La perfusion DiI comme méthode de visualisation vasculaire dans Ambystoma mexicanum

Résumé

En utilisant une technique lipidique lipophile de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), Ambystoma mexicanum peut subir une perfusion vasculaire pour permettre une visualisation facile du système vasculaire.

Résumé

Les techniques de perfusion ont été utilisées depuis des siècles pour visualiser la circulation des tissus. Axolotl (Ambystoma mexicanum) est une espèce de salamandre qui est apparue comme un modèle essentiel pour les études de régénération. On sait peu de choses sur la façon dont la revascularisation se produit dans le contexte de la régénération chez ces animaux. Ici, nous rapportons une méthode simple pour la visualisation de la vascularisation dans l'axolotl par perfusion de perchlorate de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine (DiI). DiI est un colorant de carbocyanine lipophile qui s'insère instantanément dans la membrane plasmique des cellules endothéliales. La perfusion se fait à l'aide d'une pompe péristaltique telle que DiI entre dans la circulation à travers l'aorte. Pendant la perfusion, le colorant s'écoule à travers les vaisseaux sanguins de l'axolotl et incorpore dans la bicouche lipidique des cellules endothéliales vasculaires lors du contact. La procédure de perfusion prend environ une heure pour un axolotl de huit pouces. Immédiatement après la perfusion avecThiI, l'axolotl peut être visualisé avec un microscope fluorescent confocal. Le DiI émet de la lumière dans la gamme rouge-orange lorsqu'il est excité par un filtre fluorescent vert. Cette procédure de perfusion DiI peut être utilisée pour visualiser la structure vasculaire des axolotls ou pour démontrer des modèles de revascularisation dans les tissus régénérants.

Introduction

La visualisation de la vascularisation joue un rôle essentiel dans la compréhension de la structure et de la fonction des organismes dans de nombreuses espèces. À partir du 16 ^ème siècle avec Leonardo da Vinci, des modèles et des représentations graphiques de la circulation ont été étudiés ¹ . En utilisant des cires et des moules en caoutchouc, les tissus ont été perfusés pour créer des modèles tridimensionnels de la vascularisation, ce qui a permis d'étudier l'organogenèse et la pathogenèse ^{1 , 2} . Les résines et les cires ont été colorées avec des colorants tels que l'encre Inde ou le rouge carmin pour permettre leur visualisation facile ^{1 , 2} . Cependant, ces techniques ont causé de nombreuses problèmes parce que leurs viscosités élevées ont empêché une perfusion complète du tissu d'intérêt ¹ . Au fur et à mesure que le terrain devenait plus sophistiqué, l'utilisation de microscopes confocaux et électroniques entrainait, en déplaçant la technique de perfusion À l'écart des moules et aux perfusions liquides de la vascularisation, dont certains ont permis la perfusion et l'imagerie des vaisseaux sanguins sans détruire le tissu initial ³ . DiI, un colorant fluorescent de carbocyanine, est une telle tache qui permet la perfusion d'animaux sans endommager le tissu vasculaire.

Les colorants de carbocyanine sont des colorants lipophiles qui incorporent dans les membranes cellulaires lors du contact. Ces colorants permettent une coloration facile et instantanée des cellules endothéliales vasculaires, qui peuvent ensuite être visualisées sous un microscope confocal fluorescent. DiI se déplace par diffusion latérale dans la membrane lipidique des cellules, comme le montrent le marquage et le traçage des neurones ⁴ . Chimiquement, les deux chaînes alkyle de DiI donnent au colorant sa haute affinité pour les membranes cellulaires, tandis que deux anneaux conjugués d'un fluorochrome qui est responsable de l'émission d'une longueur d'onde rouge lorsqu'ils sont excités par des filtres fluorescents verts> 4. Le DII a été utilisé à bien des égards, y compris l'étiquetage réussi de la membrane plasmique et l'étiquetage antérogène et rétrograde dans les neurones ^{5 , 6} . DiI a déjà été utilisé dans les protocoles de perfusion lors de la visualisation du système vasculaire de souris ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sont des salamandres qui vivent exclusivement dans des lacs saumâtres près de Mexico, au Mexique. Ces animaux sont devenus un modèle important pour la compréhension des processus régénératifs car ils peuvent régénérer les membres complets, la queue (y compris le cordon nerveux), les parties du cœur et d'autres organes internes et des parties de l'œil en tant qu'addents ^{8 , 9} . En outre, avec la récente application d'outils génétiques dans les axolotls, un aperçu sans précédent des molécules et des cellules conduisant ces processus est maintenant possible ⁸ . Le regene réussieLa ration d'un membre entier nécessite un processus de revascularisation étendu, qui peut jouer un rôle important dans la régénération au-delà des fonctions traditionnelles des vaisseaux sanguins en fournissant de l'oxygène et des nutriments. La compréhension de la revascularisation dans le contexte de la régénération tissulaire est impérative. Les vaisseaux sanguins d'Axolotl ont déjà été visualisés en utilisant l'encre de l'Inde, et pendant que les résultats étaient intrigants, ce processus n'a pas été revisité au cours des décennies suivantes ¹⁰ . Nous avons cherché à adapter un protocole de perfusion DiI développé pour être utilisé chez les mammifères pour permettre une perfusion et une visualisation complète de la vascularisation axolotl ⁷ . Ce protocole décrit les étapes de perfusion et de visualisation ultérieure de la circulation axolotl avec une technique de coloration DiI. Cette procédure permettra une visualisation précise des vaisseaux sanguins brevetés dans les tissus homéostatiques, ainsi que dans la régénération des tissus, et fournit une nouvelle méthode de visualisationN et analyse du processus de revascularisation dans l'axolotl.

Protocole

Toute l'expérimentation axolotl a été effectuée conformément au Comité de soins et d'aide aux animaux institutionnels de Brigham and Women's Hospital (BWH).

1. Mettre en place l'expérience de perfusion

1. Placez un axolotl adulte dans un récipient en plastique rempli de solution de tricaine 0,1% (MS222) pendant 15-20 min ou jusqu'à ce qu'il soit complètement anesthésié. Assurez-vous que le récipient est rempli d'une solution de tricaine suffisante pour que l'axolotl soit complètement immergé.
   Remarque: Toutes les procédures doivent être effectuées conformément aux lignes directrices institutionnelles sur les soins des animaux. Chez BWH, un axolotl est considéré comme complètement anesthésié lorsqu'il échoue à un test de pincement de pied, ce qui signifie qu'il n'y a pas de mouvement réfléchi lorsque le pied est serré doucement.
   Attention: Bien que la tricaine soit une anesthésie spécifiquement utilisée pour les organismes aquatiques, il faut éviter le contact direct avec la peau avec la solution tricaine.
2. Mettre en place la station de perfusion axolotl.
   1. Placer leAbsorbant sur une surface plate et plane avec le côté absorbant vers le haut.
   2. Couper un trou dans le cadre en mousse de polystyrène qui est la taille et la forme appropriées pour que l'axolotl anesthésié soit positionné en position couchée. Placez le cadre sur le tampon absorbant.
      Remarque: Certaines serviettes en papier supplémentaires peuvent être placées immédiatement sous le cadre pour une absorbance supplémentaire.
   3. Chargez la pompe péristaltique avec le tube de perfusion. Réglez la pompe à un débit de 0,7 ml / min, coulant dans le sens des aiguilles d'une montre.
   4. Effectuez la solution diluée avec 0,7 x PBS et 5% de glucose dans un mélange 1: 4.
   5. Mélanger 10 mL de solution de diluant avec 200 μL de la solution mère DiI dans un tube conique de 50 mL. Cap et mélange par inversion. Couvrir ce tube avec du papier d'aluminium pour protéger la solution de travail de l'exposition à la lumière.
      Remarque: Les volumes doivent être modifiés en fonction de la taille de l'axolotl proportionnellement. Ces valeurs sont pour un axolotl d'environ 15 cm (longueur de queue à queue). UNELes nimaux de cette taille peuvent ne pas avoir atteint la maturité sexuelle complète, de sorte que le sexe animal peut ne pas être déterminé en ce moment.
   6. Remplir un tube conique de 50 ml avec PBS 0,7x.
      Remarque: PBS sera utilisé pour amorcer la boucle et l'exsanguination axolotl.
   7. Fixez l'aiguille à papillon calibre 27 à l'extrémité de sortie du tube de perfusion. Pliez les ailes de papillon l'une sur l'autre et placez-les dans le support de serrage.
   8. Placez l'extrémité libre du tube de perfusion dans le tube conique de 50 ml rempli de PBS 0,7x et faites fonctionner la pompe à perfusion jusqu'à ce que le tube entier soit rempli de solution. Pause la pompe une fois que le tube entier est rempli de PBS.
      Remarque: Assurez-vous que le tube est exempt de bulles d'air en tout temps, car cela entraînera des émboles d'air dans l'axolotl et empêchera la perfusion complète.
   9. Placez une serviette en papier dans le moule en forme d'axolotl dans le cadre en mousse de polystyrène. À l'aide d'une pipette de transfert, imbibez la serviette avec une solution de tricaine.
      Remarque: Couper un petit carré au milieu du câble de papierEl pour permettre le drainage des fluides pendant la procédure de perfusion.
   10. Placez l'axolotl déconneillé anesthésié sur la serviette en papier à l'intérieur du cadre en mousse de polystyrène.

2. Ouverture du coffre Axolotl

1. Utilisez des pinces chirurgicales pour pincer la peau le long de l'axe central de la poitrine de l'axolotl, juste en dessous de la ligne des épaules. Remonter.
2. Utilisez un scalpel pour faire une petite incision où la peau a été tirée.
3. Retirez un morceau de peau carré sur la poitrine afin de révéler deux plaques de cartilage.
   1. Retirez la peau pour ouvrir une fenêtre sur la cavité thoracique assez grande pour voir clairement le cœur et environ 5 mm de l'aorte se ramifiant du cœur.
4. Détachez soigneusement le tissu conjonctif à l'aide de pinces ou de ciseaux fermés afin d'éviter de couper tous les vaisseaux sanguins majeurs.
5. Soulevez chaque plaque de cartilage individuellement à l'aide de la pince et accusez-les.Avec les ciseaux chirurgicaux.
6. Pincez soigneusement le péricarde avec la pince, tirez-le, et percez-le à l'aide des ciseaux chirurgicaux; Cette incision devrait être juste assez profonde pour percer le pericardium très mince et devrait être suffisamment grande pour permettre l'élimination du péricarde. Veillez à ne pas couper le cœur.
7. Retirez délicatement le péricarde pour exposer le cœur et l'aorte.
   Remarque: À l'aide d'une pipette de transfert, rincer périodiquement la cavité thoracique et les branchies avec une solution de tricaine pour garder la zone dégagée et garder l'axolotl anesthésié.

3. Perfusion de l'Axolotl

1. Placez le support de serrage avec l'aiguille papillon chargée à côté du cadre en mousse de polystyrène, de sorte que le bras de la pince peut facilement être manipulé pour insérer l'aiguille dans l'aorte axolotl. Pointez la pointe de l'aiguille vers l'aspect rostral de l'animal pendant l'insertion et gardez l'aiguille parallèle à l'aorte pour éviter de la perforer à travers l'opCôté positif.
2. Allumez la pompe péristaltique. 0.7x PBS devrait continuer à circuler à travers les tubes.
3. Insérez l'aiguille dans l'aorte.
   1. Faites glisser la pince sous l'arc aortique et tirez légèrement pour permettre un accès facile.
   2. Manœuvrer la combinaison aiguille-serre telle que l'aiguille s'étend sur la longueur de l'aorte, en pointant vers la tête. Insérez l'aiguille tout en utilisant la pince pour le soutien derrière l'aorte.
      Remarque: L'aiguille doit être insérée suffisamment profondément dans l'aorte pour éviter qu'elle ne glisse pendant la perfusion. Cela peut être d'environ 5 mm pour un axolotl de 15 cm. Assurez-vous que l'aiguille est parfaitement adaptée à l'aorte pour éviter une ponction complète du vaisseau. Les piqûres traversantes peuvent provoquer une hémorragie massive et diminuer les taux de réussite de la perfusion. L'insertion réussie peut être confirmée par l'agrandissement visible des oreillers du cœur.
4. Détermine rapidement un atrium avec la sciSsors et permettre le drainage du sang.
   1. Rincer avec une solution de tricaine pour prévenir l'accumulation de caillots et la formation de caillots dans la cavité thoracique.
5. Perfuser l'axolotl avec environ 20-30 ml de PBS. L'animal doit passer d'un rose clair à un blanc dans une perfusion réussie.
6. Pause la pompe péristaltique et déplacez l'extrémité libre du tube dans le tube de 15 ml de la solution DiI. Redémarrez la pompe, veillez à ne pas créer de bulles d'air dans le tube.
7. Perfuser l'axolotl avec l'ensemble du stock de travail de DiI.
   Remarque: Dans une perfusion réussie, l'axolotl avec une couleur de changement au rose clair du DiI. Ce sera plus visible dans les branchies.
8. Pause la pompe après la perfusion avec DiI est terminée et placez l'extrémité libre du tube dans une solution à 4% de Paraformaldéhyde (PFA) pour réparer le tissu. Redémarrez la pompe et perfusez au moins 10 mL de PFA.
   Attention: le PFA est toxique et devrait être manipulé et dispoDe manière appropriée. Des gants et des lunettes de sécurité devraient être portés, et des solutions devraient être faites à l'intérieur d'une hotte aspirante. La perfusion de l'axolotl avec PFA pour réparer le tissu entraîne la mort de l'animal.

4. Fin de la préparation de la perfusion et de la visualisation

1. Arrêtez la pompe péristaltique et retirez l'aiguille de l'aorte axolotl.
2. Placez l'axolotl sur une plaque en plastique.
   Remarque: l'utilisation d'une moitié d'une grande boîte à pétri fonctionne bien et permet de verser une petite quantité de Tricaine ou PBS sur l'axolotl pour garder sa peau mouillée et améliorer la qualité de la visualisation.
3. Éliminer tous les matériaux utilisés dans les poubelles appropriées. Nettoyer les outils chirurgicaux avec de l'éthanol à 70%, désinfecter à l'aide d'un stérilisateur à perles de verre entre les animaux et stériliser en autoclave suivant la procédure. Rincez les tubes avec la solution PBS, puis évacuez, séchez complètement, et rangez-les pour une utilisation ultérieure.

5. Visualisation de l'Axolotl Perfused

1. Placez l'axolotl sous un microscope confocal fluorescent.
2. Éteignez les lumières, car la visualisation des vitres teintées par DiI est entravée par la lumière.
3. Utilisez un cube de filtre d'émission de fluorescence verte ( p. Ex. ET-CY3) avec le microscope confocal pour visualiser le système vasculaire de l'axolotl. Utiliser une lumière d'excitation de longueur d'onde 545 nm.
   Remarque: Pour obtenir une image de haute qualité, les paramètres suivants peuvent être utilisés: exposition pour 1.1 s, gain de 1x, saturation de 1.0, amplification de 2X.

Résultats

Avec la coloration DiI, le système vasculaire de l'axolotl peut être facilement visualisé. Les vaisseaux sanguins des animaux perfusés avec le colorant lipophile sont immédiatement visibles sous un microscope confocal fluorescent. La figure 1 .1-1.5 est une représentation schématique du protocole de perfusion. Après perfusion avec le colorant rose vif, un axolotl perfusion réussie apparaîtra en rose. À l'aide d'un filtre fluorescent vert sur...

Discussion

La visualisation du système vasculaire de l'axolotl peut être réalisée avec succès par perfusion avec le colorant carbocyanine lipophile, DiI. Dans cette étude, nous décrivons un nouveau protocole pour la perfusion de l'axolotl avec DiI à l'aide d'une pompe péristaltique. Nous montrons également la visualisation ultérieure de la vascularisation axolotl à l'aide d'un microscope confocal fluorescent. Ce protocole était une adaptation du protocole de perfusion DiI de rongeurs vu dans Li et al.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pompe péristaltique  ;	Marshall Scientific  ;	RD-RP1
Tubulure de perfusion	Excelon Lab & Tubulure sous vide	436901705	taille S1A
27g aiguille papillon	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4  ;	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Eau
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1&prime ;-Dioctadecyl-3,3,3&prime ;,3&prime ;- perchlorate de tétraméthylindocarbocyanine	Sigma Aldrich	468495
Éthanol (100 % vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Foreceps chirurgicaux  ;	Medline	MDG0748741
Cadre en mousse de polystyrène			mousse de polystyrène avec une découpe en forme d’axolotl
Ciseaux chirurgicaux	Medline	DYND04025
Scalpel  ;	Medline	MDS15210
Sous-coussin absorbant	Avacare Medical	PKUFSx
Essuie-tout
Pipette de transfert jetable standard	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine poudre
Axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Réservoirs			Tailles variables appropriées pour l’axolotl
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope Leica		M165 FC
ET-CY3 Filtre fluorescent	Leica	M205FA/M165FC
MS-222