Préparation à moyen terme de Drosophila Extraits d'embryons pour les expériences protéomiques

Résumé

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Résumé

L'analyse des interactions protéines-protéines (IPP) est devenue une approche indispensable pour étudier les processus et mécanismes biologiques, tels que la signalisation cellulaire, le développement de l'organisme et la maladie. Il est souvent souhaitable d'obtenir des informations PPI en utilisant du matériel in vivo , afin d'obtenir la vision la plus naturelle et la plus imparfaite des réseaux d'interaction. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est une excellente plate-forme pour étudier les IPP in vivo et se prête à des approches directes pour isoler le matériel pour les expériences biochimiques. En particulier, les embryons de mouche des fruits représentent un type de tissu approprié pour étudier les PPI, en raison de la facilité de collecte des animaux à cette étape de développement et du fait que la majorité des protéines sont exprimées dans l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement pertinent pour révéler la plupart des IPP. Nous présentons ici un protocole pour la collecte d'embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), ce qui constitue un montant idéal pour une large gamme deApplications protéomiques, y compris l'analyse des IPP par spectrométrie de masse par purification par affinité (AP-MS). Nous décrivons nos modèles pour les cages 1 L et 5 L pour les collections d'embryons qui peuvent être facilement et peu coûteuses dans n'importe quel laboratoire. Nous proposons également un protocole général pour la collecte des embryons et l'extraction des protéines pour générer des lysats qui peuvent être utilisés directement dans les applications en aval telles que l'AP-MS. Notre objectif est de fournir un moyen accessible à tous les chercheurs d'effectuer les analyses des IPP in vivo .

Introduction

Les écrans génétiques et, plus récemment, les approches génomiques ont révolutionné l'étude des fonctions biologiques. Cependant, des informations cellulaires importantes sont codées dans les protéines et leur ensemble de partenaires en interaction. Alors que les écrans modificateurs génétiques traditionnels peuvent identifier les composants de la voie limitant le taux et récupérer les interactions indirectes, la force des approches protéomiques réside dans leur capacité à identifier des réseaux complets d'interactions immédiates de protéines d'intérêt. La protéomique est donc une méthode orthogonale précieuse pour étudier les systèmes biologiques et complète la génomique, la transcriptomie et les écrans génétiques traditionnels. La purification par affinité - la spectrométrie de masse (AP-MS) s'est révélée être une approche puissante pour étudier les interactions protéines-protéines (IPP) dans leur milieu naturel dans les cellules et les tissus ^{1 , 2} . Cette méthode permet d'identifier des interactions directes ou indirectes à un développement spécifiqueDes étapes ou des contextes tissulaires, et a été utilisée avec succès pour identifier de multiples IPP nouveaux dans une variété de voies de développement (examinées dans la référence ¹ ). Malgré le succès incontesté des études PPI, la plupart d'entre elles ont été réalisées dans des cellules cultivées, dans lesquelles les protéines d'intérêt "appât" ont été surexprimées. Il existe deux problèmes avec l'étude des PPI dans la culture cellulaire: premièrement, une lignée cellulaire spécifique peut ne pas fournir un complément complet d'interactions en raison du manque d'expression de certaines protéines. Deuxièmement, une forte surexpression habituellement utilisée dans de telles analyses pourrait conduire à des artefacts tels que le repli des protéines ou l'identification d'interactions faussement positives.

Ces deux limites peuvent être surmontées en analysant les IPP in vivo . Une étape limitante dans de telles expériences est la disponibilité du matériau de départ pour la purification des complexes de protéines. Drosophila melanogaster a longtemps été utilisé comme modèle d'analyse fonctionnelleSis, et récemment, il a également été démontré qu'il s'agissait d'un excellent système d'étude des IPP in vivo . L'embryogenèse de Drosophila représente un type de tissu particulièrement attrayant pour étudier les IPP, car les embryons peuvent être facilement collectés en grandes quantités, et aussi parce que la plupart des gènes (> 88%) sont exprimés au cours de l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement riche in vivo pour détecter des facteurs pertinents PPI ³ .

Traditionnellement, les études biochimiques dans les mouches utilisaient des collections embryonnaires à très grande échelle (100-150 g), telles que celles nécessaires à la purification des lysats fonctionnels transcriptionnels ^{4 , 5} . Les études AP-MS antérieures chez Drosophila nécessitaient également de grandes quantités d'embryons (5-10 g), car elles reposaient sur une approche de purification en deux étapes telle que la purification par affinité en tandem (TAP), avec la perte de matériau associée à chaque étape ⁶ . Grand amounLe matériel de départ nécessitait la mise en place de collections d'embryons dans de grandes cages de population, ce qui peut coûter cher (lorsqu'ils sont achetés sur le marché) et long-temps pour maintenir et nettoyer ^{7 , 8 , 9} .

Les progrès récents dans le développement des approches de purification d'affinité à une étape, ainsi que la sensibilité croissante des spectromètres de masse, ont réduit la quantité nécessaire de matériau de départ d'un ordre de grandeur. En utilisant des marqueurs tels que le peptide de liaison à la streptavidine (SBP) ou la protéine fluorescente verte (GFP) et à partir de moins de 1 g d'embryons, il est possible d'isoler les quantités de protéines d'appât et les composants interactifs qui seraient suffisants pour l'identification par Spectrométrie de masse ^{10 , 11} .

L'objectif du protocole présenté ici est d'aider les chercheurs à surchargerMoi, une barrière perçue à l'analyse biochimique des IPP in vivo . À cette fin, nous proposons une procédure simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), suivie d'une préparation en une étape d'extraits de protéines de cellules entières qui conviennent pour une analyse ultérieure par AP-MS ou d'autres approches . Notre méthode repose sur l'utilisation de cages de population sur mesure de 1-L ou 5-L qui peuvent être facilement produites par n'importe quel laboratoire. En outre, les conditions d'extraction présentées ici ont été validées dans plusieurs études, à la fois dans des cellules cultivées et in vivo ^{10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Protocole

1. Préparation des cages à vapeur de 5 L (pour ajuster les plaques de 15 cm)

1. Obtenir les matériaux nécessaires: récipient de 5-quart (4.7-L) avec couvercle ( Figure 1A ), maille en nylon et une lame de rasoir.
2. Marquez un cercle de 12 cm de diamètre et coupez un trou dans le fond du récipient à l'aide de la lame de rasoir ( Figure 1B ). Couper un trou de 15 cm de diamètre dans le couvercle ( Figure 1C ).
3. Couper le nylon en carrés de 25 x 25 cm.
4. Placez le maillage sur le bord supérieur du récipient et appuyez vers le bas avec le couvercle ( Figure 1C ). Assurez-vous que le maillage est serré et que le couvercle n'est pas incliné. La cage est prête à être peuplée de mouches (voir l'étape 5.3).

2. Préparation des cages de mouche de 1 L (pour ajuster les plaques de 10 cm)

1. Obtenez les matériaux nécessaires: une perceuse électrique, un outil de coupe de 3 pouces (76 mm) ( Figure 1E et FIgure 1F), un pot en plastique de 1 L droit avec couvercle, maille en nylon, une lame de rasoir, du papier de verre, des lunettes et des gants de travail.
2. Couper les trous de 3 pouces (76 mm) dans le fond et le couvercle du bocal en plastique ( Figure 1G ), avec le couvercle bien vissé sur le récipient pendant le forage. Placez l'outil de coupe au centre du cercle en commençant à faire un trou.
   Attention: porter une protection oculaire et des gants de travail pendant cette étape.
3. Lisser les bords des trous avec une lame de rasoir et du papier de verre.
4. Couper le maille en nylon dans des carrés de 18 x 18 cm.
5. Placez le maillage sur le bord supérieur du pot et serrez-le en vissant le couvercle ( Figure 1G ). Assurez-vous que le maillage est serré et que le couvercle n'est pas incliné. La cage est prête à être peuplée de mouches (voir l'étape 5.3).

3. Préparation des jus de pomme (AJ)

1. Ajouter 19 g d'agar et 1 L de 18,2 MΩ · cm d'eau dans un flacon de 2 L.Ajouter une barre d'agitation, et mélanger brièvement.
2. Autoclave pendant 30 min. Pendant ce temps, dégonflez 100% de concentré de jus de pomme à partir d'un concentré congelé et préparez 10 ml d'une solution de méthyl-4-hydroxybenzoate de méthyle à 10% (poids / volume) dans de l'éthanol.
3. Après l'autoclavage, commencez à mélanger la gélose sur une plaque d'agitation et ajoutez 80 ml d'un concentré de jus de pomme à 100% et 10 ml d'une solution de 4-hydroxybenzoate de méthyle à 10% (poids / volume) dans le flacon. Laisser refroidir à température ambiante avec un mélange constant.
4. Verser des boîtes de Petri de 15 cm (pour cages de 5 L) ou des boîtes de Petri de 10 cm (pour cages de 1 L) afin que le niveau d'agar dans chaque plat soit d'environ 5 mm d'épaisseur. Laisser se solidifier à température ambiante et enrouler dans des sacs en plastique. Les plaques AJ peuvent être conservées à 4 ° C pendant deux semaines.
   Note: Les boîtes de Petri peuvent être lavées et réutilisées.
5. Préparer une pâte de levure humide: verser une levure sèche active dans un récipient de 100 ml avec un couvercle qui permettrait un mélange facile, et ajouter de l'eau dans de petites quantités en remuant, pour obtenir un mélange épais mais bien mélangécoller. Conservez à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.

4. Préparation des réactifs de lyse

1. Préparer un tampon de lyse 5x: Tris 250 mM pH 7,5, 25% de glycerol, 1% d'octylphénoxy poly (éthylèneoxy) éthanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM de MgCl2, NaCl 625 mM, 125 mM de NaF, 5 mM de Na ₃ VO ₄ .
   1. Pour former 200 mL: dissoudre complètement 1 g de poudre de NaF et 184 mg de Na ₃ VO4 en poudre dans 71 ml d'eau sous agitation constante. Ajouter 50 ml de Tris 1 M pH 7,5, 2 ml d'IGEPAL à 100%, 1,5 ml de MgCl ₂ 1 M et 25 ml de NaCl 5 M. Ensuite, ajouter 50 ml de glycerol (ajouter le dernier) et continuer à agiter pendant 1 h.
   2. Filtre-stérilisez avec des unités de filtration de 250 ml. Cette étape peut être lente, mais le filtrage de la solution est important pour éliminer les particules insolubles. Aliquote de 10 ml dans des tubes de 50 ml et entreposez à -80 ° C.
2. Préparer une solution de dithiothréitol (DTT) 1 M dans de l'eau. Conserver à -20 ° C dans des aliquotes de 1 ml.
3. Obtenir proteComprimés de cocktails inhibiteurs de l'ase, avec de l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA). Conserver à 4 ° C.
4. Obtenir des seringues de 10 ml et des filtres à seringue: diamètre 26 mm, membrane d'acétate de cellulose sans tensioactif (SFCA), taille de pores de 0,45 μm.

5. Collection d'embryons à la mouche

1. Amplifier les lignes de mouches transgéniques portant la protéine étiquetée d'intérêt dans des bouteilles (environ 100 mouches par bouteille) et transférer les bouteilles tous les 2 jours jusqu'à ce que 25-30 bouteilles soient accumulées pour chaque ligne de mouche. Amplifier le stock de contrôle ( par exemple, la ligne yw ) de manière similaire .
2. Les plaques chaudes AJ à température ambiante (environ 1-2 h, peuvent être faites pendant la nuit). À l'aide d'un doigt ganté, étaler de la pâte de levure humide au centre des plaques AJ, pour faire env. Cercle de 6 cm pour une plaque de 15 cm et un cercle de 4 cm pour une assiette de 10 cm.
3. Anesthésier les mouches avec un flux de dioxyde de carbone en utilisant une configuration de scène standard de Drosophila et transférer dansLes cages (environ 15 bouteilles de mouches bien cultivées par cage de 5 L, 5 bouteilles par cage de 1 L).
   1. Couvrir le fond de la cage avec des plaques AJ préparées à partir de l'étape 5.2 et attacher la plaque AJ à la cage à l'aide de deux bandes de ruban adhésif ( Figures 1D et 1H ). Il est utile de replier les pointes de la bande qui passent sur la plaque pour faciliter l'épluchage lors du changement de plaques.
   2. Après que les mouches se sont rétablies de l'anesthésie, gardez les cages avec les assiettes en bas et serrez dessus.
      Remarque: il est important d'attendre que les mouches se rétablissent complètement, car elles s'accrochent à la plaque AJ et à la pâte de levure.
   3. À la fin de l'expérience, pour préparer la cage pour le nettoyage, placez la cage dans le congélateur pendant plusieurs heures. Tremper le maillage dans l'eau pendant quelques heures facilitera le nettoyage.
4. Incuber les cages avec des mouches à température ambiante pendant 2-3 jours et changer les plaques AJ deux fois par jour. Pour changer les assiettes, tournez la cage à l'envers,Épluchez la bande de la plaque mais tenez la plaque dans la cage, tapez toute la cage doucement sur le banc et permettez rapidement l'ancienne plaque pour une nouvelle, en essayant de ne pas permettre aux mouches de s'échapper.
   Remarque: Les mouches doivent s'adapter à la cage et poser le meilleur départ au jour 3. Ils continueront à se coucher au niveau de crête pendant environ 4-5 jours. Deux cages de 5 L à la capacité de pose supérieure peuvent produire jusqu'à 1 g d'embryons dans une collection de nuit. Utilisez des cages 1 L pour des expériences à plus petite échelle.
5. Autoriser les mouches à déposer des embryons sur des plaques AJ fraîches pendant la nuit (environ 16 h), ou pendant toute autre durée souhaitée.
6. Le lendemain matin, marquez et pesez les récipients à mailles pour la collecte des embryons, un par chaque ligne de mouche utilisée.
7. Préparer 1x tampon de lyse, en utilisant des réactifs de la section 4 (Note: le tampon de lyse 1x prêt à l'emploi doit être préparé avant l'extraction): ajouter 40 mL d'eau à 10 mL de tampon de lyse concentré 5x (conservé à -80 ° C) Dans un tube de 50 ml.
   1. Ajouter 50 μL de 1 MDTT à une concentration finale de 1 mM, mélanger bien et séparer en deux tubes de 50 ml, 25 ml dans chacun. À l'un des tubes, ajouter un comprimé d'inhibiteur de protéase et faire tourner à 4 ° C pendant 30 minutes. Alors que la tablette se dissout, rassemblez et déchorez des embryons (étapes 5.8 à 6.6). Assurez-vous que la tablette a complètement dissous et conservez le tampon sur de la glace.
      Remarque: Le deuxième tube de 1x tampon avec DTT peut être stocké à -80 ° C et ne nécessitera plus d'addition de la tablette avant l'expérience suivante. 25 ml de tampon de lyse est suffisant pour jusqu'à 2 échantillons, en tenant compte des lavages ultérieurs pendant les étapes de purification des protéines.
8. Marquez les plaques AJ sur les cages avec les génotypes des lignes aériennes utilisées, et permettez les plaques pour les produits frais.
   Remarque: L'excès de levure peut être raclé de la plaque à cette étape. Les embryons peuvent être vieillis sur les plaques à 25 ° C ou à température ambiante pour obtenir la fenêtre souhaitée de temps de développement.
9. Ajouter assez d'eau tO couvrir chaque plaque AJ. Dégage doucement les embryons de la plaque avec une brosse à peinture douce (la tête plate d'environ 10 mm de large fonctionne bien pour les grandes plaques). Versez les embryons dans le récipient de maille marqué et marqué précédemment, et égouttez l'excès d'eau.
   1. Si nécessaire, effectuer un deuxième rinçage et un brossage de la plaque pour enlever tous les embryons. Mélanger les embryons des plaques supplémentaires pour la même ligne de mouche dans le même récipient à mailles.
10. Enlevez brièvement le maillage sur les serviettes en papier pour éliminer l'excès d'eau.

6. Dechorionation des embryons

1. Remplir à moitié une assiette de Petri de 6 cm avec eau de javel à 50% (solution vol / vol dans l'eau).
   Remarque: consultez les remarques importantes sur la marque d'eau de javel dans la Table des matériaux et des réactifs.
   Attention: porter des gants et éviter d'obtenir de l'eau de javel sur les vêtements.
2. Préparez 2 plats de Petri plus gros avec de l'eau.
3. Immerger le récipient de mailles avec des embryons dans 50% d'eau de javel pendant 90 s. Touchez doucement le maillot pendant l'incuPlusieurs fois pour suspendre les embryons dans la solution d'eau de Javel.
4. À la fin de l'incubation de 90 s, laver le récipient de maille dans chacune des 2 plats avec de l'eau pendant environ 10 s.
5. Rincer abondamment le récipient à mailles avec 18,2 MΩ · cm d'eau à l'aide de la bouteille d'éboulement. En outre, laver les côtés et l'extérieur du récipient à mailles.
   Remarque: Aucune odeur de blanchiment ne doit être détectée après un lavage approfondi.
6. Nettoyer le récipient de maille sur les serviettes en papier. Peser le conteneur de maille avec les embryons et soustraire le poids du récipient vide obtenu à l'étape 5.6. Notez le poids résultant des embryons. Une bonne quantité d'embryons à atteindre est de 0,5 à 1 g.

7. Préparation de l'extrait d'embryon

1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase (de l'étape 5.7) à un homogénéisateur de verre Dunch et le garder sur glace. Transférer les embryons du récipient à mailles dans l'homogénéisateur.
   Note: Les embryons peuvent être ramassés avec une extrémité plateUne spatule métallique ou une brosse et transférée directement dans le tampon. Effectuez toutes les étapes de cette section sur la glace.
2. Laver les embryons restants sur le maillage avec un tampon de lyse supplémentaire de 1 mL et ajouter au matériau dans l'homogénéisateur. Laissez les embryons s'installer au fond de l'homogénéisateur et aspiraz soigneusement le surnageant.
3. Ajouter un tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase (de l'étape 5.7) à l'homogénéisateur, en visant 5-6 mL de tampon de lyse par gramme d'embryons.
4. Homogénéiser les embryons de 4 à 6 coups avec un pilon lâche.
   Remarque: Pendant les premiers traits, il y aura plus de résistance. Essayez de déplacer le pilon dans un mouvement continu pour éviter d'éclabousser la solution.
5. Homogénéiser les embryons par 8-10 coups avec un pilon ajusté.
6. Incuber l'homogénat sur glace pendant 20 min.
7. Transférer l'homogénat en tubes de microcentrifugeuse et centrifuger à 4 ° C pendant 15 min à la vitesse supérieure (environ 13 000 xg).
8. EviterNg les pastilles et la couche lipidique maximale, transférez les surnageants dans des tubes de microcentrifugation frais et centrifugez à 4 ° C pendant 15 minutes à la vitesse supérieure (environ 13 000 xg).
9. Aspirer soigneusement les surnageants avec un bout de 1 ml et le charger dans des seringues réfrigérées de 10 mL avec des filtres de 0,45 μm (combiner les parties aliquotes du même échantillon en une seule seringue). Pousser toute la solution dans un tube marqué de 15 ml sur de la glace. L'extrait peut être utilisé immédiatement pour des expériences de purification de protéines ultérieures ou congelé à l'eau liquide et maintenu à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
   Note: Il est préférable de geler les extraits plutôt que les embryons, car pendant la décongélation ultérieure des embryons, les protéases peuvent être activées et conduire à une dégradation des protéines.

Résultats

Pour illustrer l'utilisation de ce protocole dans une expérience de purification de complexe de protéines, nous avons généré une ligne de mouche viable homozygote, bras-EGFP-ERK , exprimant la kinase extracellulaire régulée par Drosophila marquée par EGFP (ERK, codée par le gène roulé ) sous le contrôle D'un promoteur omniprésent d' armadillo ( bras ) ^{18 , 19} . Le promoteur...

Discussion

Le protocole présenté ici est une procédure simple et générale pour la mise en place des cages de population de Drosophila à l'échelle moyenne et la production d' extraits de protéines à cellules entières à partir d'embryons. Les extraits résultants peuvent être utilisés dans une variété d'applications en aval, telles que la purification de complexes de protéines sur des résines d'affinité. Il est essentiel d'effectuer les étapes d'extraction sur la glace et d'utiliser u...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (paquet de 3)	Home Depot	209330	Pour la fabrication de cages de 5 L.
Couvercle Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix (paquet de 3)	Home Depot	209320	Diamètre 8,37 po. Couvercles pour cages de 5 L.
Boîtes de Pétri Fisherbrand avec couvercle transparent, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Matériau : Polystyrène. À utiliser avec des cages de 1 L.
Boîtes de Pétri Fisherbrand avec couvercle transparent, 150 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Matériau : polystyrène. À utiliser avec des cages de 5 L.
Boîtes de Pétri Fisherbrand avec couvercle transparent, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Matériau : polystyrène. Utilisé lors de la déchorisation d’embryons.
Maille de nylon Sefar NITEX	Sefar	03-180/44	180 microns, 44 % de surface ouverte, utilisée pour les cages à mouches.
Milwaukee 3 po. Scie cloche avec tonnelle	Home Depot	49-56-9670	Outil de coupe de 3 pouces pour la fabrication de cages de 1 L.
Bocaux PMP à large ouverture et à parois droites Nalgene avec fermeture à vis en polypropylène blanc	Fisher Scientific	11-823-33	Pour la fabrication de cages de 1 L. Thermo Scientific cat # 21171000. D’autres contenants de 1 L peuvent être utilisés.
Levure sèche active Red Star, sachet de 2 livres	Red Star  ;		peut être acheté auprès de Amazon.com ou d’autres fournisseurs.
Concentré de jus de pomme 100 % congelé  ;			peut être acheté dans une épicerie. Doit dire « 100 % jus de pomme » sur la boîte.
Le 4-hydroxybenzoate de méthyle	Acros Organics	AC126965000	également connu sous le nom de méthylparaben ou Tegosept. Utilisé comme conservateur dans les plaques AJ.
IGEPAL CA-630 pour la biologie moléculaire, 100 ml	Sigma	I8896	utilisé pour la préparation du tampon de lyse.
Unités de filtration stérile jetables à débit rapide Nalgene avec membrane CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 &mu ; m taille des pores. Utilisé pour filtrer le tampon de lyse 5x. Thermo Scientific chat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Inhibiteur de Protéase Cocktail	Sigma	11697498001	Flacon de 20 comprimés. Utilisé pour l’inhibition de la protéase dans le tampon de lyse.
Filtres à seringue Corning SFCA  ;	Fisher Scientific	09-754-21	Membrane SFCA, diamètre 26 mm, taille des pores 0,45 &mu ;m. Utilisé pour filtrer les échantillons d’extraits finaux.
BD  ; Seringues jetables sans aiguilles Luer-Lok	Fisher Scientific	14-823-2A	pour filtrer les échantillons d’extraits finaux. BD chat # 309604.
L’eau de Javel	Clorox		utilisée pour la dérochement des embryons à 50 % (vol/vol) dans l’eau, peut être achetée dans n’importe quel supermarché. Il est important d’utiliser la marque Clorox, car d’autres marques peuvent entraîner une déchorisation incomplète ou peuvent être toxiques pour les embryons.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	conteneurs grillagés pour collections d’embryons. 74 &mu ; M taille de maille, 6 puits.
Broyeurs de tissus Wheaton Dounce, capacité 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	homogénéisateur pour embryons, avec pilons lâches et serrés. Wheaton chat # 357544.