Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

Summary

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Abstract

L'utilisation de souris génétiquement modifiées a contribué de manière significative aux études sur les processus physiologiques et pathologiques in vivo . L'injection pronucléaire des constructions d'expression d'ADN dans les ovocytes fécondés reste la technique la plus couramment utilisée pour générer des souris transgéniques pour une surexpression. Avec l'introduction de la technologie CRISPR pour le ciblage des gènes, l'injection pronucléaire dans les ovocytes fécondés a été étendue à la génération de souris knock-out et knockin. Ce travail décrit la préparation de l'ADN pour l'injection et la génération de guides CRISPR pour le ciblage des gènes, en mettant l'accent sur le contrôle de la qualité. Les procédures de génotypage nécessaires à l'identification des fondateurs potentiels sont essentielles. Des stratégies novatrices de génotypage qui profitent des capacités de "multiplexage" de CRISPR sont présentées ici. Les procédures chirurgicales sont également décrites. Ensemble, les étapes du protocole permettront la génération de genDes souris modifiées de manière sélective et pour l'établissement ultérieur de colonies de souris pour une pléthore de domaines de recherche, y compris l'immunologie, les neurosciences, le cancer, la physiologie, le développement et d'autres.

Introduction

Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l'examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d'Alzheimer ^{1 , 2} . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l'espoir d'un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l'utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C'est parce que l'environnement physiologique métabolique et complexe ne peu....

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins et de l'éthique des animaux de l'Université de New-Galles du Sud.

1. Préparation du transgène (intégration aléatoire)

1. Électrophorèse analytique en gel d'agarose.
   1. Décrivez le plasmide pour acciser le transgène en utilisant des enzymes appropriées (1 heure d'incubation) ou des enzymes à digestion rapide (15 à 30 minutes d'incubation) dans un thermocycleur en suivant les recommandations du fabricant (voir la figure 2A et sa légende).
   2. Mélanger un gel d'agarose à 1% tris-acétate-é....

Results

Ci-dessous, les flux de travail pour la micro-injection dans le cas de l'intégration aléatoire et le ciblage des gènes médiés par CRISPR sont décrits ( Figure 1 ).

Figure 1: Flux de travail typique pour la génération de souris génétiquement modifiées. Pour une intégration aléatoire, le transgène .......

Discussion

Etapes critiques dans le protocole

On sait que la génération de souris génétiquement modifiées présente un défi technique. Cependant, le protocole présenté ici est une méthode optimisée et simplifiée qui permet de maîtriser et de dépanner la technique en un temps record. Il faut deux étapes pour réussir la technique. Tout d'abord, la synthèse de modèles d'ADN linéaires (pour la synthèse des sgRNA) peut être obtenue sans chlorure de magnésium (MgCl ₂ ). Cependant, il est forte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette 0,1-2,5 &mu ; L	Eppendorf	4920000016
Micropipette 2 - 20 &mu ; L	Eppendorf	4920000040
Micropipette 20 - 200 &mu ; L	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100 - 1 000 &mu ; L	Eppendorf	4920000083
Marqueur de poids moléculaire	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Marqueur de poids moléculaire  ;	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
Tampon EDTA	Sigma-Aldrich	93296	10x - Diluer à 1x
Bromure d’éthidium	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Coloration de gel sûre	Invitrogen	S33102
Kit d’extraction de gel	Qiagen	28706
Kit de purification PCR (Qiaquick)	Qiagen	28106
Système de vide (Manifold)	Promega	A7231
Tampon de micro-injection sans nucléases  ;	Millipore	MR-095-10F
Filtre à microcentrifugeuse Ultrafree-MC  ;	Millipore	UFC30GV00
Cas9 ARNm	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
plasmide exprimant CRISPR (px330)	Addgene	42230
Eau sans nucléase	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polymérase	New England Biolabs	M0530L
T7 Kit d’ARN rapide à haut rendement	New England Biolabs	E2050S
Colonnes de spin de purification d’ARN (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Plasmide donneur	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa milieu de culture embryonnaire	Zenith Biotech  ;	ZEKS-100
Huile minérale	Zenith Biotech  ;	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalasine B	Sigma-Aldrich	C6762
Embout buccal	Sigma-Aldrich	A5177
Microcapillaires en verre	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 pince	Outils de science fine  ;	91150-20
Ciseaux à iris	Outils scientifiques fins  ;	91460-11
Pince pour récipient	Fine Science Tools  ;	18374-43
Pinces de plaie	Outils de science fine  ;	12040-01
Applicateur de clips	Outils de science fine  ;	12018-12
Micro-ciseaux  ;	Outils de science fine  ;	15000-03
Cautériseur	Outils de science fine  ;	18000-00
Sutures chirurgicales non résorbables (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5 % CO2 incubateur	MG Scientific	Galaxy 14S
Spectrophotomètre	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycleur	Eppendorf	6321 000.515
Installation d’électrophorèse BioRad		1640300
Transilluminateur UV	BioRad	1708110EDU
Thermocycleur	Eppendorf	6334000069
Microscope stéréoscopique	Olympus	SZX7
Microscope inversé	Olympus	IX71
2x Micromanipulateurs	Eppendorf	5188000.012
Ovocytes manipulateur	Eppendorf	5176000.025
Microinjecteur (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Souris C57BL/6J souche	Australian BioResources	C57BL/6JAusb  ;