Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

Résumé

Ce travail décrit un protocole de séquençage optimisé du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD) et une canalisation de calcul pour identifier des régions riches en CpG différentiellement méthylées chez les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (CLL).

Résumé

Le rôle des ARN non codants longs (lncRNAs) dans le cancer est à l'avant-garde en raison de l'intérêt croissant pour la compréhension de leurs fonctions mécanistes pendant le développement et la progression du cancer. Malgré cela, la régulation épigénétique globale des ARNnc et des séquences répétitives dans le cancer n'a pas été bien étudiée, en particulier dans la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Cette étude se concentre sur une approche unique: la capture à base d'immunoprécipitation de fragments d'ADN méthylés à double brin en utilisant des protéines de liaison au méthyl-liaison (MBD), suivi du séquençage de la prochaine génération (MBD-seq). Des échantillons de patients CLL appartenant à deux sous-groupes pronostiques (5 échantillons mutés IGVH + 5 échantillons non mutés IGVH) ont été utilisés dans cette étude. L'analyse a révélé 5 800 hyperméthylés et 12 570 gènes méthylés différentiellement spécifiques de CLL hypométhylés (cllDMGs) par rapport aux témoins sains normaux. Il est important de noter que ces résultats ont identifié plusieurs ARNc linéaires différenciés par CLL, différentiellement méthylés.Des éléments pétitionnels et des gènes codant pour des protéines ayant une valeur pronostique potentielle. Ce travail décrit un protocole détaillé pour un pipeline MBD-seq et bioinformatique développé pour l'analyse complète des profils globaux de méthylation dans des régions riches en CpG utilisant des échantillons de patients CLL. Enfin, un gène codant pour la protéine et un ARNmc ont été validés en utilisant le pyrosequencing, qui est une méthode hautement quantitative pour analyser les niveaux de méthylisation du CpG afin de corroborer davantage les résultats du protocole MBD-seq.

Introduction

L'utilisation de techniques de séquençage de la prochaine génération pour analyser les profils globaux de méthylation de l'ADN a été de plus en plus populaire au cours des dernières années. Des essais de méthylation à l'échelle du génome, y compris les méthodes à base de microarray et de microarray, ont été développés sur la base de ce qui suit: la conversion de bisulfite d'ADN génomique, les digestion enzymes de restriction sensibles à la méthylation et l'immunoprécipitation d'ADN méthylé en utilisant des anticorps spécifiques de méthyle CpG .

La méthylation d'ADN aberrante est l'une des caractéristiques d....

Protocole

L'approbation éthique pour la collecte des échantillons CLL est de 2007-05-21, avec le numéro d'enregistrement suivant: EPN Gbg dnr 239/07. Tous les patients CLL ont été diagnostiqués selon les critères récemment révisés ⁸ , et les échantillons ont été recueillis au moment du diagnostic. Les patients de l'étude ont été inclus dans différents départements d'hématologie dans la partie ouest de la Suède après avoir obtenu un consentement écrit. Seuls les échantillons de cellules mononucléaires de sang périphérique CLL (PBMC) avec un pourcentage tumoral de cellules leucémiques ≥ 70% ont été sélectionnés dans cette étude.

Résultats

MBD-seq a récemment été réalisé sur des patients atteints de CLL et des témoins adaptés, normaux et sains pour identifier les gènes différentiellement hyper-hypométhylés spécifiques de CLL ⁷ . Le pipeline expérimental et bioinformatique utilisé pour analyser les données générées à partir de CLL et des échantillons sains normaux sont présentés à la figure 1A et 1B . Ces analyses ont identifié plusieurs régions méthylée.......

Discussion

MBD-seq est une technique rentable, basée sur l'immunoprécipitation qui peut être utilisée pour étudier les modèles de méthylation avec une couverture complète du génome. Les deux MeDIP seq (immunoprécipitation de l'ADN méthylé suivi du séquençage) et MBD-seq entraînent l'enrichissement de l'ADN méthylé riche en CpG. Cependant, MBD-seq montre plus d'affinité envers la liaison à des régions riches en CpG par rapport à MeDIP seq ¹⁹ . À l'aide d'un kit d'enrichissemen.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dneasy Kit sang et tissus	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor appareil de sonication standard	Diagenode	UCD-200
Tubes bioruptor TPX 1.5 mL	Diagenode	C30010010-300
3 M Acétate de sodium	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2 % Gels d’agarose	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Kit d’enrichissement d’ADN méthylé	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Mélangeur Vortex	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Toute entreprise
70 % Ethanool	Toute entreprise
DNAse free water	Milli Q
Précipitant d’ADN (acétate de sodium 3M)	Diagenode	C03030002
Safe seal Tubes eppendorf 1,5 mL Eppendorf	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0,5 mL tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Plateforme Illumina Hiseq2000 Illumina
Water  ; Bain	Grant
Bloc de chaleur	Rotation
de tube	Labquake

1114544