Article de méthode

Protocoles pour l'assemblage standard d'ADN de C-Brick utilisant Cpf1

DOI :

10.3791/55775

⸱

15 juin 2017

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

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La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l'ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d'assemblage d'ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.

Résumé

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La protéine CPf1 associée au CRISPR clive l'ADN bicaténaire sous la direction de l'ARN CRISPR (CRRNA), générant des extrémités collantes. En raison de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour l'établissement d'une norme d'assemblage d'ADN appelée C-Brick, qui présente l'avantage de longs sites de reconnaissance et de cicatrices courtes. Sur un vecteur C-Brick standard, il existe quatre sites de reconnaissance Cpf1 - le préfixe (sites T1 et T2) et le suffixe (sites T3 et T4) - éléments d'ADN biologiques flanquant. Le clivage des sites T2 et T3 produit des extrémités collantes complémentaires, qui permettent l'assemblage de pièces d'ADN avec des sites T2 et T3. Pendant ce temps, une courte cicatrice "GGATCC" est générée entre les pièces après l'assemblage. Comme le plasmide nouvellement formé contient à nouveau les quatre sites de clivage Cpf1, la méthode permet l'assemblage itératif de pièces d'ADN, ce qui est similaire à celui des standards BioBrick et BglBrick. Une procédure décrivant l'utilisation de la norme C-Brick pour assembler des pièces d'ADNEst décrit ici. La norme C-Brick peut être largement utilisée par les scientifiques, les étudiants diplômés et les étudiants de premier cycle, et même les amateurs.

Introduction

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La standardisation des parties biologiques de l'ADN est importante pour le développement de la biologie synthétique 1 . Le développement d'une procédure d'assemblage d'ADN peut remplacer des conceptions expérimentales ponctuelles et éliminer plusieurs des résultats inattendus qui surviennent lors de l'assemblage de composants génétiques dans des systèmes plus vastes. La norme BioBrick (BBF RFC 10) était l'une des premières normes d'assemblage d'ADN proposées. Il utilise la séquence de préfixe (contenant des sites de coupe EcoRI et XbaI) et la séquence de suffixe (contenant les sites de coupe SpeI et Pst....

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Protocole

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1. Préparation de crRNA

  1. Préparation des modèles CRRNA
    1. Ré-suspendre les oligonucléotides individuels ( Tableau 1 ) dans de l'eau exempte de RNase à une concentration de 10 uM.
    2. Ajouter 22,5 μl d'oligonucléotide de brin supérieur (T7-F dans le tableau 1 ), 22,5 μl d'oligonucléotide de brin inférieur ( Tableau 1 ) et 5 μL de tampon de recuit 10x à un tube de PCR de 0,2 ml. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL.
      REMARQUE: Six différents oligonucleotides de brin sont présentés dans le tableau 1 , chacun desquels doivent être couplés ....

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Résultats

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Ce protocole a démontré l'assemblage de trois cassettes de chromoprotéines (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) et amilGFP (BBa_K592010)). Tout d'abord, les séquences codantes des trois gènes et terminateurs mentionnés ci-dessus ont été clones individuellement dans un vecteur standard C-Brick. Des parties d'ADN courtes, un promoteur et un terminateur, ont été introduits dans le vecteur C-Brick par amplification PCR en utilisant des amorces contenant les petites parties d'ADN sur .......

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Discussion

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Ce protocole décrit une procédure pour la norme d'assemblage d'ADN C-Brick. L'étape la plus importante dans ce protocole est la linéarisation du vecteur standard C-Brick; Le clivage incomplet du vecteur pourrait affecter gravement le taux de réussite. En outre, bien que Cpf1 couvre principalement les séquences d'ADN cible dans le schéma de clivage "18-23", un clivage inexact près des deux bases a également été détecté 4 , ce qui peut provoquer un petit nombre de mutation.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Nous remercions Shanghai Tolo Biotech pour son assistance technique lors du développement de la norme C-Brick. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de recherche prioritaire stratégique de l'Académie chinoise des sciences (Subvention n ° XDB19040200).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Oligonucléotide commercialSangon Biotech
10x Taq PCR BufferTransgen#J40928
Eau distillée ultra pureInvitrogen10977-015
5x Tampon de transcription d’ARNThermo ScientificK0441
T7 ARN polyméraseThermo Scientific#EP0111
Mélange NTPSangon#ND0056
RRI (inhibiteur de la RNase recombinante)Takara2313A
ARN propre & Concentrateur-5Zymo ResearchR1015
Spectromètre UV-VisThermo ScientificNano-Drop 2000C
2x Phanta Max BufferVazymePB505Tampon PCR
dNTPsTransgenAD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazymeP505-d1
Ezmax pour le clonage en une étapeTolobio24303-1kit de montage sans soudure
5x Tampon pour clonage en une étape EzmaxTolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglII  ;NEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x Buffer 3NEB#B7003S
10x CutSmart BufferNEBB7204S
10x T4 DNA ligase BufferTolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA ligaseTolobio32210
DpnINEB#R01762
SV Système de nettoyage gel et PCRPromegaA9282
Plasmide Mini Kit IOmegaD6943-02Kit de préparation de plasmide
phosphatase alcaline thermosensible  ;Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 tamponTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
thermocycleurApplied Biosystemsveriti 96 puits
C-Brick vecteur standardTolobio98101
E. coli [DH10B]Invitrogen18297010
Milieux Luria-Bertani (tryptone)OxoidLP0042
Milieux Luria-Bertani (extrait de levure)OxoidLP0021
Milieux Luria-Bertani (NaCl)Sangon BiotechB126BA0007

Références

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  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. ....

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Mots-clés

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

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