Intégration de l'extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l'urine humaine pour les applications cliniques

Les effets du stress oxydatif sur la présentation clinique ont été poussés au premier plan ces dernières années ¹ . L'un des biomarqueurs à explorer est la 3-nitrotyrosine (3-NT), un produit final stable formé lorsque des espèces réactives d'azote (RNS) interagissent avec la tyrosine, un précurseur de neurotransmetteur de catécholamine. Alors que 3-NT peut avoir une valeur clinique comme biomarqueur pour RNS in vivo, les changements substantiels des propriétés et des fonctions de la tyrosine peuvent affecter négativement les protéines correspondantes et les fonctions cellulaires ^{1 , 2} . Des recherches émergentes ont suggéré que le 3-NT peut jouer un rôle important dans les conditions inflammatoires ³ , les troubles neurodégénératifs ^{4 , 5} , les maladies cardiovasculaires ⁶ et le diabète ⁷ , ainsi que les conditions liées au stress oxydatif. Cependant, ces obseLes retombées sont basées sur les résultats de méthodologies dépourvues de sensibilité et / ou de sélectivité ^{8 , 9 , 10 , 11} . Les énormes plages de concentration de 3-NT pour les échantillons biologiques précédemment rapportés dans la littérature révèlent que des problèmes d'analyse sérieux sont associés à ces tests et que des améliorations techniques sont nécessaires pour quantifier avec précision les niveaux de 3-NT et vérifier son rôle dans la pathologie de ces conditions .

La quantification de 3-NT libre dans les matrices biologiques présente un défi spécial pour l'homme et l'instrument ^{8 , 9 , 10 , 11} . Tout d'abord, le niveau de traces du 3-NT endogène exige une détection ultra-sensible; Deuxièmement, l'existence de nombreux analogues structurellement similaires, en particulier la tyrosine, qui est présente dansVaste excès, nécessite un degré élevé de sélectivité; Troisièmement, la formation artefactuelle de 3-NT par nitration de tyrosine avec nitrate et nitrite omniprésent nécessite une attention particulière lors de la préparation de l'échantillon afin d'éviter une fausse surestimation de 3-NT.

Parmi une grande variété de méthodologies utilisées pour mesurer 3-NT, la MS / MS a été considérée comme la méthode de l'étalon-or en raison de sa sensibilité et de sa sélectivité supérieures ^{11 , 12 , 13 , 14} . La MS / MS couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC) offre la meilleure sensibilité, cependant, les étapes indispensables de dérivatisation de l'échantillon sont trop fastidieuses et nécessitent beaucoup de temps pour être efficaces pour l'utilité clinique ^{15 , 16} . LC-MS / MS n'exige pas une dérivation complexe de l'échantillon, ce qui en fait l'option la plus prometteuse. Néanmoins, il existe plusieurs obstacles à surmonter tels que le seLa sensibilité aux méthodes de LC-MS / MS rapportées dans la littérature doit être améliorée pour la mesure de 3-NT ^{7 , 17 , 18 à} faible abondance et le temps de retournement relativement long doit être raccourci pour les applications à haut débit ^{12 , 13 , 17 , 19} .

En outre, en considérant les applications cliniques, la matrice biologique utilisée joue un rôle important. Il devrait être facile et peu coûteux d'obtenir et non invasif si possible ^{20 , 21 , 22} . Le plasma, l'échantillon traditionnellement utilisé dans la littérature, n'est pas une matrice cliniquement souhaitable, donc une méthodologie utilisant une urine non invasive et rentable a été recherchée.

Plusieurs tentatives de développement relDes méthodologies LC-MS / MS spécifiques et spécifiques ont été faites en utilisant l'urine ^{9 , 10 , 11} . Cependant, ils sont tous dépourvus d'être sélectifs, fiables ou efficaces pour une utilisation clinique. L'efficacité de la SPE prédominante à l'aide d'une cartouche traditionnelle en phase inversée (type C18) en tant que nettoyage d'échantillon pour l'analyse 3-NT a été mise en doute et une SPE séquentielle d'échange de cations (SCX) et de phase inverse C18-OH a été proposée ^{6 , 7 , 19} . Une méthode de LC-MS / MS récemment développée a utilisé un processus de purification multi-étapes de C18 SPE manuelle, chromatographie liquide à haute pression préparative (HPLC) et SPE en ligne pour l'analyse de 3-NT ²³ . Bien que cette méthode soit assez sensible à des fins cliniques, avec un LLOQ de 0,041 nM, le processus de nettoyage était intensif et fastidieux et requiRouge 3 mL d'urine, ce qui limite sa faisabilité à un débit élevé. Un polymère à empreinte moléculaire a été utilisé comme sorbant de SPE pour améliorer l'efficacité du processus de nettoyage ¹⁴ , mais le LLOQ (0,7 μg / mL) résultant n'était pas assez faible pour les spécimens cliniques. Une autre méthode requiert une LC-MS / MS bidimensionnelle (2D) et une chromatographie par immunoaffinage pour le nettoyage de l'échantillon afin d'atteindre une limite de détection (LOD) de 0,022 nM ²⁴ . Bien que toutes ces méthodes aient fait des progrès dans l'évaluation de 3-NT, aucune n'a atteint la sensibilité, la fiabilité et l'efficacité nécessaires aux applications cliniques.

Afin d'étudier la pathologie du 3-NT libre et son rôle de biomarqueur du stress oxydatif dans les milieux cliniques, nous avons développé une méthodologie simple, efficace, précise et précise permettant des applications cliniques à haut débit ²⁵ . Une excitation de mode mixte miniaturisé excLa microplaque d'extraction à 96 puits (MCX) a été mise en place pour réaliser un nettoyage et un enrichissement simple et efficace de l'échantillon de 3-NT dans une seule extraction en contournant les inconvénients observés dans les méthodes existantes qui nécessitent une dérivation, une évaporation et une 2D-LC. La Chromatographie liquide avec 0,02% de HCOOH en tant qu'additif en phase mobile offrait une réponse de signal améliorée avec un temps de cycle rapide. La sélectivité a été améliorée par l'application d'une solution d'élution NH ₄ OAc légère pour l'élution sélective de 3-NT et l'utilisation de la transition MRM à la fois pour 3-NT et l'étalon interne (IS). L'effet de la matrice a été compensé en utilisant une quantité réduite d'un isotope préféré ¹³ marqué C-IS pour la quantification. Avec l'avènement de cette méthodologie, les chercheurs et les cliniciens pourront vérifier le rôle du 3-NT dans les conditions cliniques et explorer davantage l'impact du stress oxydatif.

Toutes les études impliquant des échantillons d'urine humaine ont été menées conformément à la procédure approuvée par Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Collecte d'échantillon d'urine et détermination de la créatinine (Cr)

1. Recueillir 5 mL du lendemain des échantillons d'urine après environ ca. 10 h jeûne pendant la nuit dans un tube de transport de 5 mL A contenant 250 μL de HCl 3 N comme conservateur et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Décongélation et vortex 5 mL d'urine de transport Un tube et une centrifugeuse dans une centrifugeuse ( par ex. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
3. Aliquoter 1 mL d'urine deux fois dans le tube de transport de 5 mL A.
4. Déterminer Cr par une méthode de la créatinine urinaire ²⁶ .

2. Préparation des échantillons standard, IS et de contrôle qualité (QC)

1. Préparer une solution mère de 3-NT à 100 ug / ml dans de l'eau avec 0,01% de phase mobile HCOOH A (MA) et stocker à -20 ° C.
2. FaireUne solution standard de travail 3-NT à une concentration de 100 ng / mL en diluant la solution stock de 3-NT de 100 μg / mL avec MA.
3. Générer des normes allant de 5 à 2500 pg / mL par dilution de la norme de travail de 100 ng / mL avec de l'urine vierge acidifiée à 0,15 M HCl sans 3-NT avec des échantillons vierges et doubles en blanc.
4. Préparer une solution stock de IS ¹³ C ₉ -3-NT à 100 μg / mL dans de l'eau avec MA et conserver à -20 ° C.
5. Faire une solution de travail IS à 500 pg / mL par dilution de la solution mère de 100 μg / mL ¹³ C ₉ -3-NT IS avec MA.
6. Établissez cinq niveaux d'échantillons de QC couvrant les niveaux LLOQ, faible, moyen et élevé ( c.-à - d. , 10, 25, 100, 500 et 1 250 pg / mL), par dilution du standard de travail 3-NT dans l'urine vierge acidifiée.

3. Procédure d'extraction en phase solide

1. Des échantillons d'urine de décongélation et de vortex, des normes et des échantillons de QC.
2. Ajouter des échantillons d'urine, des normes et QC sampLes (250 μL chacun) à 32 puits d'une plaque de collecte de 96 ml propre.
3. Présentez la solution de travail de 500 pg / mL IS (50 μL) à chaque puits, sauf un double échantillon vierge. Ajouter 0,01% de HCOOH (50 μL) au puits d'échantillon blanc double.
4. Ajouter l'eau LC-MS / MS avec 0,1% de HCOOH (250 μL).
5. Mélanger le mélange ci-dessus avec une pipette à 8 canaux trois fois.
6. Couvrez la plaque jusqu'à ce que la SPE soit chargée.
7. Placez une plaque d'extraction MCX à 96 puits et un réservoir de collecte sur un processeur à pression positive.
8. Conditionner la plaque d'extraction avec du MeOH en écoulement (200 μl) à travers le sorbant.
9. Equilibrer par l'écoulement d'eau avec 2% de HCOOH (200 μL) à travers le sorbant.
10. Chargez le volume total de chacun des échantillons pré-mélangés sur la plaque d'extraction pré-conditionnée avec une pipette à 8 canaux.
11. Réglez une pression positive faible ( p . Ex. , 3 psi) sur le processeur de pression positive pour permettre au mélange de coulerSortez lentement le sorbant, ajustez la pression si nécessaire.
12. Laver les puits en courant d'eau avec 2% de HCOOH (200 μL) à travers le sorbant.
13. Lavez les puits en faisant couler du méthanol (200 μl) à travers le sorbant.
14. Laver les puits en courant d'eau (200 μl) à travers le sorbant.
15. Séchez les puits complètement avec un réglage de pression positive élevé ( p . Ex. , 40 psi) sur le processeur à pression positive.
16. Remplacer le réservoir avec une plaque de collecte propre de 2 ml de 96 po.
17. Appliquer 25 mM NH ₄ OAc à pH 9 (50 μL) pour éluer l'analyte retenu et IS à partir de la plaque d'extraction.
18. Pipetter de l'eau LC-MS avec 5% de HCOOH (50 μL) pour neutraliser l'éluat.
19. Mélanger avec la pipette 8 canaux trois fois et soumettre à la station LC-MS / MS pour analyse.

4. Analyse LC-MS / MS

1. Mesurer avec précision 2 000 ml d'eau LC-MS avec un cylindre gradué et le transférer dans une bouteille de 2 L.
2. PIpette 200 μL de HCOOH pur dans la bouteille ci-dessus contenant de l'eau LC-MS.
3. Mélanger soigneusement et étiqueter comme phase mobile A (MA). Inclure les initiales, la date de préparation et la date d'expiration.
4. Prenez une bouteille de LC de 2 litres de méthanol et étiquetez la phase mobile B (MB) avec la date de début et la date d'expiration.
5. Réglez la température de l'auto-échantillonnage à 4 ° C.
6. Placez la plaque de collecte avec des échantillons préparés dans l'auto-échantillonneur.
7. Placez une colonne PFP (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) et une colonne de protection au four.
8. Réglez la température du four à 30 ° C.
9. Equilibrer 10 min en utilisant la méthode d'acquisition avec l'élution en gradient LC comme indiqué dans le tableau 1 .

Tableau 1: Conditions d'élution du gradient de chromatographie liquide

10. Créez une liste de lots incluantNormes, QC et échantillons d'urine.
11. Commencer le lot par injection des échantillons préparés (12 μL).

5. Identification de pointe, intégration et processus de données

1. Contrôlez l'acquisition et le traitement des données à l'aide du logiciel.
2. Identifiez et intégrez les sommets 3-NT et IS pour tous les échantillons.
3. Établissez une courbe standard de 10-2,500 pg / mL pour la quantification 3-NT par régression linéaire du rapport de surface de pic de 3-NT et IS par rapport à la concentration nominale de 3-NT avec un facteur de pondération de 1 / x.
4. Quantifier tous les échantillons en utilisant la courbe standard.
5. Déterminer si les échantillons de QC tombent dans la plage établie.
6. Convertissez les concentrations détectées d'échantillons d'urine en résultats finaux dans l'unité de nM ou nmol / mmol Cr.

La figure 1 illustre que le 3-NT est complètement séparé par chromatographie d'autres analogues de tyrosine structurellement similaires sous l'état LC optimisé, ce qui élimine les interférences co-éluant en raison de ces composés très excessifs et par conséquent améliore le degré de sélectivité du dosage. En outre, l'élution en gradient avec 0,02% de HCOOH comme additif dans le MA et le méthanol à un débit de 0,45 ml / min permet une élution rapide de 3-NT ( c'est -à- dire 3 minutes avec un temps de réponse de 7 minutes).

Figure 1: Séparation chromatographique LC de base de 3-NT d'autres analogues de tyrosine dans une solution standard. ( A ) p- Toyrosine; ( B ) m- Toyrosine; ( C ) o -Tyrosine; ( D ) Cl-Tyrosine; ( E ) 3-NT. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 2 montre qu'aucun signal 3-NT n'est observé dans l'échantillon blanc double, ce qui indique aucune formation de 3-NT artefactuel pendant l'ensemble du processus. La figure 3 illustre les chromatogrammes MRM représentatifs de 3-NT et IS pour un individu sain. Comme on le voit, aucun signal parasite n'est observé aux temps de rétention de 3-NT et d'IS. En outre, on a observé moins de ± 6% de différence dans le 3-NT entre les échantillons d'urine rassemblés sans addition de pointes et de pointes avec du nitrite (50 μM), du nitrate (50 μM) et de la tyrosine (50 mg / L) 25 , ce qui appuie davantage À la spécificité de l'analyse.

Figure 3: Chromatogrammes MRM de 3-NT et IS dans un échantillon d'urine représentatif de personnes en bonne santé. ( A ) quantificateur MRM 3-NT 227,0> 90,0; ( B ) EST MRM quantificateur 236.0> 189.0. Cliquez sur luiRe à voir une version plus grande de ce chiffre.

La courbe standard a été établie par extraction d'urine vierge acidifiée avec 3-NT dans la gamme de 10-2,500 pg / mL en traçant le rapport de surface de pic de 3-NT et IS par rapport à la concentration nominale de 3-NT avec un ajustement linéaire De 1 / x pondération. Une courbe standard représentative est démontrée à la figure 4 . Le LOD, défini comme la concentration la plus basse avec un rapport signal sur bruit supérieur à trois, a été déterminé comme étant de 2 pg / mL (0,0088 nM). On a déterminé que LLOQ était de 10 pg / mL (0,044 nM) par définition, la concentration la plus basse à mesurer à ± 20% de l'imprécision et de la précision avec un rapport signal sur bruit supérieur à dix.

Figure 4: Une courbe standard représentative 3-NT dans leGamme de 10-2,500 pg / mL. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.