Préparation de vésicules membranaires plasmatiques à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse pour une thérapie potentielle de remplacement du cytoplasme

Résumé

Les maladies liées à l'âge sont associées à de multiples défauts dans les composants du cytoplasme. Ici, nous présentons un protocole pour préparer des vésicules à membrane plasmatique à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse. Cette technique pourrait potentiellement être utilisée comme moyen de traitement de remplacement du cytoplasme pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge.

Résumé

Nous avons déjà signalé la génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV) par l'extrusion mécanique de cellules de mammifères. La fusion des PMV avec des cellules Rho0 déficitaires mitochondriales a restauré l'activité mitotique dans des conditions de culture normales. L'athérosclérose, le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et le cancer sont des maladies liées à l'âge qui ont été rapportées comme étant associées à de multiples défauts mécaniques et fonctionnels dans le cytosol et les organites d'une variété de types cellulaires. Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) représentent une population cellulaire unique à partir de la moelle osseuse qui possède des capacités d'auto-renouvellement tout en conservant leur multipotence. La supplémentation des cellules de sénescence avec un cytoplasme jeune provenant de BMSC autologues par fusion de PMV offre une approche prometteuse pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. Ce protocole décrit comment préparer des PMV à partir de BMSC par extrusion à travers une membrane en polycarbonate avec 31, m pores, déterminent l'existence de mitochondries et examinent le maintien du potentiel de membrane dans les PMV en utilisant un microscope confocal, concentrent les PMV par centrifugation et effectuent l'injection in vivo de PMV dans le muscle gastrocnémien de la souris.

Introduction

Un énorme effort a été consacré à l'établissement d'approches pour les thérapies de remplacement des gènes, des enzymes et des cellules. Cela a entraîné de grandes percées et même des applications cliniques ^{1 , 2 , 3} . Récemment, une thérapie de remplacement mitochondrie controversée basée sur la technologie de transfert de noyau a été appliquée à la fécondation in vitro pour les femmes de la vieillesse ou portant une mutation de l'ADN mitochondrial létale ⁴ . Les défauts constatés dans les maladies liées à l'âge, y comp....

Protocole

Des souris BALB / c de 8 à 12 semaines ont été achetées auprès du Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Chine) et élevées dans une installation animale sans agents pathogènes et climatisée. Les soins animaux et les procédures expérimentales étaient conformes aux lignes directrices pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire établis par l'Université de Shantou.

1. Assemblage de l'appareil

1. Pour assurer la stérilité, allumez la lumière UV d'un capuchon de culture tissulaire pendant 30 minutes avant utilisation.
2. Dévissez une unité de filtre jetable de 25 mm et immergez le capu....

Résultats

La clé d'une préparation réussie de PMV dépend fortement du bon assemblage de l'unité de filtrage ( Figure 1 ), qui peut être testé en poussant 1 mL de PBS à travers la membrane. En cas de fuite, remonter l'unité de filtration et tester à nouveau. Cependant, la fuite ne peut être testée de manière fiable que lorsque les cellules sont poussées à travers la membrane. Si seulement quelques PMV sont détectés sous un microscope régulier à l'aide de l'objectif 10X, ou si la ta.......

Discussion

La thérapie de remplacement du cytoplasme telle que proposée dans ce manuscrit présente des avantages uniques par rapport aux autres approches rapportées telles que la thérapie génique, moléculaire et cellulaire. Les PMV générés à partir de BMSC encapsulent non seulement les produits des gènes de souche, mais aussi des organites cellulaires intacts, qui sont essentiels pour remédier aux phénotypes de vieillissement associés à la sénescence. Lorsque le cytoplasme jeune est délivré aux cellules sénescentes, les mécanismes .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Membranes IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 mm
Unité de filtration jetable	Xinya, Shanghai, Chine	25 mm	Polypropylène de qualité médicale
Seringue à insuline	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	; 6085-1
Sondes moléculaires	MitoTracker	M7514	Vert FM, 1 &mu ; M
JC-1	Beyotime, Haimen, Chine	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, Chine	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75 000
Microscope à fluorescence	Nikon	Eclipse TE 2000	Avec caméra CCD
Microscope Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	Pour la transfection cellulaire