Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines

Summary

Les jonctions inter-cellulaires sont indispensables pour les fonctions et le développement de la glande mammaire. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour l'étude des interactions protéines-protéines (IPP) et la co-localisation à l'aide de glandes mammaires murines. Ces techniques permettent d'étudier la dynamique de l'association physique entre les jonctions intercellulaires à différents stades de développement.

Abstract

Les interactions cellule-cellule jouent un rôle central dans la préservation de l'intégrité tissulaire et la barrière entre les différents compartiments de la glande mammaire. Ces interactions sont fournies par des protéines de jonction qui forment des liens entre des cellules adjacentes. La délocalisation des protéines jonctionnelles et la réduction des associations physiques avec leurs partenaires de liaison peuvent entraîner une perte de fonction et, par conséquent, une dysfonction organique. Ainsi, l'identification de la localisation des protéines et des interactions protéines-protéines (IPP) dans les tissus normaux et liés à la maladie est essentielle pour trouver de nouvelles preuves et des mécanismes conduisant à la progression des maladies ou des altérations du statut de développement. Ce manuscrit présente une méthode en deux étapes pour évaluer les IPP dans les glandes mammaires murines. Dans la section de protocole 1, on décrit un procédé pour effectuer une co-immunofluorescence (co-IF) en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt, suivi d'anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes. Bien que co-IF tousPour la démonstration de la proximité des protéines, il permet d'étudier leurs interactions physiques. Par conséquent, un protocole détaillé pour la co-immunoprécipitation (co-IP) est fourni dans la section de protocole 2. Cette méthode est utilisée pour déterminer les interactions physiques entre les protéines, sans confirmer si ces interactions sont directes ou indirectes. Au cours des dernières années, les techniques de co-IF et co-IP ont démontré que certaines composantes des jonctions intercellulaires co-localisent et interagissent ensemble, créant des liens de jonction dépendant de la scène qui varient au cours du développement de la glande mammaire.

Introduction

La croissance et le développement des glande mammaire surviennent principalement après la naissance. Cet organe se remodèle constamment tout au long de la vie reproductive d'un mammifère ¹ . L'épithélium de la glande mammaire adulte est constitué d'une couche interne de cellules épithéliales luminescentes et d'une couche externe de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, entourée d'une membrane basale ² . Pour une bonne évaluation de la structure et du développement des glandes mammaires, le lecteur peut se référer à Sternlicht ¹ . Les interacti....

Protocol

Tous les protocoles d'animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité universitaire de soins animaux (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identification de la co-localisation des protéines

1. Du tissu aux glissières microscopiques
   REMARQUE: Les tissus et les sections doivent être manipulés sur de la glace carbonique.
   1. Accepter les glandes mammaires d'un animal (pour une description complète de cette procédure, se référer à Plante et al. ) ¹⁴ .
   2. Incorporer le tissu excisé dans un milieu de congélation / montage sur de l....

Results

Pour déterminer si les composants GJ, AJ et TJ peuvent interagir ensemble dans la glande mammaire, les analyses de co-IF ont d'abord été effectuées. Cx26, une protéine GJ et une β-Catenine, une protéine AJ, ont été sondées avec des anticorps spécifiques et ont révélé des anticorps à base de souris fluorés-647 (vert, pseudocolor) et chèvre-568 (rouge) respectivement ( figure 1B et C ) . Les données ont montré qu'ils co-localisent à la membrane cellulaire .......

Discussion

Les interactions cellule-cellule par des jonctions sont nécessaires pour la bonne fonction et le développement de nombreux organes, comme la glande mammaire. Des études ont montré que les protéines de jonction peuvent réguler la fonction et la stabilité l'une de l'autre et activer la transduction du signal en s'attachant mutuellement à la membrane ^{10 de} la cellule. Les protocoles présentés dans le manuscrit actuel ont fourni des résultats intéressants sur l'expression, la localisa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	. Constant, Québec, Canada		C57BL/6 Femals ; jour de gestation 18 (P18) et jour de lactation 14 (L14), Charles River Canada  ;
PBS 10x (stock)			1) Dissoudre 80 g de NaCl (F.W. : 58,44), 2 g de KCl (F.W. 74,55), 26,8 g de Na2HPO4· ; 7H2O (F.W. 268.07) et 2,4 g KH2PO4 (F.W. : 136.09) dans 800 mL d’eau distillée ; 2) Ajustez le PH à 7,4 ; 3) Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final de 1 L.
TBS 10x (stock)			1) Dissoudre 60,5 g de TRIS, 87,6 g de NaCl dans 800 mL d’eau distillée ; 2) Ajuster le pH à 7,5 ; 3) Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final de 1 L.
Part 1 : Immunofluorescence
Milieu de congélation	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	Composé de sections congelées VMR  ;
Microtome	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Lames	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits  ; Scientifiques  ; ESBE  ; St-Laurent, QC, Canada	BLM1001C	Lames recouvertes d’or à profil haut
Stylo Pap	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Lames microscopiques	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand  ; Superfrost Plus Lames de microscope
Formaldéhyde	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, Californie, États-Unis
Solution bloquante			3 % BSA dans la
solution			TBS-Tween 20 0,1 %
Polysorbate 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Supports de montage	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
Anticorps premiers et secondaires	Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis	Voir les commentaires	E-Cadherin (4A2) Souris mAb (#14472s) 1/50 (Signalisation cellulaire) avec anti-souris IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Signalisation cellulaire  ;
Anticorps primaires et secondaires  ;	Technologies de la vie, Waltham, MA, États-Unis & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Voir les commentaires	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) avec IgG anti-lapin Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Signalisation cellulaire)  ;
Anticorps primaires et secondaires  ;	Santa Cruz Biotechnology, Inc., Californie, États-Unis ; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada.	Voir les commentaires	&beta ;-Anticorps anti-caténine (C-18) : sc-1496 (SANTA CRUZ) avec IgG anti-chèvre (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Sonde moléculaire (Fisher Scientific)
Anticorps primaires et secondaires  ;	Technologies de la vie, Waltham, MA, États-Unis & Cell Signaling, Beverly, MA, États-Unis	Voir les commentaires	Connexin26  ; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) avec anti-souris IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)  ;
Coloration des noyaux	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate) 1/1 000 po Microscope fluorescent PBS
	Nikon Canada, Mississauga, ON, Canada		Laser microscopique confocal Nikon A1R+ équipé d’un détecteur spectral  ;
Logiciel d’analyse d’images IF	Nikon Canada, Mississauga, ON, Canada		Logiciel NIS-elements (version 4)
Part 2 : Immunoprécipitation
Triple-detergent Tampon de lyse (100  ; mL) pH = 8,0			1) Mélanger 50 mM TRIS (P.F. : 121,14), 150  ; mM NaCl (F.W. : 58,44), 0,02 % d’azoture de sodium, 0,1 % de SDS, 1 % de NONIdET P40, 0,5 % de désoxycholate de sodium dans 80 mL de H2O. 2) Ajuster le pH à 8,0 avec HCl 6  ; N (~0,5  ; mL). 3) Réglez le volume à 100  ; mL. Conservez-le au réfrigérateur. Le jour de l’extraction des protéines, utilisez 1/100 de NaVo3, 1/100 d’inhibiteur de protéase/phosphatase et 1/25 de NAF dans la quantité calculée de tampon de lyse au détergent triple : solution de fluorure de sodium (mère) 1,25  ; M (P.F. : 41,98), Orthovanadate de sodium (stock) Solution 1 M (F.W. : 183.9)
Inhibiteur de protéase/phosphatase	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Stop, sans EDTA (100x)
Dosage des protéines	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, États-Unis	23225	Kit de dosage des protéines Pierce BCA  ;
Broyeur de tissus	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Modèle FTH-115
Perles magnétiques et support	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		Système de billes magnétiques PureProteome Protein G (LSKMAGG02)
Solution de lavage pour IP			PBS ou PBS-Tween20 0,1 % selon l’étape
Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation	Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis	Voir les commentaires	IgG Lapin (lapin (DA1E) mAb IgG Contrôle des isotypes (#3900s) (Signalisation cellulaire) 0.5 µ ; L/200 et micro ; L
Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation	Signalisation cellulaire, Beverly, MA, USA	Voir les commentaires	IgG Souris souris (G3A1) mAb IgG Contrôle des isotypes (#5415s) (Signalisation cellulaire) 0,5 & micro ; L/200 et micro ; L
Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada	Voir les commentaires	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  ; et micro ; L/200  ; et micro ; L
Anticorps primaires pour l’immunoprécipitation	Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis	Voir les commentaires	E-cadhérine (4A2) Souris mAb (#14472s) (Signalisation cellulaire) 1 µ ; L/200 et micro ; L
Laemmli buffer  ;	BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada	1610747	4x Laemmli Sample Buffer (Ajouter du &beta ;-mercaptoéthanol selon les recommandations du fabricant)
Glycine acide  ;	Fisher Scientific, Burlington, ON	PB381-5	0,2 M de glycine ; ajuster le pH = 2,5 avec HCl  ;
Tris  ;	Fisher Scientific, Burlington (Ontario)	BP152-1	1 M (pH = 8)  ;
SDS-PAGE gels d’acrylamide  ;	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1610180 -5	TGX Solutions d’acrylamide FastCast sans taches (7,8 %, 10 %, 12 %)
Tampon de fonctionnement 10x  ;	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	Tris 30.3  ; g/glycine 144,1  ; g /FDS 10  ; g dans 1 L d’eau distillée
Membranes	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	Membranes PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Méthode
transfert	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704155	Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk	Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada		Lait écrémé instantané sans gras en poudre, Carnation
Solution bloquante pour Lait			en poudre 5 % dans le TBS-Tween 20 0,1 %
Solutions de lavage pour les transferts			TBS-Tween 20 0,1 %
Anticorps primaires et secondaires contre les transferts (10 % mL)	Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario et Abcam, Toronto, ON, Canada	Voir les commentaires	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2 500 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10  ; mL)	Signalisation cellulaire, Beverly, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada	Voir les commentaires	E-cadhérine (24E10) mAb de lapin 1/1 000 (#3195s) (signalisation cellulaire) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10  ; mL)	Life technologies, Waltham, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada	Voir les commentaires	Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à la HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorps primaires et secondaires pour les transferts (10  ; mL)	Life technologies, Waltham, MA, États-Unis & Abcam, Toronto, ON, Canada	Voir les commentaires	Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1 000 avec Veriblot conjugué à HRP pour l’anticorps secondaire IP (ab131366) 1/5 000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Solution de luminol pour la détection de signaux sur les transferts	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1705061	Clarity Western ECL Blot
Substrate Imaging blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1708280	Imagerie ChemiDoc MP système
Analyse des transferts	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada		Logiciel ImageLab 5.2