Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Summary

La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.

Abstract

L'analyse du protéome cellulaire peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies dues au développement de technologies qui permettent l'identification et la quantification à grande échelle des protéines présentes dans les systèmes biologiques complexes. Les connaissances acquises à partir d'une approche protéomique peuvent conduire à une Une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents aux maladies, permettant d'identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic et, espérons-le, des cibles thérapeutiques. Cependant, la valvule mitrale cardiaque représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique en raison de la faible cellularité dans le protéoglycane et la matrice extracellulaire enrichie en collagène. Cela rend difficile l'extraction de protéines pour une analyse protéomique globale. Ce travail décrit un protocole qui est compatible avec l'analyse subséquente des protéines, telles que la protéomique quantitative et l'immunoblot. Cela peut permettre la corrélation des données concernantG expression de protéines avec des données sur l'expression quantitative de l'ARNm et l'analyse immunohistochimique non quantitative. En effet, ces approches, lorsqu'elles sont réalisées ensemble, conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut être pertinente pour les chercheurs intéressés par l'étude de la physiopathologie valvulaire cardiaque.

Introduction

Des preuves récentes ont modifié la compréhension des rôles des nombreux mécanismes de régulation qui se produisent après la synthèse de l'ARNm. En effet, les processus translationnels, post-transcriptionnels et protéolytiques peuvent réguler l'abondance et la fonction des protéines. Le dogme - qui indique que les concentrations d'ARNm sont des proxies de celles des protéines correspondantes, en supposant que les niveaux de transcription sont le principal déterminant de l'abondance des protéines - ont été partiellement révisés. En effet, les niveaux de transcription ne prédisent partiellement que l'abondance des protéines, ce qui suggère que les événements post-transcriptionnels Se produisent pour réguler les protéines dans les cellules ^{1 , 2} .

En outre, les protéines déterminent finalement la fonction de la cellule et dictent donc son phénotype, qui peut subir des changements dynamiques en réponse aux facteurs autocrins, paracrins et endocriniens; Médiateurs transmis par le sang; température; traitement médical; Et la maladie se développeMent. Ainsi, une analyse d'expression axée sur le niveau de protéine est utile pour caractériser le protéome et pour démêler les changements critiques qui lui apparaissent dans le cadre de la pathogenèse de la maladie ³ .

Par conséquent, les opportunités que la protéomique présente pour clarifier la santé et les maladies sont formidables, malgré les défis technologiques existants. Les domaines de recherche particulièrement prometteurs auxquels la protéomique peut contribuer: l'identification de l'expression protéique altérée à n'importe quel niveau ( c.-à-d. Cellules entières ou tissus, compartiments subcellulaires et fluides biologiques); L'identification, la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic et le pronostic de la maladie; Et, espérons-le, l'identification de nouvelles cibles protéiques qui peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques, ainsi que pour l'évaluation de l'efficacité et de la toxicité du médicament ⁴ .

Capture de la complexité deLe protéome représente un défi technologique. Les outils protéomiques actuels offrent l'opportunité d'effectuer une analyse à grande échelle et à haut débit pour l'identification, la quantification et la validation des niveaux de protéines altérés. En outre, l'introduction de techniques de fractionnement et d'enrichissement, visant à éviter les interférences causées par les protéines les plus abondantes, a également amélioré l'identification des protéines en incluant les protéines les moins abondantes. Enfin, la protéomique a été complétée par l'analyse des modifications post-traductionnelles, qui apparaissent progressivement comme des modulateurs importants de la fonction protéique.

Cependant, la préparation des échantillons et la récupération des protéines dans les échantillons biologiques en cours d'analyse restent les étapes limitantes du flux de travail protéomique et augmentent le potentiel d'écueils possibles ⁵ . En effet, dans la plupart des techniques de biologie moléculaire qui doivent être optimisées, les premières étapes sont des tissus homogénéisésLa lyse ionique et cellulaire, en particulier lors de l'analyse de protéines à faible abondance pour lesquelles des méthodes d'amplification n'existent pas. En outre, la nature chimique des protéines peut influencer leur propre récupération. Par exemple, l'analyse des protéines hautement hydrophobes est très difficile car elles se précipitent facilement pendant la focalisation isoélectrique, tandis que les protéines trans-membranaires sont presque insolubles (revues dans la référence 5). En outre, la variabilité de la composition tissulaire crée un obstacle important au développement d'une méthode d'extraction universelle. Enfin, étant donné que la quasi-totalité des spécimens cliniques ont une quantité limitée, il est essentiel de permettre la préparation des protéines avec une récupération maximale et une reproductibilité à partir de quantités minimales d'échantillon ⁶ .

Ce travail décrit un protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la valvule mitrale cardiaque humaine normale, ce qui représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique. La valvule mitrale normale est une compStructure lex située entre l'oreillette gauche et le ventricule gauche du cœur ( figure 1 ). Il joue un rôle important dans le contrôle du flux sanguin de l'oreillette au ventricule, en évitant le reflux et en assurant le bon niveau d'apport en oxygène à l'ensemble du corps, en maintenant un débit cardiaque adéquat. Cependant, il est souvent considéré comme un tissu «inactif», avec une faible cellularité et peu de composants, principalement dans la matrice extracellulaire. C'est parce que, dans des conditions normales, les cellules interstitielles valvulaires résidentes (VIC) présentent un phénotype quiescent avec un taux de biosynthèse faible en protéines ⁷ .

Cependant, il a été démontré que, dans un état pathologique, le nombre de VIC dans le spongiosa augmente et que leur synthèse protéique est activée, ainsi que d'autres changements fonctionnels et phénotypiques ⁸ . Par conséquent, il n'est pas surprenant que les données minimales disponibles dansLa littérature se concentre sur l'analyse des valves mitrales pathologiques ^{9 , 10} , dans lesquelles le nombre accru de VIC activés pourrait expliquer le nombre relativement élevé de protéines identifiées.

En conclusion, le présent protocole peut servir à développer la compréhension des mécanismes pathogènes responsables des maladies de la valvule mitrale par l'étude des composants des protéines valvulaires mitrales. En effet, une meilleure compréhension des processus pathologiques sous-jacents pourrait aider à améliorer la gestion clinique des maladies des valvules, dont les indications actuelles d'intervention sont principalement fondées sur des considérations hémodynamiques.

Protocol

Dans ce protocole, les cœurs humains sont recueillis lors d'une explication multiorganique (temps d'ischémie froide de 4-12 h, moyen 6 ± 2 h) provenant de donneurs multi-organes exclus de la transplantation d'organe pour des raisons techniques ou fonctionnelles, malgré des paramètres échocardiographiques normaux. Ils sont envoyés à la Banque de tissus cardiovasculaires de Milan, au Centre cardiologique Monzino (Milan, Italie) pour la banque des valves aortiques et pulmonaires. Les tracts postérieurs mitral ne sont pas utilisés à des fins cliniques, de sorte qu'ils sont recueillis lors de l'isolement valvulaire aortique et pulmonaire après obtention du consentement éclairé des proches des donneurs. Le tissu pour la transplantation et la recherche ne sont recueillis qu'après le consentement des parents; Sur la fiche de consentement, ils autorisent (ou non) l'utilisation du tissu cardiaque pour la recherche uniquement si elle n'est pas adaptée à une utilisation clinique humaine ( c'est-à-dire des problèmes microbiologiques, fonctionnels et sérologiques), conformément aux directives du comité d'éthique deMonzino Cardiologic Center.

1. Préparation de la soupape mitrale

1. Récolter la valvule mitrale humaine dès que possible après l'explication de l'organe (temps d'ischémie froide de 4-12 h).
2. Dans une pièce propre, retirez le cœur du sac de transport contenant une solution froide (4 ° C) (solution saline ou milieu équilibré, Eurocollins ou Wisconsin). Mettez-le dans un seau et placez-le dans un coffret de sécurité biologique (flux d'air vertical à risque biologique, classe A, classification des bonnes pratiques de fabrication (BPF)) pour procéder à la préparation de la soupape.
3. Placez le cœur sur un drap stérile jetable dans le coffret. À l'aide d'un scalpel jetable stérile, couper complètement le cœur, perpendiculairement à son axe principal, au niveau des ventricules gauche et droit, à environ 4 cm de l'apex.
4. Déplacez l'aorte ascendante et l'artère pulmonaire pour afficher le toit de l'oreille gauche.
5. Avec des pince et des piquets stériles autoclavables, couper autour de l'oreillette gauche sur leToit auriculaire gauche, rendant la valvule mitrale visible et permettant d'identifier la grande feuillette mitrale (antérieure) et la petite notice mitrale (postérieure).
   NOTE: Les commissures antéro-latérales et postérieures du médium définissent la bordure de la notice antérieure et la zone postérieure.
6. En utilisant des ciseaux stériles autoclavables et des pinces non traumatiques, disséquer l'oreillette gauche et l'épaisseur de la paroi du ventricule autour de la circonférence de toute la valvule mitrale .
7. Identifiez la continuité de la valve mitro-aortique.
   NOTE: Le ventricule gauche contient toute la valvule mitrale et les cordes.
8. Séparez la valvule de la valvule mitrale antérieure de la valvule de la valvule mitrale postérieure, en coupant la notice postérieure le long de l'insertion avec le ventricule (commissure).
9. Laver la notice postérieure dans la solution saline. Couper la notice en petits morceaux (<1 cm ² ) et les enrouler individuellement dans du papier d'aluminium. Branchez-les à l'aide d'azote liquide.
   Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide.
   1. Sanitier la table de l'armoire avec une solution d'alcool isopropylique à 70% et une solution à 6% de peroxyde d'hydrogène à la fin de la procédure.

2. Extraction de protéines

1. Utilisez une pince pour retirer l'échantillon stocké dans de l'azote liquide et placez-le immédiatement sur de la glace carbonique tout en étant encore enroulé dans la feuille d'aluminium. Ne laissez pas l'échantillon décongeler pendant les transferts.
2. Avant le broyage, refroidissez le mortier de porcelaine / zirconium et les pilons d'un système de broyage ( par exemple, CryoGrinder), ainsi que l'échantillon, en les mettant dans un flacon Dewar contenant de l'azote liquide (~ 500 mL).
   Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide.
3. Mettez le mortier et les pilons dans une boîte en polystyrène contenant de la glace carbonique. Retirez l'échantillon du papier d'aluminium et placez-le dans le mortier.
4. Grind tIl échantillonne avec le gros pilon contre le mortier 15 à 20 fois, en utilisant le tournevis pour faire tourner le pilon. Mélanger l'échantillon avec la pointe d'une spatule pré-refroidie pendant le processus de broyage.
   1. Répétez avec le petit pilon.
5. Transférer l'échantillon de terre à un tube préalablement pesé ( p. Ex., Tube de centrifugation de 15 ml) en inversant le tube, en le plaçant sur le mortier et en les inverse pour déplacer l'échantillon vers le tube. Utilisez une spatule pré-refroidie pour récupérer tout le matériau du mortier.
   1. Gardez le tube avec l'échantillon sur de la glace sèche pour éviter la décongélation de l'échantillon pendant le transfert.
6. Calculer le poids net de l'échantillon.
7. Nettoyez le mortier et les pilons après chaque échantillon et décontaminez-les en autoclavant ou en les chauffant à 200 ° C pendant 2 h.
8. Transférer l'échantillon en poudre du tube centrifuge au tube de verre d'un homogénéisateur par inversion.
9. Ajouter un buffe d'urée filtréR (8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4% p / v CHAPS, 20 mM de Tris et 55 mM de dithiotréitol) au tube de verre, 200 μL de tampon d'urée pour chaque 10 mg de tissu en poudre.
   REMARQUE: L'échantillon de poudre résiduelle laissé dans le tube de centrifugation peut être récupéré en utilisant une partie du volume calculé de tampon d'urée.
10. Homogénéiser l'échantillon à l'aide d'un agitateur équipé d'un mortier de verre à base de borosilicate et d'un pilon de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Appuyez lentement sur le pilon sur l'échantillon avec un mouvement de torsion (1.500 tr / min) 10 fois.
11. Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube de centrifugation propre de 1,7 ml. Encore extraire l'échantillon restant avec du tampon d'urée frais, en ajoutant la moitié du volume utilisé lors de la première extraction.
12. Répétez l'étape 2.10.
13. Récupérer le surnageant et le combiner avec le surnageant à partir de l'étape 2.11. Placez le surnageant combiné sur un rotator de tube pendant 30 min.
14. Centrifuger le tube pendant 30 min à 13 000 xg et 4 ° C.
15. Récupérer le surnageant etD mesure la concentration de protéines en utilisant le dosage de protéines de Bradford, selon les instructions du fabricant. Conservez l'échantillon à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.

Results

L'extraction et la dissolution des protéines dans le tampon d'urée sont directement compatibles avec les méthodes protéomiques basées sur l'isoélectro-focalisation (électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) ¹¹ et la focalisation isoélectrique en phase liquide (IEF) ¹² ) et avec immunoblot après dilution dans le tampon Laemmli ¹³ Contenant un cocktail inhibiteur de protéase ¹⁴ .

Discussion

Une étape cruciale de ce protocole est l'utilisation d'azote liquide pour congeler l'échantillon et refroidir le système de broyage. L'utilisation d'azote liquide empêche la dégradation biologique et permet une pulvérisation efficace, mais elle nécessite une formation spécifique pour une manipulation sûre.

Dans ce protocole, il existe un système de broyage pour le meulage des échantillons car les petits échantillons sont difficiles à récupérer à partir du mortier et des p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Milieu de transport équilibré de l’organe. Combinez 400 mL d’Eurocollins A avec 100 mL d’Eurocollins B pour obtenir un milieu équilibré Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Milieu de transport d’organe équilibré. Combiner 400 mL d’Eurocollins A avec 100 mL d’Eurocollins B pour obtenir un milieu équilibré Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Milieu de transport d’organe équilibré
Risque biologique Écoulement vertical	Burdinola		Classe A Classification GMP
Dewar Thermo	Scientific	Nalgene 4150-1000
Système de cryobroyeur	OPS diagnostics	CG 08-01	Système de broyage contenant mortiers, pilons et tournevis
Pince
Spatule
Scalpel stérile jetable	Medisafe	MS-10
Ciseaux en acier inoxydable	Autoclavable Pics
		acier inoxydable	Autoclavable
Champ stérile jetable	Mon& Tex	3.307.08
Solution de stérilisation à l’alcool			isopropylique 70 % Alcool isopropylique
Solution de stérilisation au peroxyde d’hydrogène			6 %
Micropipette, 1 mL, avec pointes
15 mL Tubes à centrifuger	VWR international	9278
1,7 mL Tubes à centrifuger	VWR international	PIER90410
Tampon			8 M d’urée, 2 M de thiourée, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM de dithiotreitol
Urea	Sigma aldrich	U6504-1KG	À utiliser pour le tampon d’urée
Thiourée	Sigma aldrich	T8656	À utiliser pour le tampon d’urée
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	À utiliser pour le tampon
d’uréeDithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	À utiliser pour le tampon d’urée
Seringue 50 mL	PIC		À utiliser pour filtrer le tampon d’urée
0.22 µ ; m filter	Millipore	SLGP033RB	À utiliser pour filtrer le tampon d’urée
PFTE Pilon, 2 mL	Kartell	6302	Partie de l’homogénéisateur Potter-Elvehjem Mortier
de verre borosilicaté	Kartell	6102	Partie de l’homogénéisateur Potter-Elvehjem
Agitateur	VELP scientifica	Agitateur DLH	À utiliser pour l’homogénéisation par Potter-Elvehjem
Bradford Dosage des protéines	Laboratoires Bio-Rad	5000006
Rotateur de tubes	Pbi International	F205
Azote
Feuille
Glace
Boîte en polystyrène Glace
carbonique
Centrifugeuse			Pour la centrifugation de tubes de centrifugation de 1,7 mL à 13 000 x g
Congélateur -80° ; C
Balance de
Autoclave			Pour la stérilisation
Gants cryogéniques pour azote
Gants
Ventilation forcée professionnelle et four			Pour la stérilisation Cocktail d’inhibiteurs
protéase	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solution
ProteoExtract Kit de précipitation des protéines	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	version 2.7	Plate-forme logicielle pour l’analyse de l’ontologie génétique
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	version 3.0.3	Plugin pour l’analyse de l’ontologie génétique
AlphaB Crystallin/CRYAB Anticorps	Novus Biologicals	NBP1-97494	Anticorps monoclonal de souris contre CryAB
Septin-11 Anticorps	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticorps polyclonal de lapin contre la septine-11
FHL1 Anticorps	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticorps polyclonal de lapin contre FHL-1
Anticorps dermatopontin	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticorps polyclonal de lapin contre la dermatopontine
Chèvre Anti souris IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticorps secondaire pour l’immunobuvard
Chèvre Anti lapin IgG HRP	Laboratoires Bio-Rad	170-5046	Anticorps secondaire pour l’immunobuvard