Microcristallographie des cristaux de protéines et<em&gt; Dans Cellulo</em&gt; Diffraction

Résumé

Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.

Résumé

L'avènement de lignes de feu de microfocus de haute qualité dans de nombreuses installations synchrotron a permis l'analyse de routine de cristaux inférieurs à 10 μm dans leur plus grande dimension, ce qui représentait un défi. Nous présentons deux flux de travail alternatifs pour la détermination de la structure des microcristaux protéiques par cristallographie aux rayons X avec un accent particulier sur les cristaux cultivés in vivo . Les microcristaux sont soit extraits de cellules par sonication et purifiés par centrifugation différentielle, soit analysés en cellulo après triage cellulaire par cytométrie en flux de cellules contenant des cristaux. Facultativement, les cristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont trempés dans des solutions d'atomes lourds pour le phasage expérimental. Ces échantillons sont ensuite préparés pour des expériences de diffraction de manière similaire par application sur un support micromesh et refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Nous décrivons brièvement et comparons les expériences de diffraction en série de microcristaux isolés et de cristaux-Contenant des cellules à l'aide d'une ligne de rayonnement synchrotron microfocus pour produire des jeux de données appropriés pour la mise au point, la construction de modèles et le raffinement.

Ces flux de travail sont illustrés par des cristaux de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produits par l'infection de cellules d'insectes avec un baculovirus recombinant. Dans cette étude de cas, l'analyse cellulo est plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et donne une structure en ~ 8 jours de l'expression au raffinement.

Introduction

L'utilisation de la cristallographie aux rayons X pour la détermination des structures à haute résolution des macromolécules biologiques a connu une progression constante au cours des deux dernières décennies. L'adoption croissante de la cristallographie par rayons X par des chercheurs non experts illustre la démocratisation de cette approche dans de nombreux domaines des sciences de la vie ¹ .

Historiquement, les cristaux ayant des dimensions inférieures à ~ 10 μm ont été considérés comme difficiles, sinon inutilisables, pour la détermination de la structure. La disponibilité croissante de rayons microfocu....

Protocole

Note: La cristallisation in vivo a été signalée dans de nombreux organismes, y compris dans les bactéries, les levures, les plantes, les insectes et les mammifères (examinés dans la référence ²¹ ). La cristallisation de protéines recombinantes a également été réalisée en laboratoire en utilisant une transfection transitoire de cellules de mammifères et une infection par baculovirus de cellules d'insectes. Le protocole suivant a été développé en utilisant le gène de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clone dans un baculovirus recombinant sous le promoteur de la polyédrine de baculovirus, généré selon les instr....

Résultats

Un aperçu des deux méthodes alternatives pour la détermination de la structure à l'aide de microcristaux in vivo est présenté ( figure 1 ). Les polyèdres peuvent être facilement purifiés par sonication et centrifugation. En raison de leur densité, ils forment une couche au bas du tube sous une couche de débris qui peut être enlevée par pipettage ( Figure 3a et 3b ). L'échantillon est en.......

Discussion

Ce protocole fournit deux approches pour analyser les microcristaux dans le but de faciliter l'analyse de très petits cristaux qui auraient été négligés par le passé.

Mesures critiques pour la purification du microcristal
Le protocole présenté a été optimisé en utilisant la polyhédrine Bombyx mori CPV1 exprimée dans les cellules Sf9 en tant que système modèle. Cependant, les microcristaux in vivo présentent une grande variabilité dans la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sf9 cells	Life Technologies
SF900-SFM milieu pour insectes	Life Technologies
1 L flacon de culture cellulaire	Thermofisher Scientific
Incubateur à secousses pour la culture cellulaire d’insectes	Eppendorf
50 mL Tubes coniques	Falcon
Centrifugeuse avec godets pivotants pour 50 mL tubes	Eppendorf
Sonicator équipé d’une sonde de 19 mm	MSE Soniprep 150  ;
Lames de verre	Hampton Research
Hémacytomètre	Sigma-Aldrich
Iodure de propidium	Thermofisher Scientific
BD Trieur de cellules d’influx  ;	BD Biosciences
Hampton Les tamis à atomes lourds	Hampton Research
Microcentrifuge	Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 mesh offrent une plus grande surface. Des maillages indexés peuvent être achetés pour des études systématiques.
Mèche en papier	Mitigen		La taille de la mèche en papier peut être modifiée pour un écoulement optimal. Cela dépendra en grande partie de la nature des cristaux et du cryoprotecteur utilisés.
Éthylène glycol	Sigma-Aldrich
Trypan blue	Life Technologies
MX2 ligne de faisceau microfocale	Synchrotron		Une liste des lignes de faisceau microfocales disponibles se trouve dans Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash ; 1806, doi :10.1071/CH14455.

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