Article de méthode

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

DOI :

10.3791/55757

⸱

9 août 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

Résumé

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Infarctus du myocarde et la cascade ischémique ultérieure entraîner la perte étendue de cardiomyocytes, conduisant à l’insuffisance cardiaque congestive, la principale cause de mortalité dans le monde. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une option prometteuse pour les thérapies à base de cellules remplacer les techniques actuelles, envahissantes. MSCs peuvent se différencier en lignées mésenchymateuses, y compris les types de cellules cardiaques, mais complète différenciation en cellules fonctionnelles n’a pas encore été atteint. Les méthodes précédentes de différenciation reposaient sur des agents pharmacologiques ou de facteurs de croissance. Cependant, les stratégies pertinentes plus physiologiquement peuvent également activer MSCs subir des transformations cardiomyogénique. Nous présentons ici une méthode de différenciation utilisant des agrégats MSC sur couches de cardiomyocyte mangeoire pour produire des cellules maître cardiomyocyte.

Cordon ombilical humain périvasculaires cellules (HUCPVCs) ont démontré avoir une différenciation plus grande potentielle que couramment étudié les types de MSC, comme la moelle osseuse MSCs (BMSC). Comme une source ontologiquement plus jeune, nous avons étudié le potentiel de cardiomyogénique de HUCPVCs de (FTM) au premier trimestre par rapport à des sources plus anciennes. FTM HUCPVCs constituent une source originale, riche de MSCs qui conservent leurs in utero immunoprivileged propriétés lorsque cultivées in vitro. Utilisant ce protocole de différenciation, la FTM et le terme HUCPVCs atteint cardiomyogénique une augmentation significative de différenciation par rapport à BMSC, comme en témoigne l’augmentation de l’expression des marqueurs de cardiomyocytes (c.-à-d., myocytes enhancer facteur 2C, troponine T, la myosine cardiaque de chaîne lourde, signal protéine régulatrice α et connexin 43). Ils ont soutenu également significativement plus faible immunogénicité, tel que démontré par leur plus faible expression de HLA-A et l’expression de HLA-G plus élevée. Application de différentiation axée sur l’agrégat, FTM HUCPVCs a montré formation globale accrue potentiels et généré contractantes des amas de cellules dans la semaine suivant la co-culture sur couches alimentation cardiaque, devenant le premier type MSC de le faire.

Nos résultats démontrent que cette stratégie de différenciation permet d’exploiter efficacement le potentiel de cardiomyogénique du jeunes MSCs, tels que les FTM HUCPVCs et suggère que cette différenciation in vitro préliminaire pourrait être une stratégie possible pour augmenter leur efficacité régénératrice in vivo.

Introduction

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Insuffisance cardiaque congestive (ICC) persiste comme des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. CHF survient souvent suite à la perte massive des cardiomyocytes et le développement du tissu de cicatrice acellulaire pathologique suite à un infarctus du myocarde (im)1. Alors que le cœur est un organe partiellement autorenouvellement, le résident souches et progénitrices cell pool chargé d’exécuter la régénération tissulaire significativement diminue dans l’abondance et la fonction chez les patients âgés, devenant souvent insuffisante pour une récupération optimale après une blessure. Il y a donc beaucoup d’intérêt dans l....

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Protocole

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Toutes les études impliquant des animaux ont été menées et rapportées conformément aux directives ARRIVE48. Toutes les études ont été réalisées avec l’approbation du comité d’éthique de la recherche de l’établissement (numéro de CER 454-2011, Institut de recherche Sunnybrook ; REB 29889, Université de Toronto, Toronto, Canada). Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé (Toronto, Canada), et tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8e édition (National Institutes of Hea....

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Résultats

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Les HUCPVCs présentent un potentiel de formation d’agrégats et des niveaux d’expression de CD49f plus élevés que les BMSC :

Pour induire la différenciation des hMSCs (c’est-à-dire les HUCPVCs FTM, les HUCPVCs à terme et les BMSC), des suspensions unicellulaires de MSC indifférenciées ou de gouttes suspendues contenant des MSC (Tableau 1) ont été transférées sur des monocouches primaires.......

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Discussion

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La différenciation cardiaque de cellules souches a été en développement depuis plus de 2 décennies, avec plusieurs différentes stratégies utilisées pour générer des cellules cardiomyocytes provenant de sources MSC. Beaucoup de ces stratégies, cependant, sont inefficaces, et les conditions d’utilisation ne sont souvent pas représentatifs du milieu transplanté des cellules rencontre in vivo.

Contrairement aux méthodes existantes, le protocole présenté ici utilise une combinaison de couc.......

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Déclarations de divulgation

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Dr. Clifford L. Librach est cotitulaire du brevet : méthodes d’isolement et d’utilisation de cellules provenant de tissus de cordon ombilical premier trimestre, accordé au Canada et en Australie.

Remerciements

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Les auteurs remercie les membres du personnel suivants et recherche du personnel pour leur contribution : Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg et Andrée Gauthier-Fisher. Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche The Ontario - Excellence de la recherche (ER-FRO, tour #7) et créer Program Inc.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsine/EDTAGibco25200056Pour la dissociation cellulaire
Alpha-MEMGibco12571071Pour les milieux de culture HUCPVC et BMSC.
Anticorps CD49f humain / souris conjuguéBiolegend313612Marqueur d’intégrine pour l’anticorps
humain Cx43/GJA1 conjugué FC APCR& D SystemsFAB7737Amarqueur Connexin 43 pour l’anticorps
HLA-A2 conjugué à FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Marqueur d’immunogénicité pour
l’anticorps anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugué à FC FITCAbcamab7904Marqueur d’immunogénicité pour
l’anticorps anti-humain SIRPA/CD172a de souris conjuguée à FC FITCAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FMarqueur cardiaque pour
l’anticorps humain TRA-1-85/CD147 conjugué à FC APCR& D SystemsFAB3195AMarqueur cellulaire humain pour l’anticorps
humain TRA-1-85/CD147 conjugué& D SystemsFAB3195FMarqueur cellulaire humain pour FC et FACS
Anticorps anti-connexine 43/GJA1Abcamab11370Cx43. Pour l’anticorps
secondaire à absorption croisée ICC IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Pour l’anticorps
anti-sarcomérique alpha-actinine [EA-53]ICC Abcamab9465aSARC. Pour l’anticorps
secondaire à absorption croisée ICC Ruma IgM à chaîne lourde IgM, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Pour l’anticorps ICC
Mef2C (D80C1) XP pour lapinNew England BioLabs Ltd.5030SPour ICC
Donkey Anticorps IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Pour
Anti-noyaux (HuNu) (clone 235-1) AnticorpsEMD Millipore MAB1281Pour ICC
MZ9.5 StéréomicroscopeLeicaPour l’imagerie des agrégats.
Microtubes centrifuges de 1,5 mlAxygenMCT-150-CPour la coloration des CSM avec un colorant fluorescent.
ImageJLogiciel de traitement d’images open source.
Aria II  ;Établissement du BDUHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.
Moelle osseuse, cellules stromales méséchymateusesLonzaPT-2501BMSC,
albumine sérique bovineSigma-Aldrich,A7030-100GBSA. Pour préparer des solutions pour ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Attention : BrdU est un tératogène fort et suspecté d’être mutagène. Veuillez vous assurer d’une formation appropriée et vous référer à la FDS avant utilisation.
Canto IIBDUHN Établissement SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.
ADNc EcoDry PremixClontech/Takara639570Pour la préparation de l’ADNc pour qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Imagerie fluorescente du cytoplasme cellulaire
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogen Inc.C10227Pour le comptage cellulaire
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Pour milieu de culture primaire de cardiomyocytes chez le rat.
Gibco salin tamponné au phosphate de Dulbecco10010023D-PBS, sans Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesMicroscope fluorescent interne
FACSCaliburBDinterne. Pour la cytométrie en flux.
Sérum fœtal bovin (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Composant du milieu de culture cellulaire.
Sondes QPCR IDT Prime TimeIntegrated Data TechnologiesFAM fluorophorehttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Milieu de montage aqueuxThermoScientificTA-030-FMPour le stockage des cellules à soumettre ICC
LSR II  ;Établissement du BDUHN SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.
Établissement du MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.
Technologie de signalisation cellulairede sérum de chèvre normale5425SNGS. Utilisé dans la solution de blocage pour ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 puitsThermo Scientific Nunc155409Pour préparer des échantillons pour ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPEn tant que composant de la solution de perméabilisation lors de la préparation des cellules pour ICC
Paraformaldéhyde, solution à 16 %, EM GradeMicroscopie électronique Sciences15710Pour la fixation des cellules pour ICC.
Pénicilline/streptomycineGibco15140122Composant du milieu de culture cellulaire.
AmorcesSigmaCustom Standard DNA Oligos, dessalées, 0,2 &mu ; molCTnT_F : GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A ; CTnT_R : GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A ; MYH6 F : GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T ; MYH6 R : GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Cardiomyocytes dérivés de cellules hiPSReproCellRCD001NContrôle positif pour qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Pour isoler l’ARN pour qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Pour qPCR avec master mix
RPMI 1640GibcoA1049101Pour MSC, milieu de coculture de monocytes.
TaqMan qPCR amorcetests Thermo Fisher Scientific4444556Pour qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Coloration des cellules pour la viabilité et le comptage
TrypsineGibco 272500108Pour la dissociation cellulaire
VolocitéPerkin-ElmerVolocité 6.3Logiciel d’imagerie
0.2 &mu ; Filtre à poresThermo Fisher Scientific566-0020Pour la stérilisation des milieux de culture tissulaire
HERAcell 150i CO2 IncubateurThermo Fisher Scientific51026410Pour l’incubation
de cellules Solution saline tamponnée au phosphate DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium
ForcepsAlmedic7727- A10-704Pour la remise du cœur de rat. Peut utiliser n’importe quelle pince similaire.
CiseauxFine Science Tools14059-11Pour hacher le cœur du rat. Ciseaux incurvés recommandés.
Tube de 50 mLBD Falcon352070Pour le prélèvement de cardiomyocytes et les procédures générales de culture tissulaire
Tube de 15 mLBD Falcon352096Pour les procédures générales de culture tissulaire
Plaques à 6 puitsThermo Scientific NuncCA73520-906Pour la culture tissulaire
Boîtes de culture tissulaire de 10 cmCorning25382-428Pour la formation d’agrégats
Microscope Axiovert 40CZeissPour l’imagerie en fond clair tout au long de la culture tissulaire et du reste du protocole
Filtre à cellules mFisherbrand22363548Pour assurer une suspension unicellulaire avant la cytométrie en flux ou le tri
Triton X-100EMD Millipore9410-1LUtilisé dans une solution de perméabilisation pour ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Colorant utilisé lors de la visualisation de la localisation du Cx43
PE FC et FACS FITC R ICC , , 70 &mu ;

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.

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Mots-clés

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