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Article de méthode

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

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DOI :

10.3791/55795

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3 août 2017

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1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

Résumé

Les cellules endothéliales (CE) sont les éléments fondamentaux de l'architecture vasculaire et mesurent la croissance vasculaire et le remodelage pour assurer un développement adéquat des vaisseaux et une homéostasie. Cependant, les études sur la hiérarchie des lignées endothéliales restent difficiles à respecter en raison de l'absence d'outils pour accéder à leurs connaissances et d'évaluer directement leur comportement in vivo . Pour remédier à cette lacune, un nouveau modèle de tissu pour étudier l'angiogenèse à l'aide du tampon gras mammaire a été développé. La glande mammaire se développe principalement dans les étapes postnatales, y compris la puberté et la grossesse, au cours desquelles une prolifération robuste de l'épithélium s'accompagne d'un remodelage vasculaire étendu. Les tampons à graisse mammaire fournissent des stimuli spatiaux, matriciels et riches en angiogénie de l'épithélium mammaire en croissance. En outre, les tampons à graisse mammaire sont situés à l'extérieur de la cavité péritonéale, ce qui en fait un site de greffage facilement accessible pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. Ce travail décrit également une efficacitéNt approche de traçage en utilisant des souris rapporteurs fluorescentes pour étiqueter spécifiquement la population ciblée de cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) in vivo . Cette méthode de traçage de lignage, associée à un microscopie de tissu entier, permet la visualisation directe des cellules ciblées et de leurs descendants, grâce auxquelles la capacité de prolifération peut être quantifiée et l'engagement de différenciation peut être cartographié. En utilisant ces méthodes, une population de récepteurs de protéine Bipotent (Procr) exprimant des VESC a récemment été identifiée dans de multiples systèmes vasculaires. Procr + VESC, donnant naissance à la fois de nouvelles EC et des pericytes, contribuent activement à l'angiogenèse au cours du développement, de l'homéostasie et de la réparation des blessures. Dans l'ensemble, ce manuscrit décrit une nouvelle transplantation de graisse mammaire et des techniques de traçage de lignage in vivo qui peuvent être utilisées pour évaluer les propriétés des cellules souches des VESC.

Introduction

Au cours du développement et de l'homéostasie, la croissance vasculaire et le remodelage se déroulent fidèlement en fonction de la croissance et de la réparation des organes. L'angiogenèse décrit la génération de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux sanguins préexistants et est considérée comme une force majeure en médiation de ces changements vasculaires dynamiques. Chaque vaisseau sanguin est doublé à l'intérieur d'une couche de cellules endothéliales (EC), et ils semblent être le fondement de l'architecture des navires. Pendant longtemps, le mécanisme par lequel le pool de la CE est reconstitué pendant l'homéostasie est resté incertain et des arguments ont été soulevés sur le fait que le renouvellement vasculaire est le résultat d'une prolifération mature de la CE ou est la contribution des activités vasculaires des cellules souches / progénitrices. En raison de l'absence de données physiologiques directes, l'existence et l'identité cellulaire des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) sont également restés controversés.

L'une des approches les plus communes utilisées pour vérifier le comportement des cellules souches est à travers le transplanTation de cellules souches putatives dans des souris destinataires. Cette méthode mesure le potentiel de la tige des cellules souches candidates in vivo. La transplantation a d'abord été appliquée à l'étude des cellules souches de la moelle osseuse 1 , ce qui a contribué à l'établissement des caractéristiques hiérarchiques du système hématopoïétique 2 . Dans le champ endothélial, un bouchon de matrice de membrane basique ( p. Ex ., Matrigel) inséré sous la peau sous le flanc a été un test standard d' angiogenèse in vivo utilisé pour traiter les capacités de formation des vaisseaux des CE transplantés. Plusieurs méthodes expérimentales, y compris la formation de colonies dans les systèmes de culture 3D et la transplantation, ont suggéré des populations potentielles de progéniteurs / VESC de la CE 3 , 4 , 5 , 6 . Cependant, comme les EC incorporés dans la matrice de la membrane du sous-sol sont relativement séparés deLe tissu environnant, cela ne fournit pas l'environnement de niche optimal requis pour explorer pleinement le potentiel angiogénique des cellules transplantées. En conséquence, les vaisseaux formés à l'intérieur du bouchon de matrice sont principalement de type capillaire et sont fonctionnellement non mesurables.

La glande mammaire se développe par voie postnatale, la croissance la plus forte se produisant pendant la puberté et la grossesse. Au stade pubertaire, l'épithélium mammaire subit une expansion rapide, pour occuper l'ensemble des graisses mammaires, accompagné d'un remodelage efficace des structures vasculaires environnantes. Ainsi, la glande mammaire offre un excellent modèle pour l'étude de l'angiogenèse. Il fournit de l'espace, de la matrice et des stimuli angiogéniques riches à partir de l'épithélium mammaire grandissant et constitue donc un site de greffage idéal pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. En outre, le tampon gras mammaire permet aux vaisseaux exogènes formés de s'intégrer au système de circulation de l'hôte, ce qui permet d'ajouter fÉvaluation décentralisée et représentant un avantage sur la transplantation sous-cutanée.

Bien que les essais de culture et de transplantation in vitro soient un moyen efficace d'étudier les propriétés de régénération d'une population cellulaire, on sait que de tels tests peuvent stimuler la plasticité lorsque les cellules sont retirées de leurs habitats indigènes et que des changements peuvent être induits lorsque les cellules sont déconnectées de Leur environnement physiologique 7 . Par conséquent, l'obtention de preuves directes in vivo du devenir cellulaire est l'approche clé pour faire avancer la compréhension actuelle du comportement des populations endothéliales.

La cartographie du devenir génétique ( c.-à-d., Le traçage des lignées in vivo ) est impératif pour l'identification des VESC et pour l'étude de leurs propriétés dans le système du corps, car il peut révéler le comportement des cellules souches in vivo dans son contexte physiologique et la tige réelle peut être Évalué. Traits de lignageNg fournit une preuve directe de la persistance à long terme ( c. -à- d. L' auto-renouvellement) des VESC candidats et leur capacité à produire des types de cellules pour le tissu d'origine ( c'est-à-dire la puissance de différenciation).

Ce protocole décrit une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire et une méthode de traçage de lignée pour observer la capacité de génération de vaisseau des VESC. Ces techniques suppriment les faiblesses des tests actuellement disponibles et fournissent une nouvelle façon d'évaluer de manière optimale les propriétés des cellules souches des VESC. Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être utilisés pour évaluer le comportement et les propriétés de formation des vaisseaux des populations endothéliales, ainsi que pour déterminer l'altération de la puissance des cellules vasculaires dans un environnement pathologique.

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Protocole

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, l'Académie chinoise des sciences, selon le protocole approuvé SIBCB-NAF-15-002-S335-003.

1. Isolation des VESC de la glandes mammaires de la souris

  1. Récolte de mammifères mammaires et digestion des tissus.
    1. Utilisez 8 souris moines vierges matures d' Actin-GFP d' une semaine, avec des poids compris entre 20 et 25 g, en tant que donneurs de tissus.
      Remarque: Les cellules provenant du donneur peuvent être facilement suivies par l'expression GFP.
    2. Préparer un milieu de base de digestion des tissus constitué de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de stylo / streptococèses et 25 mM d'HEPES dans RPMI1640. Filtrer le mélange à travers un filtre de 0,22 μm pour stériliser et préchauffer à 37 ° C dans un bain d'eau.
    3. Sacrifiez les souris dans une chambre à CO 2 . Dissectionnez la quatrième paire de glandes mammaires inguinales en faisant d'abord une peau verticale iNcision à la ligne médiane inférieure de l'abdomen à l'aide d'un scalpel (ou ciseaux chirurgicaux). Épluchez doucement la peau d'un côté pour exposer la glande mammaire inguinale à l'aide d'une pince. Obtenir les quatre glandes mammaires inguinales des deux côtés et les couper en morceaux fins dans une boîte de Petri de 6 cm à l'aide de ciseaux.
      1. Mesurer le poids total du tissu émincé et le placer dans un tube de 50 mL.
        Remarque: Assurez-vous que le morceau de tissu résultant est inférieur à 1 mm 3 de taille pour chaque pièce. Un rendement typique est d'environ 5 000 VESC par animal.
    4. Préparer le milieu de base de la digestion dans un tube de centrifugation coiffée de 50 ml au volume de 10 mL par 1 g de moelleux de tissu. Ajouter la collagénase de type 3 à la concentration de 300 unités par 10 ml de milieu de base de digestion pour constituer le tampon de digestion. Mélanger uniformément et l'ajouter au mouchoir.
    5. Placer horizontalement le tube de centrifugation de 50 ml sur une plate-forme basculante et régler la vitesse à 100 tr / min et la température à 37 ° C. AgiterLe tissu mammaire pendant 2 h. Vérifiez et secouez manuellement le tube toutes les 20 minutes pour assurer une bonne digestion.
      Note: Le but de la digestion des tissus avant FACS est de préparer une solution monocellulaire à partir de tissus solides. Par conséquent, à la fin de la digestion, le contenu doit être une solution épaisse sans morceaux de tissus visibles.
  2. Préparation de solution monocellulaire.
    1. Après la digestion, compléter le tube de centrifugation de 50 ml avec du PBS pré-réchauffé et stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes pour obtenir une pastille cellulaire.
    2. Retirer le surnageant et faire basculer le fond du tube pour desserrer la pastille cellulaire. Ajouter 3 ml de tampon de lyses de globules rouges (voir la Table des matières) et incuber dans un capuchon de culture tissulaire à température ambiante (RT) pendant 5 minutes pour éliminer les globules rouges.
    3. Ajouter 10 ml de PBS stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le contenu tissulaire à 200 xg pendant 5 min et le disqueLe surnageant. Ajouter 3 ml de trypsine préchauffée à 0,05% et stocker le tube à 37 ° C pendant 5 min pour digérer davantage le tissu restant.
    4. Ajouter 3 mL de IMDM préchauffé puis ajouter 100 μL de solution de DNase I (0,25 mg de DNase I diluée dans 1 ml de PBS). Rangez le tube à 37 ° C pour séparer les filaments d'ADN. Passer le mélange de tissus à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour obtenir la solution cellulaire. Rincer le filtre deux fois avec 2 ml de PBS + 5% de FBS pour neutraliser la digestion enzymatique.
    5. Centrifuger le mélange cellulaire à 200 xg pendant 5 minutes pour granuler les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS + 5% de FBS pour colorer les anticorps.
  3. Isolation Procr + VESC basée sur FACS.
    1. Soumettre le mélange cellulaire obtenu à partir du tissu mammaire donneur à la coloration d'anticorps suivant les protocoles de routine publiés 8 .
      Note: Les anticorps suivants ont été utilisés: anti-sourisLignée de sang-FITC, CD31 anti-souris (PECAM1) -PECY7, anti-souris CD105-APC (tous utilisés à une concentration de 1 μg / mL), anti-souris CD201 (Procr) -biotine (utilisée à une concentration de 2,5 Μg / mL) et la streptavidine-v450 (utilisée à une concentration de 0,5 μg / mL).
      1. Après la coloration des anticorps, compléter les cellules avec PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et resuspendre les cellules avec 1 ml de PBS + 5% de FBS. Filtrer par une passoire de cellule de 40 μm. Placez-le sur glace jusqu'à ce que le tri FACS.
    2. Procédez pour effectuer un triage basé sur FACS pour isoler Procr + VESCs.
      1. Analyser l'échantillon non coloré et chaque contrôle de couleur unique pour déterminer la tension pour chaque couleur. Calculez les paramètres de compensation pour éviter l'auto-fluorescence ou la coloration d'arrière-plan. Configurez le modèle pour le gating et le tri approprié pour les populations de cellules souhaitées.
      2. Pour établir la hiérarchie du triage FACS, d'abord éliminer les débris deTous les événements, puis jeter les doublets ou les cloches de cellules adhésives en déclenchant avec une largeur. Déposer des cellules de lignée de sang, puis utiliser CD31 + et CD105 + pour définir les populations endothéliales.
        Note: Les cellules Procr + ont été isolées de CD31 + CD105 + EC par rapport à un contrôle FMO. Un graphique représentatif de l'analyse FACS est représenté à la figure 1 . Une population VESC isolée FACS devrait être suspendue dans IMDM + 50% FBS et stockée sur de la glace jusqu'à un traitement ultérieur.

2. In Vivo VESC Ensemble de formation de navire en utilisant le tampon de graisse mammaire

  1. Préparer les EC primaires pour la transplantation.
    1. Remplir les cellules triées FACS avec 10 mL de PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes pour régler les cellules vers le bas.
    2. Aspirer soigneusement le liquide, compter le numéro de cellule à l'aide d'un hémocytomètre et ré-endiguer le culot cellulaire avec un mélange de matrice de membrane basique (consiUne piqûre de 50% de matrice de membrane de sous-sol et de PBS avec 20% de FBS, complétée avec 100 ng / mL de rmVEGF et 60 U / mL d'héparine) pour atteindre une concentration de 15 000 cellules / 15 μL.
      Remarque: Le mélange matriciel de la membrane basale doit toujours être conservé sur de la glace.
    3. Diluer en série les cellules triées et comptées pour atteindre les concentrations d'entrée requises dans un microtube de 1,5 mL, en veillant à ce que les volumes d'injection finaux ne dépassent pas 15 μL au total. Ajoutez 0,1% de bleu trypan à chaque tube pour une meilleure visualisation du contenu pendant la transplantation. Pipeter soigneusement pour mélanger. Rangez les tubes sur glace jusqu'à leur utilisation.
      Note: Une génération réussie des navires pourrait être réalisée avec un minimum de 100 VESC.
  2. Transplanter les EC primaires sur la graisse mammaire.
    1. Désinfectez les instruments chirurgicaux et la tablette. Si vous utilisez les mêmes instruments sur plusieurs animaux, un stérilisateur à perles peut être utilisé pour la désinfection.
    2. Anesthésier 3-week-old BALB / c nude microE en utilisant le protocole anesthésique recommandé par le vétérinaire de votre établissement et l'IACUC. Placez chaque souris en position couchée, avec son dos sur la table d'opération. Immobiliser ses membres en utilisant du ruban adhésif.
    3. Trempez un coton-tige en solution antiseptique à base d'iode. Essuyez complètement toute la zone de l'abdomen de la souris pour stériliser la surface de la peau avant la chirurgie.
    4. Tenez et soulevez la peau de l'abdomen de la souris avec une pince. Utilisez un scalpel chirurgical pour faire une petite incision verticale de 1 cm. Faites deux coupes d'environ 0,5 à 1 cm de longueur, chacune vers la patte arrière, pour obtenir une incision à l'envers et en forme de Y.
      1. Utilisez une pince et un coton-tige pour séparer doucement la peau de l'abdomen et épinglez la peau de coté pour exposer les glandes mammaires inguinales. Placez la souris sous un stéréoscope et réglez le grossissement sur 2.0X. Assurez-vous d'ajuster la mise au point de sorte que le tampon gras mammaire puisse être clairement vu et utilisé.
    5. Placez un besoin de 27G 1/2 "E sur la glace pour pré-refroidir. Préparez une seringue de 1 mL avec un mélange de matrice de membrane basique à l'avance pour éliminer les éventuelles bulles d'air piégées dans la région de fixation de l'aiguille. Pipetter 15 μL de solution mélangée sur le capuchon du tube à microcentrifugeuse, puis aspirer le volume entier dans la seringue amorcée.
    6. Tenez le coussinet gras mammaire devant le ganglion inguinal, utilisez une pince fine et soulevez-le légèrement pour une injection facile. Insérer délicatement environ 1/4 de l'aiguille de la seringue dans le tampon gras.
      1. Relâchez la pince à épiler de la façade pour la serrer et stabilisez l'aiguille de la seringue. Injecter la solution lentement pour éviter une fuite de liquide. Tenez pendant quelques secondes pour vous assurer que le mélange cellulaire est solidifié pour minimiser les fuites lors de l'extraction de l'aiguille.
    7. Fermez le volet de la peau avec des sutures absorbables. Suture le volet de la peau en utilisant une suture de monofilament non réactive de taille 5-0 et fermez les plaies avec des noeuds de style chirurgien, chaque noeud approximatifÀ 0,3 cm d'intervalle. Sinon, fermez la peau avec des agrafes enroulées.
    8. Placez les souris activées dans une cage séparée pour récupérer. Placez une lampe de chauffage sur la cage pour éviter que les souris anesthésiées ne souffrent d'hypothermie. Placez du papier doux et du coton au fond de la cage pour garder les souris chaudes après la chirurgie.
      1. Respectez attentivement les souris jusqu'à ce que tous les récipients soient complètement éveillés. Pour les prochains jours, appliquer des analgésiques post-chirurgicaux de manière préventive à tous les animaux ou selon les directives du vétérinaire de l'établissement. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si une infection de la plaie survient. Si la plaie chirurgicale a été fermée avec des agrafes enroulées, retirer les attaches de la plaie 10 jours après la chirurgie, lorsque la plaie a complètement fermé.

3. Préparation des tissus à montage intégral pour l'observation microscopique

  1. Récolte de tissus
    1. Après 2 à 4 semaines après l'implantation, anesthésier le récepteur BALB / cDes souris nues avec une injection intrapéritonéale d'agent anesthésiant de 2,5% à une dose de 0,12 ml par 20 g de poids corporel, comme à l'étape 2.2.2.
      Note: La croissance positive des vaisseaux peut être détectée 2 à 4 semaines après la transplantation cellulaire.
    2. Étiquetez la circulation systémique du destinataire avec une injection de la queue-veine du colorant isolectin-647 à une dose de 50 μg / 25 g de poids corporel, remis en suspension dans 50 μL de PBS stérile. Permettre une période de repos de 5 à 10 min. Sacrifiez les souris en utilisant du CO 2 .
    3. Dissectionner la zone du tissu mammaire où les cellules ont été injectées initialement après l'étape 2.2.4; Utiliser des ciseaux chirurgicaux. À l'aide d'une lame chirurgicale, coupez le tissu dans environ 3 à 3 mm 3 cubes dans une boîte de Petri de 6 cm.
  2. La digestion des tissus et la préparation pour la coloration des anticorps.
    1. Découper les morceaux de tissu dans un tube de centrifugation de 15 ml rempli de 10 ml de milieu de base de digestion préalablement réchauffé (étape 1.1.2) complété par une collagénase III(300 U par 10 ml).
    2. Placer le tube de centrifugation de 15 mL horizontalement sur une plate-forme basculante avec une vitesse réglée à 100 tr / min et la température réglée à 37 ° C pendant environ 1 heure pour desserrer la structure tissulaire et éliminer les tissus adipocytaires excessifs.
      Note: Les adipocytes ont tendance à produire une auto fluorescence qui pourrait entraîner un fond fluorescent bruyant. À la fin de la digestion, les morceaux de tissu doivent avoir une apparence douce et trouble. La période de digestion optimale dépend de la taille des morceaux de morceaux hachés et devrait donc être ajustée en conséquence pour obtenir les meilleurs résultats. Étant donné que la vascularisation du tissu a déjà été marquée avec de l'isolectine marquée par fluorescence, toutes les procédures suivantes doivent être effectuées contre la lumière.
    3. Laver les morceaux de tissu avec du PBS à la température ambiante pendant 10 minutes. Fixez le tissu total en plaçant soigneusement les pièces dans une boîte de Petri de 6 cm à moitié remplie avec 4% de PFA (pH 7,2 à 7,4) pour préserver la fluorescence. Placer la boîte de PetriSur une plate-forme basculante et agiter doucement le tissu pendant 30 min à la température ambiante.
      Note: Le PFA est cancérogène et doit être manipulé avec précaution.
    4. Retirez le PFA restant et lavez le tissu fixe trois fois avec un tampon de lavage complet (0,1% d'interpolation dans PBS), avec un intervalle de 10 minutes entre chaque lavage.
  3. Coloration intégrée des anticorps tissulaires.
    1. Diluer l'anticorps primaire dans un tampon de coloration d'anticorps dans un tube de centrifugation de 2 mL. Incuber le tissu avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C.
      Note: On utilise comme anticorps primaires le rat anti-CD31 (concentration: 10 μg / mL) ou la protéine anti-VE-Cadherine (CD144 / Cdh5: 2,5 μg / mL). Les CD31 et les VE-Cadherin sont des marqueurs de surface cellulaire utilisés pour reconnaître l'endothélium. Un tampon de coloration 5x anticorps est préparé avec de l'acide maléique 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; Et 0,5% (v / v) d'interpolation dissous dans PBS. Ajouter uniquement un volume sérique approprié (5%) lors de la préparation d'une nouvelle solution de travail 1x9 .
    2. Retirez le tampon de coloration d'anticorps et lavez le tissu de montage complet trois fois avec un tampon de lavage, avec un intervalle de 10 minutes. Incuber le tissu avec un anticorps secondaire (voir la Table des matières ) plus DAPI à la RT pendant 4 h sur une plate-forme basculante ou pendant une nuit à 4 ° C.
      Note: utiliser DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) à une concentration finale de 5 μg / mL pour visualiser les noyaux.
    3. Laver le tissu total avec un tampon de lavage 3 fois pendant 10 minutes chacun. Incuber les morceaux de tissu dans 80% de glycerol ou 80% de saccharose pendant une nuit pour déshydrater le tissu pour une meilleure conservation.
    4. Placez les morceaux de tissu individuels sur une glissière en verre et retirez le tampon de déshydratation excessif. Couvrir le tissu avec un support de support, poser une lamelle et serrer doucement le tissu pour le régler.
    5. Effectuer une acquisition d'image microscopique confocal. Pour les glandes mammaires intégrales, acquérir des images à l'aide d'un objectif 40X avec NA = 1.3 oil objectiVe. Acquérir les balayages des tuiles Z à une résolution de section optique de 1 024 x 1 024 et une séparation des couches de 1,0 à 1,2 μm.
      Remarque: Pour capturer le signal lumineux de fluorescence correct, le diviseur de faisceau de filtre doit être réglé sur triple dichroïque (TD) 488/553/638, avec le réglage de gain au PMT Gain 600-800. Les sources d'excitation / émission suivantes doivent être utilisées: mGFP, avec maxima d'excitation / émission de 488/509 nm; MTomato avec maxima d'excitation / émission de 532/588 nm; Alexa-647, avec maxima d'excitation / émission de 594/665; Et DAPI, avec maxima d'excitation / émission de 350/470.

4. Traçage linéaire à l'aide d'un modèle de souris génétiquement modifié

  1. Détectez Procr + VESC à l'aide du modèle de la souris.
    1. Utilisez la souche de traction Traver Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (appelée Procr CreERT2 ).
      Remarque: Dans ce modèle de souris, une cassette Creert2-IRES-tdTomato 10 est inséré après le premier codon ATG de Procr 11 .
      1. Les souris Cross Procr CreERT2 avec la souche rapportrice Rosa26 mTtomatomGFP (appelée R26 mTmG ) pour repérer le sort des Procr + EC in endogènes in vivo 11 . Identifiez toutes les Procr + EC endogènes étiquetées et leurs descendants en utilisant une expression GFP.
    2. Administrer la solution de tamoxifène 11 (10 mg de tamoxifène dissous dans 1 mL d'huile d'arachide + 10% d'éthanol pour constituer une solution mère de 10 mg / mL) par voie intrapéritonéale à une dose de 4 mg / 25 g de poids corporel pendant le stade pubertaire (5 semaines Ancien) pour suivre le sort du développement de Procr + ECs.
    3. Analyser l'efficacité de formation de clones des cellules marquées par l'immunocoloration totale après les étapes de préparation décrite à l'étape 3. Obtenir des tampons gras de mammifères à partir de souris traitées à la fois à court terme (2 jours) et des délais prolongés (jusqu'à 10 mois). Voir la figure 3 .

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Résultats

Isolation mammaire VESCs:

Pour isoler la population endothéliale pour le dosage de transplantation consécutif, des glandes mammaires vierges de souris (8 semaines) ont été récoltées en tant que matériau donneur. Les cellules endothéliales ont été isolées en utilisant une technique de tri cellulaire à base d'anticorps. Des graphiques représentatifs de l'analyse FACS de la population VESC dans les EC de glande mammaire C57B...

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Discussion

Les analyses d'angiogenèse représentent une bonne approche expérimentale pour étudier la dynamique vasculaire. La vascularisation de la rétine de la souris, qui se développe par voie postnatale, s'est avérée être un modèle attrayant pour étudier l'angiogenèse 12 . Bien qu'il soit relativement accessible, la manipulation réelle dans le lit vasculaire de la rétine est plutôt difficile. Jusqu'à présent, la transplantation in vivo la mieux décrite a été le test du bouchon...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31530045 et 31371500 à YAZ, 31401245 à QCY), le Ministère de la Science et de la Technologie de Chine (2014CB964800), l'Académie chinoise des sciences (XDB19000000 à YAZ) et les Chinois Société de biologie cellulaire (Early Career Fellowship to QCY).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine-éthylène diamine Acide tétraacétique (EDTA) (1x)Gibco (Life Technologies)25300-0620,05 % Trypsine
0,22 & micro ; m Unité de filtrationMerck Millipore Ltd.SLGP033RB0,22 et micro ; m Filtre
2-Méthylbutanol-2, ReagentPlusSigma-Aldrich24, 048-6Alcool amylique tert
222, TribrométhanolSigma-AldrichT48402-25g222, Tribrométhanol
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)InvitrogenD1306DAPI
70 µ ; m Crépine à cellulesBD FAL35235070 & micro ; m Lame de microscope à adhérence de filtre cellulaire
CITOGLAS188105Lames en verre
Anti-souris CD105 APCeBioscience17-1051-82, clone MJ7/18pour l’utilisation de l’analusis FACS à 1 & micro ; g/mL
Anti-souris CD201 BiotineeBioscience13-2012-82pour l’utilisation de l’analusis FACS à 2,5 & micro ; g/mL
Anti-souris CD31 PE-Cyanine 7eBioscience25-0311-82, clone 390pour l’utilisation de l’analusis FACS à 1 µ ; g/mL
BD FACSJazz Trieur de cellulesBD Biosciences655489FACS
Sérum bovin AlbumineSigma100190332
BSA CentrifugeuseEppendorf5810RCentrifugeuse
Collagénase de type 3Worthington-Biochem#LS004183Collagenase III
Microscopie confocaleLeicasp8Confocale
Désoxyribonucléase I du pancréas bovinSigmaD2463-5VLDnase I
Âne anti-rat Cy3Jackson ImmunResearch712-165-150Anticorps secondaire, utilisation à 0,5 & micro ; g/mL
Pince DumontWPI500342Froceps
Pince Dumont - Micro-Blunted TipsFST11253-20Forceps
Fetal BovinSerum HycloneSH30396.03FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119BioLegend78022Cocktail de lignage sanguin pour l’analyse FACS, utilisation à 25 µ ; L par test
GlycérolSigmaG6279Glycérol
Iscov Modifié Dulbecco’s MediumGibco (Life Technologies)12440-053IMDM
Isolectine GS-IB4 de Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  ; 647InvitrogenZ32450Isolectin-647
Matrigel  ; Matrice (facteur de croissance réduit)BD356231Matrigel
Souche de souris (Actin-GFP)Jax Laboratories3773Souche de souris Actin-GFP
(C57BL/6)SLACC57BL/6C57BL/6
Souche de souris  ; (BALB/c nu)SLACBALB/c nudeSouris nues
ParaformaldéhydeSigmaP6148PFA
Pénicilline StreptomycineGibco (Life Technologies)5140-122Pen/Strep
Phosphate Saline (pH7.2) 1xGibco (Life Technologies)c20012500BTPBS
PRIM1640Gibco (Life Technologies)c11875500CPPRIM1640
Réactif anti-décoloration ProLong GoldLife TechnologiesP36934Medium
Rat anti CD144BD Biosciences550548pour l’analyse de montage entier, anti-VE-Cadhérine / Cdh5 antibdy pour jonction étanche endothéliale, utilisation à 2,5 & micro ; g/mL
Rat anti CD31-biotineBD Biosciences553371pour l’analusis complet, anticorps anti-CD31/PECAM1 pour la molécule d’adhésion de surface endothéliale, utilisation à 10 & micro ; g/mL
Tampon de lyse des globules rougesSigmaR7767-100MLTampon de lyse des globules rouges
Droit/Sharp-Blunt/10cmFST14028-10Ciseaux fins
Streptavidin eFluor 450eBioscience48-4317-82pour l’analyse FACS utilisation à 0,5 µ ; g/mL
TamoxifèneSigma101551374TAM
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-250MLTritonX
Soie tressée enduite de cire (taille 5-0 USP (1 métrique), 18 pouces (45 cm) NOIR sur aiguille C-1)COVIDIENS1173Suture  ;
Scaplels jetables stérilesSwann Morton#10Scalpel
BetadineYifeng Medical20160101Solution antiseptique

Références

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  2. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
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