kit de transfert dans un bol plat avec tampon de transfert.
    2. Placez l'éponge et 1 à 2 couches de papier filtre à l'arrière de la cassette. Retirez les bulles.
    3. Placez le gel sur le papier filtre. Indiquez l'orientation du gel en coupant un coin du gel et / ou de la membrane.
    4. Placez la membrane sur le dessus du gel. Supprimez toutes les bulles.
    5. Placez le papier filtre et une éponge sur le dessus de la membrane. Retirez toutes les bulles dans ce sandwich.
    6. Fermez la cassette et placez-la dans le support de cassette du kit de transfert.
    7. Transférer les protéines à 25 V pendant environ 12-18 h.

4. Immunoblot

  1. Préparation.
    1. Préparer une tache de Ponceau (500 mL) en ajoutant 25 mLD'acide acétique et 0,5 g de Ponceau S à 475 ml d'H 2 O; Conserver à température ambiante (peut être réutilisé).
    2. Préparer une solution saline tamponnée au Tris (TBS) avec 200 mM de NaCl, 25 mM de Tris-Base et 2,7 mM de KCl. Réglez le pH à 8,0 et conservez à la température ambiante.
    3. Préparez TBS-tween (TBST) en ajoutant 0,5 mL / L Tween 20 à TBS; ranger à température ambiante.
    4. Préparer des solides au lait / TBST en dissolvant 5 g de solides de lait dans 100 mL de TBST. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 3 jours.
    5. Préparer BSA / TBST en dissolvant 3 g de sérum albumine bovine (BSA, fraction V) dans 100 mL de TBST. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 3 jours.
  2. Protocole.
    1. Lorsque le transfert est terminé, placez la membrane dans la solution Ponceau S pour visualiser toutes les protéines transférées. Étiqueter la position des marqueurs sur la membrane avec un crayon et documenter la membrane colorée Ponceau-S par une photographie ou un balayage.
    2. Laver la membrane 3 fois pendant 10 min chacune wiTh TBS sous une agitation douce.
    3. Bloquer la membrane avec des solides au lait / TBST pendant 1-2 h à température ambiante ou pendant une nuit dans une chambre froide avec une agitation douce.
    4. Laver la membrane pendant 10 minutes avec TBST sous agitation douce.
    5. Incuber avec un anticorps primaire pendant la nuit dans la chambre froide sous agitation douce. Diluer l'anticorps ( par exemple 1: 1 000 pour anti-ATP5A et -NDUFB6) dans BSA / TBST.
      NOTE: La plupart des anticorps donnent un meilleur signal sur les membranes à partir de gels indigènes lorsqu'ils sont incubés pendant une nuit.
    6. Laver la membrane pendant 10 minutes avec TBST sous agitation douce.
    7. Incuber avec un anticorps secondaire pendant au moins 60 minutes à température ambiante pour une agitation douce. Diluer l'anticorps (1: 5000 à 1: 50 000) dans du solide de lait / TBST.
    8. Laver la membrane 3 fois pendant 10 min à température ambiante avec du TBST sans agitation douce.
    9. Pendant le dernier lavage, préparer le substrat de chimioluminescence améliorée (ECL) selon les instructions de la manufaCturer.
    10. Incuber la membrane avec un substrat ECL en utilisant les instructions fournies par le fabricant.
    11. Détecter le signal sur le film en utilisant les instructions fournies par le fabricant du substrat ECL.

5. Electroélution

  1. Préparation.
    1. Préparer un tampon d'élution de 25 mM de tricine, 3,75 mM d'imidazole (pH 7,0 à 4 ° C) et 5 mM d'acide 6-aminohexanoïque.
      REMARQUE: Portez des gants en tout temps lors de la manipulation des électro-neutrons et des capuchons de membrane pour éviter toute contamination par des protéines externes.
  2. Le jour avant l'utilisation de l'électro-neutre pour l'électroélution native, procédez comme suit:
    1. Trempez les bouchons de membrane (coupure: 3,5 kDa) dans le tampon d'élution pendant 1 h à 60 ° C. Transférez les bouchons sur un tampon d'élution neuf et trempez pendant 12 h ou plus dans le réfrigérateur.
      REMARQUE: un poids moléculaire de coupure de 3,5 kDa empêche la perte de petit pLes rotéines qui peuvent facilement se dissocier du complexe protéique d'intérêt.
    2. Lavez le module électroeluter, les tubes en verre, le réservoir et le couvercle à fond avec de l'éthanol. Rincer à l'eau et laisser sécher l'équipement.
  3. Le jour de l'électroélution native, procédez comme suit.
    1. Placez une fritte dans le fond (givré) de chaque tube de verre à utiliser. Si nécessaire, placez le tube de verre dans le tampon d'élution et enfoncez la fritte de l'intérieur vers le bas du tube.
    2. Poussez le tube de verre avec la fritte dans le module de l'électro-neutre. Mouiller le passe-fils avec un tampon d'élution et faire glisser le tube de verre en place. Assurez-vous que le sommet des tubes en verre soit même avec le passe-fils.
    3. Fermez les oeillets vides avec des bouchons.
    4. Placez un capuchon de membrane humide au fond de l'adaptateur de silicone et remplissez l'adaptateur avec un tampon d'élution. Pipeter lentement le tampon dans l'adaptateur vers le haut et vers le bas pour éliminer les bulles d'air autour de la membrane de dialyse.
    5. Faites glisser l'adaptateur tampon vers le bas du tube de verre. Retirez toutes les bulles qui apparaissent sur la fritte dans le tube de verre.
    6. Remplir chaque tube de verre avec un tampon d'élution.
    7. Placez les bandes excisées de BN PAGE dans les tubes en verre (voir l'étape 1.2.9.3). Couper les gros morceaux en petits morceaux. Assurez-vous que la hauteur de remplissage dans le tube de verre est d'environ 1 cm.
    8. Placez l'ensemble du module dans le réservoir.
    9. Ajouter environ 600 ml de tampon d'élution à froid dans le réservoir. Assurez-vous que les capuchons d'adaptateur en silicone sont dans le tampon pour éviter les bulles à la membrane de dialyse.
    10. Placez une barre d'agression au fond du réservoir.
      REMARQUE: l'agitation empêchera les bulles de coller au fond de la membrane de dialyse.
    11. Eluisez les protéines pendant 4 h à 350 V dans une chambre froide.
    12. Une fois l'élution terminée, retirez le module électroeluter du réservoir tampon et placez-le dans un évier ou un bol.
    13. Si un bouchon a été utilisé, retirez-leDans la chambre tampon supérieure. Sinon, utilisez une grande pipette pour retirer le tampon.
    14. Retirez le tampon de chaque tube de verre et jeter. Assurez-vous que l'adaptateur en silicone reste en place et que le liquide sous la fritte ne soit pas perturbé ou secoué.
    15. Retirez délicatement l'adaptateur en silicone, ainsi que le capuchon de membrane du fond du tube de verre. Pipettez le contenu (environ 400 μl) du capuchon en silicone dans un microtube. Avec 200 μL de tampon d'élution, rincer le capuchon de silicone et ajouter au microtube. Répétez pour tous les tubes en verre.
    16. Comme les bouchons de membrane peuvent être réutilisés, conserver les bouchons de membrane en les plaçant dans un tampon d'élution contenant 0,5 mg / ml d'azoture de sodium. Réfrigérez-les.
      NOTE: L'éluat a une faible concentration en protéines et peut être concentré à l'aide d'un filtre centrifuge.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour visualiser les supercomplexes mitochondriales, des mitochondries fraîchement isolées de souris ont été utilisées 17 , 18 . Les supercomplexes mitochondriales sont sensibles aux cycles répétés de congélation et de décongélation, ce qui entraîne leur désintégration, bien que cela puisse être tolérable pour certains chercheurs. Si le gel est nécessaire pour le stockage, afin d'assurer les meilleurs résultats, les échantillons n...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un ETC fonctionnel est nécessaire pour la génération d'ATP mitochondriale. Les complexes de l'ETC peuvent former deux types de supercomplexes: les respirasomes (Cx-I, -III et -IV) 1 et les synthasomes (Cx-V) 2 . L'assemblage de chaque complexe est nécessaire pour un ETC intact, alors que l'organisation de l'ETC en supercomplexes est censée augmenter l'efficacité générale ETC 5 , 22 . La faço...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] et le Strong Children's Research Centre de l'Université de Rochester.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre mini-gel Protean IIBiorad1658004Kit complet pour couler et faire fonctionner l’électrophorèse mini-gel
Protean XL maxi-gelBiorad1653189Kit complet pour couler et exécuter l’électrophorèse maxi-gel
Gradient maker, Hoefer SG15VWR95044-704Couler des gradients de mini-gel
Gradient maker, maxi-gelVWRGM-100Verser maxi-gel gradients
Kit de transfertBiorad1703930Kit complet pour le transfert humide de protéines sur membranes
Électroéluteur modèle 422Biorad1652976Électroélution de protéines natives ou SDS PAGES Plaques de
verreBiorad1653308Plaques courtes
Plaques de verreBiorad1653312Plaques d’espacement
Plaquesde verrePlaques intérieures Biorad1651823
Plaques en verre PlaquesBiorad1651824Plaques
extérieures AlimentationBiorad1645070Alimentation adaptée à l’électrophorèse native
ECL-Western  ;Thermo Scientific32209Substrat de chimiolumniscense
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Substrat de chimiolumniscense amélioré
Film/film d’autoradiographieGE Health care28906845Documentation des transferts Western
Processeur de film CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640  ;CanonNAPrise de photos pour documenter les gels, les membranes et les taches.
Capot d’appareil photo Canon Power Shot 640Appareil photo blindé Canon pour les photos prises sur une table lumineuse
Désoxychélate de sodiumSigmaD66750Détergent
EDTASigmaE5134
SaccharoseSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Tampon
ImidazoleSigmaI15513Tampon
Lauryl maltosideSigmaD4641Détergent
Coomassie G250Biorad161-0406
Acide aminohexanoïqueSigmaO7260
Native kit de poids moléculaireGE Health care  ;17-0445-01Kit de calibrage de haut poids moléculaire pour électrophorèse native.
NameCompanyNuméro de catalogueComments
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP  ;   ;SigmaA2383
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2) :Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
Nom SociétéNuméro de catalogueComments
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748anticorps contre la sous-unité ATP synthase ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244contre la sous-unité Cx-1 NDUFB6
anti-VDACAnticorps calbiochem529534contre VDAC
ECL HRP Anticorps liésHealth CareNA931VAnticorps secondaire contre ATP5A, NDUFB6 et VDAC
Réactif bloquantBiorad170-6404
BSA
Chlorure de sodiumSigmaS9888
Chlorure de potassiumSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Kit de coloration à l’argentInvitrogenLC6070
extérieures Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 solution pré-mélangée à 40 % Glycine Sigma G7403 SDS (dodécylsulfate de sodium)Invitrogen 15525-017 Tris-base Sigma T1503 Tampon Tricine Sigma T0377 anticorps GE

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Supercomplexes mitochondriauxPAGE native bleueimmunotransfertassemblage de complexes prot iquesbiologie mitochondrialeisolation mitochondriale

Articles connexes