Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Summary

La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.

Abstract

L'analyse du protéome cellulaire peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies dues au développement de technologies qui permettent l'identification et la quantification à grande échelle des protéines présentes dans les systèmes biologiques complexes. Les connaissances acquises à partir d'une approche protéomique peuvent conduire à une Une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents aux maladies, permettant d'identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic et, espérons-le, des cibles thérapeutiques. Cependant, la valvule mitrale cardiaque représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique en raison de la faible cellularité dans le protéoglycane et la matrice extracellulaire enrichie en collagène. Cela rend difficile l'extraction de protéines pour une analyse protéomique globale. Ce travail décrit un protocole qui est compatible avec l'analyse subséquente des protéines, telles que la protéomique quantitative et l'immunoblot. Cela peut permettre la corrélation des données concernantG expression de protéines avec des données sur l'expression quantitative de l'ARNm et l'analyse immunohistochimique non quantitative. En effet, ces approches, lorsqu'elles sont réalisées ensemble, conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut être pertinente pour les chercheurs intéressés par l'étude de la physiopathologie valvulaire cardiaque.

Introduction

Des preuves récentes ont modifié la compréhension des rôles des nombreux mécanismes de régulation qui se produisent après la synthèse de l'ARNm. En effet, les processus translationnels, post-transcriptionnels et protéolytiques peuvent réguler l'abondance et la fonction des protéines. Le dogme - qui indique que les concentrations d'ARNm sont des proxies de celles des protéines correspondantes, en supposant que les niveaux de transcription sont le principal déterminant de l'abondance des protéines - ont été partiellement révisés. En effet, les niveaux de transcription ne prédisent partiellement que l'abondance des protéines, ce qui suggère que les é....

Protocol

Dans ce protocole, les cœurs humains sont recueillis lors d'une explication multiorganique (temps d'ischémie froide de 4-12 h, moyen 6 ± 2 h) provenant de donneurs multi-organes exclus de la transplantation d'organe pour des raisons techniques ou fonctionnelles, malgré des paramètres échocardiographiques normaux. Ils sont envoyés à la Banque de tissus cardiovasculaires de Milan, au Centre cardiologique Monzino (Milan, Italie) pour la banque des valves aortiques et pulmonaires. Les tracts postérieurs mitral ne sont pas utilisés à des fins cliniques, de sorte qu'ils sont recueillis lors de l'isolement valvulaire aortique et pulmonaire après obtentio....

Results

L'extraction et la dissolution des protéines dans le tampon d'urée sont directement compatibles avec les méthodes protéomiques basées sur l'isoélectro-focalisation (électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) ¹¹ et la focalisation isoélectrique en phase liquide (IEF) ¹² ) et avec immunoblot après dilution dans le tampon Laemmli ¹³ Contenant un cocktail inhibiteur de protéase ¹⁴ .

Discussion

Une étape cruciale de ce protocole est l'utilisation d'azote liquide pour congeler l'échantillon et refroidir le système de broyage. L'utilisation d'azote liquide empêche la dégradation biologique et permet une pulvérisation efficace, mais elle nécessite une formation spécifique pour une manipulation sûre.

Dans ce protocole, il existe un système de broyage pour le meulage des échantillons car les petits échantillons sont difficiles à récupérer à partir du mortier et des p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Milieu de transport équilibré de l’organe. Combinez 400 mL d’Eurocollins A avec 100 mL d’Eurocollins B pour obtenir un milieu équilibré Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Milieu de transport d’organe équilibré. Combiner 400 mL d’Eurocollins A avec 100 mL d’Eurocollins B pour obtenir un milieu équilibré Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Milieu de transport d’organe équilibré
Risque biologique Écoulement vertical	Burdinola		Classe A Classification GMP
Dewar Thermo	Scientific	Nalgene 4150-1000
Système de cryobroyeur	OPS diagnostics	CG 08-01	Système de broyage contenant mortiers, pilons et tournevis
Pince
Spatule
Scalpel stérile jetable	Medisafe	MS-10
Ciseaux en acier inoxydable	Autoclavable Pics
		acier inoxydable	Autoclavable
Champ stérile jetable	Mon& Tex	3.307.08
Solution de stérilisation à l’alcool			isopropylique 70 % Alcool isopropylique
Solution de stérilisation au peroxyde d’hydrogène			6 %
Micropipette, 1 mL, avec pointes
15 mL Tubes à centrifuger	VWR international	9278
1,7 mL Tubes à centrifuger	VWR international	PIER90410
Tampon			8 M d’urée, 2 M de thiourée, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM de dithiotreitol
Urea	Sigma aldrich	U6504-1KG	À utiliser pour le tampon d’urée
Thiourée	Sigma aldrich	T8656	À utiliser pour le tampon d’urée
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	À utiliser pour le tampon
d’uréeDithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	À utiliser pour le tampon d’urée
Seringue 50 mL	PIC		À utiliser pour filtrer le tampon d’urée
0.22 µ ; m filter	Millipore	SLGP033RB	À utiliser pour filtrer le tampon d’urée
PFTE Pilon, 2 mL	Kartell	6302	Partie de l’homogénéisateur Potter-Elvehjem Mortier
de verre borosilicaté	Kartell	6102	Partie de l’homogénéisateur Potter-Elvehjem
Agitateur	VELP scientifica	Agitateur DLH	À utiliser pour l’homogénéisation par Potter-Elvehjem
Bradford Dosage des protéines	Laboratoires Bio-Rad	5000006
Rotateur de tubes	Pbi International	F205
Azote
Feuille
Glace
Boîte en polystyrène Glace
carbonique
Centrifugeuse			Pour la centrifugation de tubes de centrifugation de 1,7 mL à 13 000 x g
Congélateur -80° ; C
Balance de
Autoclave			Pour la stérilisation
Gants cryogéniques pour azote
Gants
Ventilation forcée professionnelle et four			Pour la stérilisation Cocktail d’inhibiteurs
protéase	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solution
ProteoExtract Kit de précipitation des protéines	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	version 2.7	Plate-forme logicielle pour l’analyse de l’ontologie génétique
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	version 3.0.3	Plugin pour l’analyse de l’ontologie génétique
AlphaB Crystallin/CRYAB Anticorps	Novus Biologicals	NBP1-97494	Anticorps monoclonal de souris contre CryAB
Septin-11 Anticorps	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticorps polyclonal de lapin contre la septine-11
FHL1 Anticorps	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticorps polyclonal de lapin contre FHL-1
Anticorps dermatopontin	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticorps polyclonal de lapin contre la dermatopontine
Chèvre Anti souris IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticorps secondaire pour l’immunobuvard
Chèvre Anti lapin IgG HRP	Laboratoires Bio-Rad	170-5046	Anticorps secondaire pour l’immunobuvard