Intégration de l'extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l'urine humaine pour les applications cliniques

Summary

Une méthode de spectrométrie de masse en tandem en masse (LC-MS / MS) sélective et sensible couplée à une extraction efficace en phase solide sur une microplaque à 96 puits d'échange de cations (MCX) à mode mixte a été développée pour la mesure de la 3-nitrotyrosine libre ( 3-NT) dans l'urine humaine à haut débit, ce qui convient aux applications cliniques.

Abstract

La 3-nitrotyrosine gratuite (3-NT) a été largement utilisée comme biomarqueur possible pour le stress oxydatif. Des niveaux accrus de 3-NT ont été rapportés dans une grande variété de pathologies. Cependant, les méthodes existantes ne présentent pas suffisamment de sensibilité et / ou de spécificité nécessaire pour mesurer le faible niveau endogène de 3-NT de manière fiable et sont trop lourdes pour les applications cliniques. Par conséquent, une amélioration analytique est nécessaire de manière urgente pour quantifier avec précision les niveaux de 3-NT et vérifier le rôle du 3-NT dans les pathologies. Ce protocole présente le développement d'une nouvelle détection par spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) en chromatographie en phase liquide associée à une extraction miniaturisée en phase solide (SPE) pour la mesure rapide et précise de 3-NT dans l'urine humaine en tant que biomarqueur non invasif Pour le stress oxydatif. SPE à l'aide d'une plaque à 96 puits a nettement simplifié le processus en combinant le nettoyage des échantillons et l'enrichissement de l'analyte sans dégradation fastidieuse et les étapes d'évaporation, Réduisant la consommation de solvants, l'élimination des déchets, le risque de contamination et le temps de traitement global. L'emploi d'acétate d'ammonium 25 mM (NH ₄ OAc) à pH 9 lorsque la solution d'élution SPE a considérablement amélioré la sélectivité. La réponse du signal de spectrométrie de masse a été améliorée grâce au réglage des transitions de surveillance de réaction multiple (MRM). L'utilisation de 0,01% de HCOOH comme additif sur une colonne de pentafluorophényle (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) a amélioré la réponse du signal d'autre 2,5 fois et a raccourci le temps de fonctionnement global à 7 min. Une limite de quantification inférieure (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM) a été obtenue, ce qui représente une amélioration significative de la sensibilité par rapport aux dosages rapportés. Cette méthode simplifiée, rapide, sélective et sensible permet de traiter deux plaques d'échantillons d'urine (n = 192) dans une période de 24 heures. Compte tenu de la performance analytique nettement améliorée et de l'échantillonnage d'urine non invasif et peu coûteux, l'analyse proposée est bénéfique pour les études précliniques et cliniquesétudes.

Introduction

Les effets du stress oxydatif sur la présentation clinique ont été poussés au premier plan ces dernières années ¹ . L'un des biomarqueurs à explorer est la 3-nitrotyrosine (3-NT), un produit final stable formé lorsque des espèces réactives d'azote (RNS) interagissent avec la tyrosine, un précurseur de neurotransmetteur de catécholamine. Alors que 3-NT peut avoir une valeur clinique comme biomarqueur pour RNS in vivo, les changements substantiels des propriétés et des fonctions de la tyrosine peuvent affecter négativement les protéines correspondantes et les fonctions cellulaires ^{1 ,}

Protocol

Toutes les études impliquant des échantillons d'urine humaine ont été menées conformément à la procédure approuvée par Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Collecte d'échantillon d'urine et détermination de la créatinine (Cr)

1. Recueillir 5 mL du lendemain des échantillons d'urine après environ ca. 10 h jeûne pendant la nuit dans un tube de transport de 5 mL A contenant 250 μL de HCl 3 N comme conservateur et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Décongélation et vortex 5 mL d'urine de transport Un tube et une centrifugeuse dans une centrifugeuse ( par ex. Sor....

Results

La figure 1 illustre que le 3-NT est complètement séparé par chromatographie d'autres analogues de tyrosine structurellement similaires sous l'état LC optimisé, ce qui élimine les interférences co-éluant en raison de ces composés très excessifs et par conséquent améliore le degré de sélectivité du dosage. En outre, l'élution en gradient avec 0,02% de HCOOH comme additif dans le MA et le méthanol à un débit de 0,45 ml / min permet une élution rapide de 3-NT (.......

Discussion

Des variations substantielles des concentrations précédemment rapportées dans la littérature pour le 3-NT endogène libre dans les échantillons d'urine humaine révèlent des problèmes méthodologiques associés aux dosages disponibles ^{8 , 9 , 10 , 11} . La détermination précise du faible niveau basal de 3-NT dans l'urine humaine reste une tâche difficile qui nécessite des précautions partic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Nitro-L-tyrosine	Sigma	N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9	Sigma	652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine	Golden West Biologicals	MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-puits µ ; Plaque d’élution	Waters	186001830BA
2 mL Plaque de collecte 96 puits	Phenomenex  ;   ;	AH0-7194
96 processeur positif	Eaux  ;
LC-MS Ultra CHROMASOLV méthanol  ;   ;	Sigma	14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV eau	Sigma	14263-2L
Acide formique pour spectrométrie de masse	Sigma	94318-50ML-F
Solution d’hydroxyde d’ammonium	Sigma	338818-1L
Colonnes propyliques Ultra PFP	Restek	9179362
5500 Triple quad	AB Sciex  ;	/	Contacter la manufacture pour plus de détails
UFLC-XR	Shimadzu  ;	/	Contacter le fabricant pour plus de détails
Integra 400 Plus  ;	Roche	/	Créatinine urinaire Jaffé ; Méthode Gen 2
Certifié LCMS 12 x 32 mm Flacon à col vissé	Waters	600000751CV
Certifié LCGC 12 x 32 mm Flacon à récupération totale à col vissé	Waters	186000384C
Tube de transport de 5 mL	Phenix	TT-3205
50 mL Tube à centrifuger	Crystalgen  ;	23-2263
15 mL Tube à centrifuger	Crystalgen  ;	23-2266
Pipette électronique eLine	Sartorius	730391
Centrifugeuse à microfuge  ;	Beckman Coulter	A46474
Balance OHAUS  ;   ;	Balances Kennedy, inc.	735
Mélangeur vortex  ;	Bernstead Thermolyne	M16715