Article de méthode

Microcristallographie des cristaux de protéines et

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DOI :

10.3791/55793

⸱

21 juillet 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.

Résumé

L'avènement de lignes de feu de microfocus de haute qualité dans de nombreuses installations synchrotron a permis l'analyse de routine de cristaux inférieurs à 10 μm dans leur plus grande dimension, ce qui représentait un défi. Nous présentons deux flux de travail alternatifs pour la détermination de la structure des microcristaux protéiques par cristallographie aux rayons X avec un accent particulier sur les cristaux cultivés in vivo . Les microcristaux sont soit extraits de cellules par sonication et purifiés par centrifugation différentielle, soit analysés en cellulo après triage cellulaire par cytométrie en flux de cellules contenant des cristaux. Facultativement, les cristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont trempés dans des solutions d'atomes lourds pour le phasage expérimental. Ces échantillons sont ensuite préparés pour des expériences de diffraction de manière similaire par application sur un support micromesh et refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Nous décrivons brièvement et comparons les expériences de diffraction en série de microcristaux isolés et de cristaux-Contenant des cellules à l'aide d'une ligne de rayonnement synchrotron microfocus pour produire des jeux de données appropriés pour la mise au point, la construction de modèles et le raffinement.

Ces flux de travail sont illustrés par des cristaux de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produits par l'infection de cellules d'insectes avec un baculovirus recombinant. Dans cette étude de cas, l'analyse cellulo est plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et donne une structure en ~ 8 jours de l'expression au raffinement.

Introduction

L'utilisation de la cristallographie aux rayons X pour la détermination des structures à haute résolution des macromolécules biologiques a connu une progression constante au cours des deux dernières décennies. L'adoption croissante de la cristallographie par rayons X par des chercheurs non experts illustre la démocratisation de cette approche dans de nombreux domaines des sciences de la vie 1 .

Historiquement, les cristaux ayant des dimensions inférieures à ~ 10 μm ont été considérés comme difficiles, sinon inutilisables, pour la détermination de la structure. La disponibilité croissante de rayons microfocus dédiés sur les sources de rayonnement synchrotron à l'échelle mondiale et les progrès technologiques, tels que le développement d'outils pour manipuler les microcristaux, ont éliminé une grande partie de ces barrières qui empêchaient l'utilisation étendue de la microcristallographie aux rayons X. Les progrès de la microcrystallographie en série X 2 , 3 et la diffraction micro-électronique 4 haNous avons montré que l'utilisation de micro et nanocristaux pour la détermination de la structure n'est pas seulement possible mais aussi parfois préférable à l'utilisation de gros cristaux 5 , 6 , 7 .

Ces progrès ont d'abord été appliqués à l'étude des peptides 8 et des cristaux naturels produits par les virus des insectes 9 , 10 . Ils sont maintenant utilisés pour une gamme variée de macromolécules biologiques, y compris les systèmes les plus difficiles tels que les protéines membranaires et les grands complexes 11 . Pour faciliter l'analyse de ces microcristaux, ils ont été analysés dans le méso , en particulier les protéines membranaires 12 et dans les puces microfluidiques 13 .

La disponibilité de ces nouvelles méthodes de microcristallographie a soulevé la possibilité d'utiliser enCristallisation vivante comme nouvelle voie pour la biologie structurale 14 , 15 , 16 offrant une alternative à la cristallogénèse classique in vitro . Malheureusement, même lorsque des cristaux in vivo peuvent être produits, plusieurs obstacles demeurent tels que la dégradation ou la perte de ligands lors de la purification des cellules, la difficulté de manipulation et de visualisation des cristaux à la ligne du synchrotron et des expériences fastidieuses de diffraction des rayons X. Comme une alternative, les cristaux ont également été analysés directement dans la cellule sans aucune étape de purification 17 , 18 , 19 . Une analyse comparative suggère que, dans les approches cellulo , peut être plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et produire des données de résolution supérieure 20 .

Ce protocole est enOnt tendance à aider les chercheurs nouveaux à la microcristallisation des protéines. Il fournit des méthodologies axées sur la préparation et la manipulation des échantillons pour les expériences de diffraction des rayons X à une ligne de rayonnement synchrotron. Deux options sont proposées en utilisant des cristaux isolés pour la microcristallographie classique ou des cellules contenant des cristaux triés par cytométrie de flux pour l'analyse cellulo ( Figure 1 ).

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Protocole

Note: La cristallisation in vivo a été signalée dans de nombreux organismes, y compris dans les bactéries, les levures, les plantes, les insectes et les mammifères (examinés dans la référence 21 ). La cristallisation de protéines recombinantes a également été réalisée en laboratoire en utilisant une transfection transitoire de cellules de mammifères et une infection par baculovirus de cellules d'insectes. Le protocole suivant a été développé en utilisant le gène de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clone dans un baculovirus recombinant sous le promoteur de la polyédrine de baculovirus, généré selon les instructions de la référence 22 . Ainsi, bien que ce protocole puisse être adapté à d'autres types de cellules ( p. Ex. Cellules de mammifères), nous décrivons ici les procédures pour les cellules d'insectes. Le protocole suppose que la surexpression de la protéine d'intérêt a déjà été réalisée. Les méthodes pour la production d'un baculovirus recombinant et son utilisation pour l'expression de la protéine d'intérêt sont avSelon les références 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Identification des cellules contenant du cristal

  1. Si les cellules sont cultivées en monocouche, inspectez-les directement dans le flacon. Si les cellules sont cultivées dans une culture liquide, utilisez le protocole suivant.
    1. À l'aide d'une pipette sérologique stérile, transférez 500 μL de cellules dans un tube à microcentrifugeuse. Veillez à ce que la stérilité de la culture principale soit maintenue; Manipuler les cellules dans un coffre de sécurité de classe II et suivre des techniques aseptiques standard.
    2. Pipeter 5 μL de cellules du tube de microcentrifugeuse sur une glissière en verre.
    3. Placez soigneusement une lamelle de verre sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air. Si la glissière ne peut pas être visualisée dans les 15 min, scellez la lamelle avec une graisse sous vide pour éviter l'évaporationAtion.
  2. Imagez le flacon ou glissez avec un microscope inversé. Si disponible, utilisez un contraste de phase et / ou une microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC). Les deux techniques améliorent le contraste dans les échantillons transparents et mettent l'accent sur les lignes et les arêtes, facilitant ainsi l'identification des cristaux in vivo .
  3. Examinez attentivement les cellules. Commencez par un grossissement de 200X et agrandissez-vous à un grossissement maximal lors de la détection d'un cristal potentiel. La présence de cristaux peut être suggérée indirectement par des changements dans la morphologie cellulaire ( Figure 2 ). Recherchez des bords tranchants et des changements de réfractivité (si vous utilisez un contraste de phase ou DIC). Les cristaux in vivo connus adoptent différentes formes, y compris des tiges, des piles d'aiguilles, des cubes, des pyramides et des polyèdres (voir la figure 2 et le tableau 1 pour quelques exemples).
    Note: La proportion de cellules contenant des cristaux sera différente dans chaque cas et peut être visibleN varie entre les préparations, mais en général on ne devrait pas s'attendre à trouver des cristaux dans toutes les cellules. De même, le nombre de cristaux par cellule est également variable (voir le tableau 1 ), et plus d'un cristal peut être trouvé dans une seule cellule. Ces facteurs doivent être optimisés dans la mesure du possible en ajustant la multiplicité des infections, en modifiant la durée d'expression et en variant la construction de protéines. D'une part, les conditions d'expression des protéines et la croissance cellulaire qui maximisent le nombre de cellules contenant des cristaux améliorent la productivité ( par exemple, une multiplicité d'infection élevée et une récolte tardive de la culture cellulaire). D'autre part, les conditions dans lesquelles les cellules contiennent un cristal unique facilitent la collecte de données ( par exemple, une faible multiplicité d'infection). Compte tenu de l'enrichissement apporté par le tri de flux décrit à l'étape 2.2, nous recommandons de viser des cristaux plus grands ( par exemple, un cristal unique par cellule), même si la proportion de cellules contenant des cristaux est faible.
  4. Si le cristalS sont identifiés, enregistrent leur position (lors de l'imagerie monocouche dans un flacon), et estiment le pourcentage de cellules contenant des cristaux. Si disponible, utilisez un microscope équipé d'une caméra capable de suivre les changements à un seul niveau de cellule.
  5. Pour les cellules en suspension, déterminer le degré de viabilité cellulaire suivant le protocole détaillé dans la référence 28 . Pour les cellules cultivées dans une monocouche, estimer par inspection visuelle le degré approximatif de confluence et la quantité de cellules détachées.
  6. Surveiller la croissance des cristaux, la croissance cellulaire et la viabilité deux fois par jour.
  7. Récolte les cellules dès que la croissance des cristaux semble s'arrêter. Pour des cristaux remarquablement robustes comme les polyèdres virales, les temps d'incubation prolongés (> 4 jours) augmentent le nombre de cristaux importants. Cependant, pour les cristaux de protéines typiques, nous recommandons de récolter des cellules lorsque la viabilité descend en dessous de 80% pour prévenir les dommages causés par la lyse cellulaire.
  8. Retirez le flacon de l'incubateur et passez àÉtape 2.2 dès que possible. Gardez les cellules sur glace pendant les étapes suivantes, sauf indication contraire.

2. Purification de l'échantillon

Note: Nous décrivons deux méthodes d'analyse des cristaux in vivo à partir de cristaux purifiés et en cellulo , respectivement.

  1. Purification des cristaux
    Note: Sauf s'il existe des preuves que les cristaux d'intérêt sont sensibles aux basses températures, travaillent sur de la glace et utilisent des tampons glacés pour éviter la dégradation des cristaux.
    1. Pipeter 50 mL de cellules Sf9 infectées dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Cela représente ~ 4 x 10 8 cellules dans une expérience typique.
    2. Cellules de pastilles à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 40 ml de solution salée tamponnée au phosphate refroidi (PBS), pH 7,4.
      Note: PBS est proposé comme point de départ pour la purification en tant que tampon isotonique standard dans le but de mimerIcking l'environnement cellulaire où les cristaux in vivo ont augmenté. Il a été utilisé pour la plupart des cristaux in vivo cultivés en culture cellulaire jusqu'à la date 9 , 14 , 29 . En variante, les milieux DMEM ont également été utilisés avec succès dans la purification de cristaux in vivo à partir de cellules de mammifères 19 . Si les cristaux souffrent visiblement de leur transfert dans le PBS ou présentent une mauvaise diffraction, ce paramètre devrait être étudié comme une source potentielle de dégradation.
    4. Sonicate la pastille remis en suspension pendant 30 s à 10 mA en utilisant un sonicateur équipé d'une sonde de 19 mm. Pour éviter de chauffer l'échantillon, placez-le dans un bécher rempli de glace lors de la sonication. La perturbation chimique ou mécanique des cellules peut être utilisée comme alternative si les cristaux semblent être endommagés par sonication comme évalué à l'étape 2.1.7.
    5. Centrifuger à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Après centrifugation, 2 couches sont apparentes:Une couche supérieure de débris cellulaires, qui est brun pâle, et une pastille inférieure de cristaux de polyédrine, blanc et crayeux.
    6. Jeter le surnageant et enlever la couche supérieure par un pipetage prudent. Respêtez le culot inférieur dans 40 mL de PBS refroidi.
    7. Évaluer la qualité des échantillons par imagerie à l'aide d'un microscope optique.
      1. Pipeter 5 μL de cellules ou des cristaux purifiés sur une glissière de verre. Cela peut être fait à température ambiante.
      2. Placez soigneusement une lamelle de verre sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air.
      3. Image la diapositive avec un microscope inversé à un grossissement de 200X. Image de l'échantillon dans les 15 minutes de sa préparation sur la diapositive. Si la glissière ne peut pas être visualisée dans les 15 min, scellez la lamelle avec de la graisse sous vide pour éviter l'évaporation.
        NOTE: Dans le cas des polyèdres, les cristaux apparaîtront comme des cubes réfléchissants de ~ 1 à 10 μm par côté. Vérifier l'intégrité des cristaux à la recherche de signes de perte de netteté( P. Ex. Bords arrondis), fissures ou dissolution. Surveillez également la présence de débris cellulaires qui apparaîtront comme des touffes et des objets de taille et de forme irrégulières.
    8. Répétez les étapes 2.1.5 à 2.1.7, réduisant de moitié le volume de PBS utilisé pour remettre en suspension la pastille à chaque cycle jusqu'à ce que les cristaux semblent exempts de débris. Remettre en suspension la pastille finale dans 1 ml de PBS refroidi et transférer les cristaux dans un tube de microcentrifugeuse. Conserver les cristaux purifiés à 4 ° C.
    9. Évaluer la concentration de cristaux en utilisant un hémocytomètre tel que décrit par le fabricant. Comptez les cristaux comme si vous comptiez des cellules.

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Figure 3 : Microcristaux In Vivo Purifiés. Purification représentative des cristaux de la polyédrine BmCPV1 à partir de cellules d'insectes Sf9 montrant ( a ) des débris de cellules granulés et pleurentStals after sonication, et ( b ) gros plan sur les débris et les couches de cristal. La couche de débris peut être soigneusement remis en suspension dans le surnageant et éliminée pour une purification plus rapide des cristaux. ( C ) Image de microscopie optique de polyèdres purifiés. Barre d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Isolation des cellules contenant des cristaux par cytométrie en flux
    Remarque: Pour faciliter la définition des portes dans la cytométrie en flux, il est recommandé de cultiver une culture témoin parallèlement à celle qui exprime la protéine d'intérêt. Cela peut se faire en infectant un flacon de cellules Sf9 avec un baculovirus recombinant non pertinent, ou en préparant des cellules mal infectées. Le tri et l'imagerie des échantillons sont généralement effectués à température ambiante.
    ATTENTION: L'iodure de propidium est un cancérogène suspecté et devrait être manipuléavec soin.
    1. Pipeter 4 mL de cellules Sf9 infectées - représentant ~ 3 x 10 7 cellules - dans un tube adapté à l'analyse de cytométrie en flux. Préparez également un deuxième tube avec un nombre équivalent de cellules Sf9 infectées par un baculovirus non recombinant.
    2. Ajouter l'iodure de propidium (PI) aux deux échantillons à une concentration finale de 1 μg / mL juste avant l'évaluation de la cytométrie en flux. Cette étape est nécessaire pour identifier les cellules mortes, les agglomérats et les débris qui peuvent altérer ou masquer la distribution cellulaire sur la parcelle de diffusion avant et latérale. Préparer des cellules PI de 1 mg / ml dans l'eau et conserver à 4 ° C protégé de la lumière.
    3. Appliquer les cellules sur un cytomètre de flux standard capable de tri des cellules en fonction de l'avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC). Analyser au moins 20 000 événements de l'échantillon témoin ( c'est -à- dire non contenant de cristaux). Après avoir éliminé les cellules mortes, les agglomérats et les débris de l'analyse, génère le diagramme FSC vers SSC.
    4. Analyser au moins 20 000Ts de l'échantillon contenant des cristaux. Comparez le tracé FSC à SSC avec le mock. Recherchez l'apparence d'une population distincte correspondant à des cellules contenant des cristaux. Généralement, les cellules avec des cristaux intracellulaires auront un SSC plus élevé en raison d'une augmentation de la complexité morphologique. Le FSC peut également augmenter si la croissance des cristaux entraîne une augmentation du volume de la cellule. Définissez les portes du trieur d'écoulement pour isoler les populations de cellules correspondant aux zones du diagramme de dispersion qui diffèrent de la parcelle simulée. Image des échantillons triés par microscopie optique comme décrit à l'étape 1 pour confirmer quelle population est associée à des cellules contenant des cristaux.
    5. En utilisant les portes définies à l'étape 2.2.4, trier les cellules contenant des cristaux dans PBS ou dans n'importe quel autre tampon isotonique. Enregistrez le nombre de cellules contenant des cristaux triées ainsi que le volume final pour faciliter les étapes ultérieures. Conservez les cellules triées sur glace ou à 4 ° C.
      Remarque: dans une heure,> 300 000 polyèdres-conLes cellules de détection sont triées sur un trieur de cellule avec une buse de 100 mm (138 kPa avec une fréquence de 39 kHz). Cette quantité de cellules suffit à préparer> 1 000 maillages.
    6. En suivant le protocole décrit à l'étape 2.1.7, imagez les cellules avec un microscope optique pour confirmer l'enrichissement en cellules contenant des cristaux. La préparation des échantillons pour la collecte des données devrait se faire le plus tôt possible après le tri des cellules car les cristaux peuvent se dégrader avec le temps ou être libérés en raison de la lyse cellulaire.

figure-protocol-2
Figure 4 : Tri des cellules. Des diagrammes de diffusion de cytométrie de flux représentatifs de ( a ) des cellules non infectées (fausses), qui ne contiennent pas de cristaux, et ( b ) des cellules Sf9 infectées par un baculovirus recombinant surexprimant la polyédrine BmCPV1. Les différences dans le diagramme de diffusion entre les deux populations alGated de la population cellulaire contenant des cristaux (porte rouge, valeurs SSC élevées). Chaque parcelle représente 20 000 événements de tri. SSC: diffusion de lumière latérale; FSC: diffusion directe de la lumière. ( C ) Image microscopique optique d'une population représentative des cellules triées, montrant la présence de cristaux intracellulaires. Échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Préparation d'échantillons pour la collecte de données

Remarque: Si les cellules ou les cristaux doivent être dérivés pour le protocole de suivi progressif expérimental décrit dans la section 3.1. Sinon, passez directement aux sections 3.2 pour les cristaux purifiés ou 3.3 pour l'analyse cellulo .

  1. Dérivation des microcristaux purifiés ou en cellulo
    ATTENTION: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation.La plupart des produits chimiques utilisés pour la mise en phase expérimentale sont extrêmement toxiques. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées, y compris l'utilisation d'une hotte chimique et d'un équipement de protection individuelle. Éliminer les déchets conformément à la politique de votre établissement.
    Note: La nature des atomes lourds, leur concentration et leur temps d'incubation sont donnés à titre indicatif pour les cristaux de la polyédrine BmCPV1. Ces paramètres doivent être déterminés expérimentalement pour chaque nouvelle cible. La coloration ultérieure avec le bleu de trypan à l'étape 3.3.2 peut être omise si les cellules sont facilement colorées par le composé chimique utilisé pour le phasage.
    1. Préparez des solutions saturées des atomes lourds souhaités (ou des solutions d'autres produits chimiques utilisés pour le phasage expérimental). Typiquement, des volumes inférieurs à 100 μL seront nécessaires pour chaque atome lourd. Retirer les sels et les débris non dissous par centrifugation à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à température ambiante.
    2. Préparer des parties aliquotes de ~ 50 000 cristauxOu des cellules triées par composé atomique lourd. Si le PBS n'est pas compatible avec le produit chimique utilisé pour la dérivatisation ( c.-à-d. Les formes précipitées et la solution devient trouble), granuler les cristaux à 4 000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse ou les cellules à 150 xg pendant 3 min, enlever le Surnageant et resuspendre doucement les cristaux ou les cellules dans 20 μL d'un tampon approprié. Répéter la granulation et la resuspension pour s'assurer qu'aucune trace de PBS ne reste. Ajustez le volume final à 20 μL pour toutes les aliquotes.
    3. Ajouter 20 μL de solution d'atome lourd ou autre composé chimique de choix aux cristaux ou aux cellules. La concentration optimale de l'atome lourd dépendra d'une combinaison de paramètres cellulaires (perméabilité, protéines hors cible ...) et la nature du cristal de la protéine d'intérêt. Comme point de départ, testez 3 concentrations différentes: saturation complète, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Conservez les échantillons à 4 ° C pendant 3 jours maximum. Cristaux du polyhL'édrin sont très résistants et denses et nécessitent de longs trempettes pour incorporer les atomes lourds; Pour d'autres types de cristaux, la période d'incubation et la concentration d'atomes lourds devraient être déterminées expérimentalement. Des temps d'incubation trop courts ne permettront pas l'incorporation de quantités appropriées de l'atome lourd, alors que les temps d'incubation prolongés peuvent affecter l'intégrité des cristaux, abaissant ainsi leur qualité de diffraction ou même les dissolvant. Comme point de départ, essayez 3 temps d'incubation différents pour chaque solution d'atome lourd ( p. Ex. 1 min, 1 heure et nuit). La dérivatisation réussie est évaluée par l'analyse des données de diffraction comme décrit brièvement dans la section 5 et les références qui y sont mentionnées.
    5. Laver l'excès de solution d'atome lourd en granulant les cristaux à 4000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, ou les cellules à 150 xg pendant 3 minutes, en éliminant le surnageant et en remontant doucement les cristaux ou les cellules dans 10 μL de tampon .
  2. Préparation du support micromesh avec des microcristaux purifiés
    ATTENTION: L'utilisation d'azote liquide est associée à des dangers tels que l'asphyxie, les brûlures à froid, le feu dans une atmosphère enrichie en oxygène et une explosion. Veuillez consulter la gestion des risques et les pratiques de travail sécuritaires de votre établissement.
    1. Sur la base de la concentration en cristaux calculée à l'étape 2.1.9, ajuster la concentration à 10 7 cristaux / ml en diluant l'échantillon; Ou en granulant les cristaux à 4 000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, en ajustant le volume final en enlevant le surnageant et en remettant en suspension doucement les cristaux.
    2. Si les échantillons sont censés être congelés à l'avance, refroidir l'expéditeur sec ou dewar avec de l'azote liquide. Préparer les flacons ou les rondelles, le cas échéant, et les refroidir avec de l'azote liquide.
    3. Remettre en suspension la pastille de cristal et appliquer une gouttelette de 0,5 μL de cristaux sur un micromesh par pipettage. Utilisez des mailles de 700 μm avec un carré de 25 μmLes trous comme point de départ. La zone de la maille n'est pas critique, mais une surface plus grande fournit plus de cristaux par maille et conduit à une évaporation plus lente pendant la préparation. La taille des trous doit être optimisée pour correspondre à la taille des cristaux de plus de 25 μm. Si nécessaire pour des études systématiques, des mailles indexées sont disponibles pour faciliter une analyse méthodique de grille lors de la collecte de données.
    4. Enlevez la plupart des excès de liquide en dégageant une mèche de papier. Les cristaux doivent être répartis uniformément sur le maillage, sans se toucher les uns les autres. Répétez l'étape 3.1.1. Pour optimiser la concentration de l'échantillon. Procédez rapidement et ne retirez pas trop du liquide. En l'absence de cryoprotecteur, le liquide s'évapore rapidement avec le risque de formation de cristaux de sel et / ou de perte du film.
    5. Ajouter un cryoprotecteur: pipeter 0,5 μL d'une solution d'éthylène glycol à 50% dans de l'eau sur la maille (la composition du cryobuffer doit être adaptée à l'échantillon, suggestions d'optimisation de cLe ryoprotectant se trouve dans la référence 30 ). Retirer l'excès de liquide en le débruant avec une mèche de papier. Contrairement à l'étape précédente, ici, le film restant de solvant devrait être aussi mince que possible pour réduire les effets de parallaxe qui compliquent le processus d'alignement entre le cristal, le chemin du faisceau et le goniomètre; Et pour minimiser l'arrière-plan causé par la diffusion des rayons X par le liquide dans le chemin du faisceau.
    6. Rafraîchissez immédiatement le micromesh dans de l'azote liquide et transférez-le dans un flacon ou une rondelle de robot, puis vers un expéditeur sec ou dewar pour le stockage.
  3. Préparation de micromesh avec des cellules contenant des cristaux
    ATTENTION: L'utilisation d'azote liquide est associée à des dangers tels que l'asphyxie, les brûlures à froid, le feu dans une atmosphère enrichie en oxygène et une explosion. Veuillez consulter la gestion des risques et les pratiques de travail sécuritaires de votre établissement.
    1. Transférer les cellules triées dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Basé sur la cellule cOunts enregistrés par le trieur de cellules, ajustez la concentration à 10 7 cellules / mL en diluant l'échantillon avec du PBS; Ou en granulant les cellules à 150 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, en ajustant le volume final en enlevant le surnageant et en remontant doucement les cellules.
    2. Mélanger les cellules avec un volume égal de solution de trypan bleu (0,4% p / v) jusqu'à une concentration finale de 0,2% p / v.
    3. Si les échantillons sont censés être congelés à l'avance, refroidir l'expéditeur sec ou dégainer avec de l'azote liquide. Préparer les flacons ou les rondelles, selon le cas, et les refroidir avec de l'azote liquide.
    4. Ressusciter doucement les cellules et pipeter 0,5 μL de cellules triées sur un micromesh.
    5. Retirer l'excès de liquide en le débruant avec une mèche de papier. Les cellules doivent être réparties uniformément sur le maillage, sans se toucher les unes les autres. Si vous n'utilisez pas de cryoprotecteur (étape 3.3.6), le film restant de solvant devrait être aussi mince que possible pour réduire les effets de parallaxe qui compliquentE le processus d'alignement entre le cristal, le chemin du faisceau et le goniomètre; Et pour minimiser l'arrière-plan causé par la diffusion des rayons X par le liquide dans le chemin du faisceau.
    6. En option, ajouter un cryoprotecteur aux cellules: pipeter 0,5 μL de 50% d'éthylène glycol, 50% de solution de PBS sur le maillage. La composition du cryobuffer doit être adaptée à l'échantillon; Des suggestions pour l'optimisation du cryoprotecteur se trouvent dans la référence 30 . Enlevez l'excès de liquide en dégageant une mèche de papier, en laissant seulement un mince film de solvant.
      Remarque: L'omission de l'étape de cryoprotection n'a pas modifié la qualité de la diffraction des rayons X lorsque des cristaux de polyhédrine ont été analysés dans le cellulo , alors que cette étape était nécessaire pour les cristaux purifiés 20 . Cela s'applique uniquement à l'incubation des cellules avec une solution cryoprotectrice; L'échantillon devrait encore être analysé à 100K pour minimiser les effets des dégâts d'irradiation sur les cristaux.
    7. ImmédiatementRefroidissez instantanément le micromesh dans de l'azote liquide et transférez-le à un flacon ou à une rondelle de robot, puis à un expéditeur sec ou à un stockage de dewar, selon le cas.

4. Collecte de données

Remarque: Les paramètres utilisés pour la collecte de données sont donnés à titre indicatif et devraient être optimisés pour chaque type de cristal et ligne de synchrotron.

  1. Recueillir des données sur une ligne de cristallographie en microfocus (voir la référence 7 pour une liste des lignes de feu de microfocus et leurs caractéristiques). Si disponible, utilisez un faisceau collimaté qui correspond à la taille des cristaux.
  2. Pour la mise en phase expérimentale par la méthode de dispersion anormale à une seule longueur d'onde (SAD), rassemblez-vous à une énergie qui maximise le signal anormal du gros atome de choix. Pour la mise en phase à l'aide de la méthode de remplacement isomorphe multiple (MIR), rassemblez-vous au-dessus de l'énergie d'un bord d'absorption approprié pour l'atome lourd de choix (disponible à http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. Après avoir chargé le maillage sur le goniomètre, commencez par centrer le micromesh avec le chemin du faisceau en utilisant les orientations face (côté convexe) et les orientations latérales. Ensuite, avec le micromesh face-on, affinez l'alignement en alignant le centre d'une voie horizontale particulière du micromesh (par exemple, commencez par le central). Ensuite, collectez les données le long de cette voie horizontale avec des réajustements mineurs à l'alignement. Si disponible, utilisez le centrage basé sur le rastering à la diffraction des rayons X à faible dose pour affiner l'alignement (consultez le contact local à la ligne du synchrotron).
    Note: Comme une quantité limitée de données peut être collectée sur les microcristaux en raison de dégâts d'irradiation (généralement, 10 à 30 images avec une oscillation de 1 °), en théorie, le cristal doit seulement être aligné avec le chemin du faisceau pendant 10 à 30 °. Cependant, il est essentiel que l'alignement soit précis car le cristal peut facilement être manqué par le microbeam (généralement collimaté à un diamètreEr de ~ 10 μm ou moins).
  4. Collectez les données de diffraction jusqu'à ce que la diffraction soit perdue en raison de dommages causés par le rayonnement. Pour les cristaux de la polyédrine, le temps d'exposition de 10 secondes est généralement utilisé pour une oscillation de 1 ° pour un flux d'environ 3,6 x 10 11 photons / s à 13 keV avec un détecteur CCD (dose totale <30 MGy). Optimisez ces paramètres en fonction de la ligne de faisceau et de la nature du cristal utilisé. En particulier, des doses faibles et des tranches fines sont recommandées pour les détecteurs de rayons X en pixels.
    Remarque: Si vous utilisez la stratégie cellulo , les cellules colorées avec du bleu trypan apparaîtront comme des points bleus contre le fond de support, ce qui les rend plus faciles à aligner sur le faisceau. Si le microbeam collimaté a approximativement la même taille que les cellules (~ 10 μm), tous les cristaux contenus dans une cellule seront éclairés simultanément. Pour les cellules contenant de multiples microcristaux, cela conduit à l'observation de multiples diagrammes de diffraction, qui peuvent être difficiles à traiter. Cependant, diLa ffraction d'un des cristaux tend souvent à dominer le diagramme de diffraction et est préférentiellement indexée pendant le traitement de données. Pour les lignes de faisceau avec un faisceau de rayons X significativement plus petit que la cellule, le raster à très faible flux de rayons X (> 95% d'atténuation) devrait être utilisé pour centrer sur un seul cristal avant la collecte des données.
  5. Passez au prochain cristal dans la voie.
  6. Une fois que tous les cristaux de la voie ont été testés, passez à la voie suivante et répétez la procédure d'alignement. Continuez jusqu'à ce que des données suffisantes aient été collectées ou que tous les cristaux aient été testés.
    1. Assurez-vous que les voies qui ont été traitées sont clairement identifiées de sorte que les cristaux ne sont pas manqués ou tirés deux fois (si nécessaire, dessinez un croquis). Typiquement, le bleu de trypan devient jaune après que la cellule a été irradiée, ce qui peut être utilisé comme marqueur.

figure-protocol-3
Figure 5 : Stratégie de collecte de données à partir d'échantillons sur le support de Micromesh. (A) la stratégie de collecte de données par piste; L'alignement se fait au début de chaque voie (points) et les données sont collectées le long de la voie. ( B ) Gros plan d'une cellule contenant des cristaux contenant du bleu de trypan sur un maillage, comme on le voit sur l'écran de la feuille de microcristallographie. ( C ) Gros plan d'un polyèdre purifié sur une maille, comme on le voit sur l'écran de la feuille de microcristallographie. Les carrés de maille sont de 25 μm x 25 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Traitement des données

REMARQUE: ici, nous ne mentionnons que brièvement les étapes du traitement des données spécifiques à la microcristallographie en série, où les données provenant de multiples cristaux sont fusionnées. Beaucoup d'articles excellents sontDisponible décrivant le traitement des données en profondeur 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 et la détermination de la structure dépasse la portée de ce protocole.

  1. Sélectionnez le cristal avec la meilleure résolution de diffraction et la qualité en tant que référence.
  2. Procurez-vous individuellement chaque cristal en utilisant des paquets de cristallographie standard tels que HKL-2000 31 , Mosflm 32 ou XDS 33 . Pour s'assurer que les dégâts causés par les rayonnements ne détériorent pas la qualité de l'ensemble de données, sélectionnez soigneusement la dernière image avec des dégâts d'irradiation acceptables. Les critères de coupure indiquant des dégâts d'irradiation excessifs sont spécifiques à chaque type de cristal, à la pratique de traitement et au but de l'expérience. Pour la mise en phase des cristaux de polyédrine BmCPV1, les données ont été rejetées une fois que le signal-à-nOise / <σ (I)> par image est tombé en dessous de 2 ou le symbole R a dépassé 50% comme indiqué par HKL-2000 31 .
  3. Pour chaque cristal, définissez la limite de résolution et le nombre de trames et retracez avec les paramètres appropriés pour éviter d'intégrer des données avec peu ou pas de signal.
  4. Échelle et fusionnez les données des meilleurs cristaux au ou aux cristaux de référence en utilisant des paquets standard tels que Scalepack dans HKL-2000 31 , SCALA dans CCP4 34 , 35 ou XSCALE dans XDS 33 . Ajouter les données des différents cristaux progressivement tout en surveillant la qualité globale de l'ensemble de données, idéalement jusqu'à ce que l'ensemble de données atteigne une exhaustivité acceptable (> 95%). Rejeter les cristaux qui présentent un faible isomorphisme avec le meilleur cristal de référence détecté par les différences dans les paramètres de la cellule unitaire et la mauvaise fusion R / chi-carré par image. Si trop de jeux de données de bonne qualitéNe pas étaler avec le (s) cristal (s) de référence, utilisez un programme comme le BLEND 36 qui contient un cluster hiérarchique pour définir la meilleure combinaison d'ensembles de données à fusionner.
    Remarque: Dans certains groupes spatiaux, les options d'indexation alternatives doivent être testées pour correspondre au cristal de référence.
  5. Procédez au phasage expérimental, au remplacement moléculaire ou au raffinement en utilisant des paquets standard de cristallographie.

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Résultats

Un aperçu des deux méthodes alternatives pour la détermination de la structure à l'aide de microcristaux in vivo est présenté ( figure 1 ). Les polyèdres peuvent être facilement purifiés par sonication et centrifugation. En raison de leur densité, ils forment une couche au bas du tube sous une couche de débris qui peut être enlevée par pipettage ( Figure 3a et 3b ). L'échantillon est en...

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Discussion

Ce protocole fournit deux approches pour analyser les microcristaux dans le but de faciliter l'analyse de très petits cristaux qui auraient été négligés par le passé.

Mesures critiques pour la purification du microcristal
Le protocole présenté a été optimisé en utilisant la polyhédrine Bombyx mori CPV1 exprimée dans les cellules Sf9 en tant que système modèle. Cependant, les microcristaux in vivo présentent une grande variabilité dans la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier Chan-Sien Lay pour avoir fourni des images de microcristaux purifiés, Daniel Eriksson et Tom Caradoc-Davies pour le soutien de la ligne MX2 du Synchrotron australien, et Kathryn Flanagan et Andrew Fryga de l'installation FlowCore à l'Université Monash pour leur Aide inestimable.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sf9 cellsLife Technologies
SF900-SFM milieu pour insectesLife Technologies
1 L flacon de culture cellulaireThermofisher Scientific
Incubateur à secousses pour la culture cellulaire d’insectesEppendorf
50 mL Tubes coniquesFalcon
Centrifugeuse avec godets pivotants pour 50 mL tubesEppendorf
Sonicator équipé d’une sonde de 19 mmMSE Soniprep 150  ;
Lames de verreHampton Research
HémacytomètreSigma-Aldrich
Iodure de propidiumThermofisher Scientific
BD Trieur de cellules d’influx  ;BD Biosciences
Hampton Les tamis à atomes lourdsHampton Research
MicrocentrifugeEppendorf
MicromeshMitigen700/25 mesh offrent une plus grande surface. Des maillages indexés peuvent être achetés pour des études systématiques.
Mèche en papierMitigenLa taille de la mèche en papier peut être modifiée pour un écoulement optimal. Cela dépendra en grande partie de la nature des cristaux et du cryoprotecteur utilisés.
Éthylène glycolSigma-Aldrich
Trypan blueLife Technologies
MX2 ligne de faisceau microfocaleSynchrotronUne liste des lignes de faisceau microfocales disponibles se trouve dans Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash ; 1806,
doi :10.1071/CH14455.
australien

Références

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Mots-clés

Cristallographie aux rayons Xcytom trie en fluxisolation de cristauxligne de lumi re microfaisceaudiffraction s quentielletrempage aux atomes lourdsmontage sur micro maillage

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