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Article de méthode

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

10.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/55757

⸱

9 août 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

Résumé

Infarctus du myocarde et la cascade ischémique ultérieure entraîner la perte étendue de cardiomyocytes, conduisant à l’insuffisance cardiaque congestive, la principale cause de mortalité dans le monde. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une option prometteuse pour les thérapies à base de cellules remplacer les techniques actuelles, envahissantes. MSCs peuvent se différencier en lignées mésenchymateuses, y compris les types de cellules cardiaques, mais complète différenciation en cellules fonctionnelles n’a pas encore été atteint. Les méthodes précédentes de différenciation reposaient sur des agents pharmacologiques ou de facteurs de croissance. Cependant, les stratégies pertinentes plus physiologiquement peuvent également activer MSCs subir des transformations cardiomyogénique. Nous présentons ici une méthode de différenciation utilisant des agrégats MSC sur couches de cardiomyocyte mangeoire pour produire des cellules maître cardiomyocyte.

Cordon ombilical humain périvasculaires cellules (HUCPVCs) ont démontré avoir une différenciation plus grande potentielle que couramment étudié les types de MSC, comme la moelle osseuse MSCs (BMSC). Comme une source ontologiquement plus jeune, nous avons étudié le potentiel de cardiomyogénique de HUCPVCs de (FTM) au premier trimestre par rapport à des sources plus anciennes. FTM HUCPVCs constituent une source originale, riche de MSCs qui conservent leurs in utero immunoprivileged propriétés lorsque cultivées in vitro. Utilisant ce protocole de différenciation, la FTM et le terme HUCPVCs atteint cardiomyogénique une augmentation significative de différenciation par rapport à BMSC, comme en témoigne l’augmentation de l’expression des marqueurs de cardiomyocytes (c.-à-d., myocytes enhancer facteur 2C, troponine T, la myosine cardiaque de chaîne lourde, signal protéine régulatrice α et connexin 43). Ils ont soutenu également significativement plus faible immunogénicité, tel que démontré par leur plus faible expression de HLA-A et l’expression de HLA-G plus élevée. Application de différentiation axée sur l’agrégat, FTM HUCPVCs a montré formation globale accrue potentiels et généré contractantes des amas de cellules dans la semaine suivant la co-culture sur couches alimentation cardiaque, devenant le premier type MSC de le faire.

Nos résultats démontrent que cette stratégie de différenciation permet d’exploiter efficacement le potentiel de cardiomyogénique du jeunes MSCs, tels que les FTM HUCPVCs et suggère que cette différenciation in vitro préliminaire pourrait être une stratégie possible pour augmenter leur efficacité régénératrice in vivo.

Introduction

Insuffisance cardiaque congestive (ICC) persiste comme des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. CHF survient souvent suite à la perte massive des cardiomyocytes et le développement du tissu de cicatrice acellulaire pathologique suite à un infarctus du myocarde (im)1. Alors que le cœur est un organe partiellement autorenouvellement, le résident souches et progénitrices cell pool chargé d’exécuter la régénération tissulaire significativement diminue dans l’abondance et la fonction chez les patients âgés, devenant souvent insuffisante pour une récupération optimale après une blessure. Il y a donc beaucoup d’intérêt dans le développement des traitements expérimentaux qui impliquent la transplantation de cellules de donneur sain dans le myocarde endommagé. Il est impératif que les cellules du donneur non seulement restaurer la structure du tissu, mais aussi réaliser la récupération fonctionnelle du myocarde touché.

Le cœur natif emploie coeur tissu-résident et endogènes provenant de la moelle osseuse des cellules souches pour blessure après réparation2,3,4. Régénératrice des cellules hôtes et donateurs dérivés-alike-doit avoir la capacité d’obtenir le phénotype approprié et la fonction dans le micro-environnement du myocarde retouche, ainsi que la capacité de façon efficace et sécuritaire remplacer les cellules perdues. Méthodes de différenciation in vitro ont servi largement à atteindre de haut rendement, sur les cellules souches cardiomyocyte production5,6. Le profil d’expression des marqueurs de la lignée cardiaque sert à définir le processus de différenciation des cellules souches vers la lignée cardiaque7. Marqueurs de différenciation précoce, tels que NKX2.5, facteur de renforceur de myocyte 2C (Mef2c) et GATA48,9, peuvent être une indication de l’ouverture du processus cardiomyogénique. Marqueurs de cardiomyocyte mature couramment utilisées pour évaluer l’efficacité de différenciation sont signal protéine régulatrice α (SIRPA)10, troponine T (cTnT)11, la chaîne lourde de la myosine cardiaque (MYH6)8,12,13et connexine 43 (Cx43)14,15,16. Les méthodes utilisant des cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes (CSP) ont été soigneusement optimisés et discutés concernant les détails des facteurs inductifs, de l’oxygène et de nutriments dégradés et le moment exact de l’action5,6,7,17,18. Néanmoins, ESC et CFP-axée sur les technologies présentent toujours plusieurs préoccupations éthiques et de sécurité, ainsi que des caractéristiques électrophysiologiques et immunologiques sous-optimale19,20. Hôtes transplantés ces cellules souvent expérience immunorejection et nécessitent une immunosuppression permanente. C’est principalement en raison d’une non-concordance de majeur d’histocompatibilité (MHC) des molécules complexes dans l’hôte et les bailleurs de fonds et à la résultante lymphocytes réponse21. Tout en individuel MHC classe I correspondant est une solution possible, une pratique clinique plus accessible nécessiterait une source de cellules qui est universellement immunoprivileged à surmonter la crainte de rejet.

Comme une source de cellule de rechange pour l’usage dans des applications cliniques, MSCs et en particulier, BMSC, ont été étudiées pour une utilisation dans la régénération des tissus depuis leur description initiale en 1995,22. MSCs sont censés être résidents cellules régénératrices qui peuvent être trouvés dans presque n’importe quel tissu vascularisé23. Sur l’isolation de la source souhaitée, MSCs peuvent facilement être étendus dans la culture, ont paracrine vaste capacité et possèdent souvent immunoprivileged ou immunomodulateurs propriétés24,25. Leur innocuité et l’efficacité ont déjà été démontrés dans plusieurs études précliniques, en particulier pour la régénération cardiaque3,26.

Plusieurs stratégies de différenciation des MSC utilisent des agents pharmacologiques, tels que la 5-azacytidine22 et27de DMSO et croissance ou morphogéniques facteurs, tels que BMP5,7,28,29 ou l’angiotensine-II30, avec une efficacité variable. Ces stratégies, cependant, ne sont pas fondées sur les obstacles qu’une cellule régénératrice de naïve est susceptible de rencontrer après domiciliation ou remis à l’endroit de la blessure in vivo. Des stratégies plus physiologiquement pertinents, bien que plus difficiles à définir et manipuler, reposent sur la prémisse que la différenciation MSC peut être induite par le biais de signaux provenant du microenvironnement tissu lui-même. Des études antérieures ont montré que l’exposition à la cellule cardiaque lysats31 ou le myocarde ventriculaire32,33, ou directement auprès des cardiomyocytes primaire in vitro15,34, peut augmenter l’expression des marqueurs cardiaques dans MSCs. D’autres ont démontré cardiomyogénèse spontanée après le traitement de lésions cardiaques avec MSCs35,36,37,38, bien qu’en partie, la fusion du BMSC et cardiomyocytes39,40 généré le myocarde naissant. À notre connaissance, des cardiomyocytes fonctionnels, contractants spontanément de MSCs humaines (CSM) de n’importe quelle source de tissus n’ont pas encore été signalées.

Le consensus actuel est que MSCs tous les proviennent de cellules périvasculaires23. MSCs Young avec des propriétés de pericyte peuvent être isolés de la région périvasculaire du cordon ombilical humain tissu41,42,43. En comparaison avec BMSC, HUCPVCs possèdent la différenciation accrue potentielle et plusieurs autres avantages régénératrices, les deux in vitro41,44 et in vivo45,46,47. En particulier, la source étant l’interface materno-foetale, HUCPVCs ont significativement plus faible immunogénicité comparée aux sources adultes de MSCs. Nos recherches portent sur la caractérisation et applications précliniques de FTM HUCPVCs, la plus jeune source de MSCs, objet d’une enquête, dont nous avons déjà montré a augmenté de multilineage proliférative et plu les capacités de différenciation, y compris dans la lignée de cardiomyogénique41.

Nous présentons ici un protocole qui combine formation globale et couches de cellule cardiaque primaire chargeur inductifs forces pour atteindre la différenciation cardiomyogénique complète d’agrégats MSCs. fournir un environnement 3D, qui modélise mieux des conditions in vivo par rapport aux cultures adhérentes 2D. Utilisant des couches cardiaque chargeur fournit un environnement qui soit représentative du site transplantation ultime pour les MSCs. Nous démontrons que les plus jeunes sources de MSCs isolées de cordons ombilicaux de pré ou post natals ont une plus grande capacité à former des agrégats et rejoindre le phénotype cardiaque comparativement à BMSC adultes, tout en conservant leur privilège immunitaire. Outre l’élévation abrupte de gènes marqueurs cardiaques lignage et l’expression induite d’intracellulaire (c.-à-d. cTnT et MYH6) et les protéines de surface cellulaire (c.-à-d., SIRPA et Cx43) spécifique pour les cardiomyocytes, nous montrons que le potentiel de différenciation des FTM HUCPVCs peut être exploité grâce à cette méthode et qu’ils peuvent donner lieu au contractant spontanément cellules cardiomyocytes.

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Protocole

Toutes les études impliquant des animaux ont été menées et rapportées conformément aux directives ARRIVE48. Toutes les études ont été réalisées avec l’approbation du comité d’éthique de la recherche de l’établissement (numéro de CER 454-2011, Institut de recherche Sunnybrook ; REB 29889, Université de Toronto, Toronto, Canada). Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé (Toronto, Canada), et tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8e édition (National Institutes of Health 2011).

1. Culture tissulaire

  1. Culture FTM HUCPVCs, HUCPVCs à terme (préalablement établis, n ≥ 3 lignées indépendantes pour chacune)42 et BMSC disponibles dans le commerce en milieu essentiel alpha-minimum (MEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et un cocktail pénicilline/streptomycine (P/S) à 1 %. Des cardiomyocytes primaires de rat en culture et des co-cultures de CSM-cardiomyocytes dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12 (DMEM-F12) contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.
    REMARQUE : Stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 μm. Conserver les solutions de milieu préparées à 4 °C pendant 3 semaines maximum.
  2. Maintenir les cultures cellulaires dans des incubateurs humidifiés (95 % d’humidité relative, 37 °C et 5 % de CO2) et le passage à 70-80 % de confluence, déterminée par microscopie à contraste de phase. Utiliser des volumes de milieu appropriés pour la taille de la boîte de culture tissulaire utilisée (p. ex., 10 mL dans une boîte de 10 cm et 2 mL par puits dans une boîte de culture tissulaire à 6 puits). Utilisez ces conditions de culture pendant toute la durée du protocole.
  3. Dissocier les monocouches de CSM pour l’établissement d’une co-culture de CSM ou de cardiomyocytes à l’aide d’une solution d’enzyme de dissociation (2 ml/puits dans une plaque à 6 puits) et incuber à 37 °C pendant 4 min.
  4. Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifugez à 400 x g pendant 5 min.
  5. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’un milieu de culture approprié pour le comptage à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Amorcez les cellules comme décrit dans les sections de protocole suivantes.

2. Préparation de co-cultures primaires de cardiomyocytes-CSM de rat

  1. Obtenir du tissu cardiaque pour l’isolement des cardiomyocytes primaires.
    1. Euthanasier les petits rats (5-6 jours postnatals) en utilisant l’asphyxie au CO2. Réglez les chambres de CO2 sur un remplacement de gaz de 20 % (débit = 0,2 x volume de la chambre par minute). Confirmez l’exitus par l’absence du réflexe de pincement.
    2. Retirez les oreillettes avec les principaux vaisseaux sanguins qui les relient à l’aide d’instruments stérilisés (c.-à-d. pinces et ciseaux incurvés)41. Transférez les cœurs dans des tubes de 50 mL contenant du PBS stérile avec 1 % P/S (PBS-P/S) sur de la glace.
    3. Coupez les ventricules en deux et laissez le sang s’écouler dans un plat de 10 cm avec 10 ml de PBS-P/S sur de la glace. Coupez les parois ventriculaires en petits morceaux (diamètre = 2-3 mm) à l’aide de ciseaux courbés.
    4. Transférez les morceaux de cœur de 10 à 12 animaux dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique et laissez-les se déposer.
    5. Retirez autant de PBS-P/S que possible sans retirer de morceaux de cœur. Ajouter 10 ml de PBS-P/S neuf.
  2. Digérer le tissu cardiaque pour isoler les cardiomyocytes.
    1. Laissez les morceaux de cœur se déposer. Remplacer le PBS-P/S par 10 mL de trypsine à 0,15 % dans du PBS et agiter à 37 °C pendant 10 min.
    2. Jetez le surnageant. Répétez la digestion décrite à l’étape 2.2.1 trois fois de plus, mais décantez les surnageants dans des tubes de prélèvement de 50 ml contenant 10 ml de FBS à 100 %.
  3. Centrifuger les cellules (400 x g, 5 min) et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans le DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S et semer sur une plaque à 6 puits (1 x 105 cellules/cm2, 2 mL de milieu par puits).
  4. Après 1 h, transférez le milieu contenant les cellules non fixées dans un tube de 50 ml et jetez les cellules fixées. Comptez les cellules en suspension et replaquez-les en plaques neuves à 6 puits (1 x 10 5 cellules/cm2, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits).
  5. Inhiber la prolifération cellulaire avec la bromodéoxyuridine (BrdU).
    Attention : BrdU est un tératogène fort et suspecté d’être mutagènes. Veuillez vous assurer qu’une formation appropriée est fournie et reportez-vous à la fiche de données de sécurité avant utilisation.
    1. Une fois les cellules fixées, remplacez le milieu dans la plaque à 6 puits par du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS, 1 % de P/S (2 mL de milieu par puits) et 5 μM de BrdU. Incuber pendant 16 h (37 °C, 5 % CO2).
    2. Retirer le milieu contenant du BrdU et le remplacer par du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S (2 mL de milieu par puits).
  6. Préparez des CSM pré-teintées.
    1. Une fois que les cultures de CSM sont à 70-80 % de confluence dans des boîtes de 10 cm, retirer le milieu de culture et ajouter 3 ml de solution de dissociation cellulaire. Incuber le plat à 37 °C et 5 % CO2 pendant 5 min.
    2. Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifugez à 400 x g pendant 5 min.
    3. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S pour le comptage à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
    4. Diluer les cellules à une concentration de 1 x 106 MSC/mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.
    5. Incuber les CSM avec un colorant fluorescent viable et non transférable (5 μM, 30 min, 37 °C, 5 % CO2) dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL pendant 1 h.
    6. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans du DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S pour une concentration cellulaire de 1 x 106 MSC/mL. Répétez cette opération 3 fois au total.
  7. Transférez les CSM sur les cardiomyocytes (étape 2.5.2) à une concentration de 10 x 104 cellules par puits de la plaque à 6 puits.

3. Préparation des co-cultures d’agrégats

  1. Préparer une suspension unicellulaire de CSM (2 x 104 cellules/mL de milieu, passage # ≤ 6) dans de l’alpha-MEM complétée par 10 % de FBS et 1 % de P/S (voir étape 2.6).
    REMARQUE : Se référer à la section 1 du protocole pour le passage des cellules. Vous pouvez également pré-teindre les CSM conformément à l’étape 2.6.
  2. Amorcer la formation d’agrégats en plaçant des gouttes de 25 μL de suspension cellulaire (500 cellules) sur la surface interne des couvercles des boîtes de culture tissulaire de 10 cm (jusqu’à 50 gouttes par couvercle). Placez les couvercles sur leurs homologues inférieurs contenant du PBS-P/S. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2,
    REMARQUE : Placez 5 à 7 ml de PBS-P/S dans la boîte de culture sous les gouttes suspendues pour éviter l’évaporation des gouttes.
  3. Observez la formation d’agrégats dans les gouttes après 3 jours à l’aide d’un stéréomicroscope. Si plus de 40 gouttes sur 50 contiennent des agrégats formés, prélever les gouttes des couvercles à l’aide d’une micropipette de 1 mL et transférer les agrégats directement sur les monocouches primaires de cardiomyocytes de rat (préparées aux étapes 2.1 à 2.7 ; 10 gouttes/puits). Évitez le pipetage vigoureux pour préserver l’intégrité de l’agrégat.
  4. Conservez les co-cultures d’agrégats dans les incubateurs jusqu’à 2 semaines, en changeant le volume complet du milieu (2 ml de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits) toutes les 72 h.
    1. Observez quotidiennement les agrégats qui se fixent sur les couches des cellules nourricières à l’aide de la microscopie à fond clair. Enregistrez les agrégats de contraction lorsqu’ils sont observés.
  5. Préparer des agrégats pour l’analyse.
    1. Retirer le milieu et ajouter 2 mL de PBS par puits d’une boîte de culture tissulaire à 6 puits. Retirez le PBS et ajoutez 2 ml de solution de dissociation par puits. Incuber pendant 3 min à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille de cellule. Remettre en suspension dans le fluide, comme spécifié pour les applications décrites dans les étapes suivantes (voir étapes 4.1, 5.1 et 6.1) et passer à travers une crépine de 70 μm.

4. Cytométrie en flux (FC) et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

  1. Incuber des suspensions cellulaires (1 x 105 cellules dans 200 μL de PBS contenant 3 % de FBS) avec des anticorps primaires conjugués aux fluorophores (FITC ou APC) (c.-à-d. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G et SIRPA pour FC ou TRA-1-85 pour FACS ; 1:40) à 4 °C pendant 30 min, à l’abri de la lumière.
  2. Centrifuger (400 x g, 5 min) et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS avec 3 % de FBS pour les FC ou de PBS avec 0,5 % de FBS pour FACS.
    REMARQUE : La FC des CSM a été optimisée par Hong et al.41.
  3. Maintenez les cellules à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être analysées par FC (au moins 1 x 104 événements) ou FACS. Triez les cellules comme décrit41. Replaquez les cellules triées à haut niveau positif TRA-1-85 dans des plaques à 6 puits (1 x 104 cellules/puits, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S) dans un délai de 1 h
    REMARQUE : Pour la stratégie de contrôle de l’antigène de surface cellulaire humaine TRA-1-85, voir la figure supplémentaire.

5. Immunocytochimie (ICC) et microscopie

  1. Déposer de nouveau les suspensions cellulaires obtenues à partir des cocultures (étape 3.5.2) ou du FACS (section 4) sur des lames de chambre (1 x 104 cellules/puits, 2 mL de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S par puits). Laissez les cellules se fixer pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire (voir rubrique 1 pour les conditions).
  2. Fixez les cellules à l’aide de 3 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA ; PBS-BSA) pendant 5 min par lavage
    Attention : Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation du PFA.
  3. Perméabiliser les cellules dans 3 mL de PBS-BSA avec 0,1 % de Triton X-100. Incuber à température ambiante pendant 10 min pour les antigènes intracellulaires (c.-à-d. l’actinine alpha-sarcomérique [aSarc] et Cx43], ou 25 min pour les antigènes intranucléaires (c.-à-d. Mef2c et antigène nucléaire humain [HuNu]). Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.
  4. Bloquez les échantillons contre les réactions d’anticorps non spécifiques avec 3 ml de PBS contenant 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) et 1 % de BSA pendant 15 min à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.
  5. Incuber les cellules dans les anticorps primaires (c.-à-d. Mef2c, aSarc, Cx43 et HuNu) dilués à 1:200 dans 3 mL de PBS-BSA à 4 °C pendant la nuit.
  6. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 minutes par lavage et incuber avec des anticorps secondaires pendant 30 minutes à température ambiante. Laver 3 fois avec 3 mL de PBS-BSA pendant 5 min par lavage.
  7. Conservez les échantillons colorés dans 3 ml de support de montage.
  8. Acquérez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Utilisez un objectif 10X (NA = 0,3) et un objectif 20X (NA = 0,45) pour l’imagerie à faible grossissement. Utilisez des cubes de filtre de fluorescence et des longueurs d’onde pour la GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) et la RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) pour les anticorps secondaires utilisés (voir le tableau des matériaux et de l’équipement).
  9. Quantifiez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux et de l’équipement pour les logiciels recommandés). Normalisez les lectures d’intensité de fluorescence en fonction des acquisitions de contrôle secondaires.

6. Isolement de l’ARN et RT-PCR quantitative

  1. Préparez des échantillons d'ARN à partir de cultures de CSM indifférenciées ou de CSM triées à partir de co-cultures en utilisant l'isolement de l'ARN sur colonne, conformément aux instructions du fabricant. Préparez 1 x 104 à 1 x 106 cellules dans 0,7 mL de tampon de lyse cellulaire (fourni avec la trousse d’isolement de l’ARN) par échantillon.
  2. Préparez de l’ADNc à partir d’un maximum de 2 μg d’ARN par réaction RT de 100 μL.
  3. Effectuez une qPCR en utilisant 10 ng d’ADNc par réaction (40 cycles, température de recuit/extension de 60 °C).
    1. Utilisez des amorces pour MY6H et cTnT humaines à une concentration de 500 nM et de 1 à 100 ng d’ADNc par réaction (voir le tableau des matériaux et de l’équipement). Utilisez GAPDH, ACTB et HPRT comme normalisateurs internes. Utiliser des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et disponibles dans le commerce comme contrôle positif.
      REMARQUE : Exprimer le changement de pli d’expression par rapport aux échantillons d’ADNc indifférenciés dérivés de CSM.

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Résultats

Les HUCPVC présentent un potentiel de formation d'agrégats et des niveaux d'expression de CD49f plus élevés par rapport aux BMSC :

Pour induire la différenciation des CSMh (à savoir les CVPCH FTM, les CVPCH à terme et les CSMd), des suspensions monocellulaires de CSM non différenciés ou des gouttes suspendues contenant des CSM (Tableau 1) ont été transférées sur des monocouches de cardi...

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Discussion

La différenciation cardiaque de cellules souches a été en développement depuis plus de 2 décennies, avec plusieurs différentes stratégies utilisées pour générer des cellules cardiomyocytes provenant de sources MSC. Beaucoup de ces stratégies, cependant, sont inefficaces, et les conditions d’utilisation ne sont souvent pas représentatifs du milieu transplanté des cellules rencontre in vivo.

Contrairement aux méthodes existantes, le protocole présenté ici utilise une combinaison de couc...

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Déclarations de divulgation

Dr. Clifford L. Librach est cotitulaire du brevet : méthodes d’isolement et d’utilisation de cellules provenant de tissus de cordon ombilical premier trimestre, accordé au Canada et en Australie.

Remerciements

Les auteurs remercie les membres du personnel suivants et recherche du personnel pour leur contribution : Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg et Andrée Gauthier-Fisher. Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche The Ontario - Excellence de la recherche (ER-FRO, tour #7) et créer Program Inc.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsine/EDTAGibco25200056Pour la dissociation cellulaire
Alpha-MEMGibco12571071Pour les milieux de culture HUCPVC et BMSC.
Anticorps CD49f humain / souris conjuguéBiolegend313612Marqueur d’intégrine pour l’anticorps
humain Cx43/GJA1 conjugué FC APCR& D SystemsFAB7737Amarqueur Connexin 43 pour l’anticorps
HLA-A2 conjugué à FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Marqueur d’immunogénicité pour
l’anticorps anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugué à FC FITCAbcamab7904Marqueur d’immunogénicité pour
l’anticorps anti-humain SIRPA/CD172a de souris conjuguée à FC FITCAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FMarqueur cardiaque pour
l’anticorps humain TRA-1-85/CD147 conjugué à FC APCR& D SystemsFAB3195AMarqueur cellulaire humain pour l’anticorps
humain TRA-1-85/CD147 conjugué& D SystemsFAB3195FMarqueur cellulaire humain pour FC et FACS
Anticorps anti-connexine 43/GJA1Abcamab11370Cx43. Pour l’anticorps
secondaire à absorption croisée ICC IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Pour l’anticorps
anti-sarcomérique alpha-actinine [EA-53]ICC Abcamab9465aSARC. Pour l’anticorps
secondaire à absorption croisée ICC Ruma IgM à chaîne lourde IgM, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Pour l’anticorps ICC
Mef2C (D80C1) XP pour lapinNew England BioLabs Ltd.5030SPour ICC
Donkey Anticorps IgG (H+L) anti-lapin, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Pour
Anti-noyaux (HuNu) (clone 235-1) AnticorpsEMD Millipore MAB1281Pour ICC
MZ9.5 StéréomicroscopeLeicaPour l’imagerie des agrégats.
Microtubes centrifuges de 1,5 mlAxygenMCT-150-CPour la coloration des CSM avec un colorant fluorescent.
ImageJLogiciel de traitement d’images open source.
Aria II  ;Établissement du BDUHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.
Moelle osseuse, cellules stromales méséchymateusesLonzaPT-2501BMSC,
albumine sérique bovineSigma-Aldrich,A7030-100GBSA. Pour préparer des solutions pour ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Attention : BrdU est un tératogène fort et suspecté d’être mutagène. Veuillez vous assurer d’une formation appropriée et vous référer à la FDS avant utilisation.
Canto IIBDUHN Établissement SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.
ADNc EcoDry PremixClontech/Takara639570Pour la préparation de l’ADNc pour qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Imagerie fluorescente du cytoplasme cellulaire
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogen Inc.C10227Pour le comptage cellulaire
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Pour milieu de culture primaire de cardiomyocytes chez le rat.
Gibco salin tamponné au phosphate de Dulbecco10010023D-PBS, sans Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesMicroscope fluorescent interne
FACSCaliburBDinterne. Pour la cytométrie en flux.
Sérum fœtal bovin (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Composant du milieu de culture cellulaire.
Sondes QPCR IDT Prime TimeIntegrated Data TechnologiesFAM fluorophorehttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Milieu de montage aqueuxThermoScientificTA-030-FMPour le stockage des cellules à soumettre ICC
LSR II  ;Établissement du BDUHN SickKids FC. Pour la cytométrie en flux.
Établissement du MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC. Pour le tri des cellules.
Technologie de signalisation cellulairede sérum de chèvre normale5425SNGS. Utilisé dans la solution de blocage pour ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 puitsThermo Scientific Nunc155409Pour préparer des échantillons pour ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPEn tant que composant de la solution de perméabilisation lors de la préparation des cellules pour ICC
Paraformaldéhyde, solution à 16 %, EM GradeMicroscopie électronique Sciences15710Pour la fixation des cellules pour ICC.
Pénicilline/streptomycineGibco15140122Composant du milieu de culture cellulaire.
AmorcesSigmaCustom Standard DNA Oligos, dessalées, 0,2 &mu ; molCTnT_F : GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A ; CTnT_R : GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A ; MYH6 F : GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T ; MYH6 R : GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Cardiomyocytes dérivés de cellules hiPSReproCellRCD001NContrôle positif pour qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Pour isoler l’ARN pour qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Pour qPCR avec master mix
RPMI 1640GibcoA1049101Pour MSC, milieu de coculture de monocytes.
TaqMan qPCR amorcetests Thermo Fisher Scientific4444556Pour qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Coloration des cellules pour la viabilité et le comptage
TrypsineGibco 272500108Pour la dissociation cellulaire
VolocitéPerkin-ElmerVolocité 6.3Logiciel d’imagerie
0.2 &mu ; Filtre à poresThermo Fisher Scientific566-0020Pour la stérilisation des milieux de culture tissulaire
HERAcell 150i CO2 IncubateurThermo Fisher Scientific51026410Pour l’incubation
de cellules Solution saline tamponnée au phosphate DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium
ForcepsAlmedic7727- A10-704Pour la remise du cœur de rat. Peut utiliser n’importe quelle pince similaire.
CiseauxFine Science Tools14059-11Pour hacher le cœur du rat. Ciseaux incurvés recommandés.
Tube de 50 mLBD Falcon352070Pour le prélèvement de cardiomyocytes et les procédures générales de culture tissulaire
Tube de 15 mLBD Falcon352096Pour les procédures générales de culture tissulaire
Plaques à 6 puitsThermo Scientific NuncCA73520-906Pour la culture tissulaire
Boîtes de culture tissulaire de 10 cmCorning25382-428Pour la formation d’agrégats
Microscope Axiovert 40CZeissPour l’imagerie en fond clair tout au long de la culture tissulaire et du reste du protocole
Filtre à cellules mFisherbrand22363548Pour assurer une suspension unicellulaire avant la cytométrie en flux ou le tri
Triton X-100EMD Millipore9410-1LUtilisé dans une solution de perméabilisation pour ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Colorant utilisé lors de la visualisation de la localisation du Cx43
PE FC et FACS FITC R ICC , , 70 &mu ;

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