Pathogènes d’origine alimentaire préalable à l’aide de magnéto-fluorescent NANOCAPTEUR : Détection rapide d’e. Coli O157 : H7

Summary

L’objectif général du présent protocole est de synthétiser des nano-capteurs fonctionnels pour la portable, rentable, et une détection rapide des spécifiquement les bactéries pathogènes grâce à une combinaison de relaxation magnétique et modalités d’émission de fluorescence.

Abstract

Entérohémorragique Escherichia coli O157 : H7 a été liée à la fois d’origine hydrique et les maladies d’origine alimentaire et reste une menace malgré les méthodes de dépistage-nourriture et eau utilisée actuellement. Tandis que les méthodes de détection bactérienne conventionnels, tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) peuvent détecter spécifiquement pathogènes contaminants, dont ils ont besoin préparation approfondie et longues périodes d’attente. En outre, ces pratiques demandent des instruments de laboratoire sophistiqué et paramètres et doivent être exécutés par des professionnels qualifiés. Dans les présentes, un protocole est proposé pour une simple technique de diagnostic qui offre la combinaison unique des paramètres magnétiques et fluorescentes dans une plateforme à base de nanoparticules. Le projet multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) permet de détecter la contamination e. coli O157 : H7 avec aussi peu que 1 unité formant colonie présente en solution dans moins de 1 h. En outre, la capacité de MFnS à rester très fonctionnel dans les milieux complexes tels que le lait et l’eau du lac a été vérifiée. Tests de spécificité supplémentaires ont aussi servis à démontrer la capacité de MFnS pour détecter uniquement les bactéries cibles précis, même en présence d’espèces de bactéries semblables. L’appariement des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification de la contamination par des pathogènes dans un large éventail de concentrations, présentant ses performances élevées dans les deux détection de contamination et de tard-début. L’efficacité, l’abordabilité et portabilité de la MFnS rendent un candidat idéal pour le point-of-care dépistage contaminants bactériens dans un vaste éventail de contextes, de réservoirs aquatiques pour les aliments emballés dans le commerce.

Introduction

La présence persistante de la contamination bactérienne dans les deux produit commercialement des produits alimentaires et des sources d’eau a créé un besoin pour les plateformes de diagnostics toujours plus rapides et plus précis. ^{1 , 2} certains des contaminants bactériens plus communs responsables de la contamination des aliments et l’eau sont des genres Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus et Escherichia. ^{3 , 4} la contamination bactérienne de ces agents pathogènes souvent se traduit par des symptômes tels que diarrhée, gastro-entérite, fièvre et choléra. ⁴ contamination des sources d’eau souvent a des effets drastiques et indésirables sur les communautés n’ont pas accès à l’eau suffisamment filtrée, et la contamination des aliments a conduit à un grand nombre de maladies et les efforts de rappel de produits. ^{5 , 6}

Afin de réduire l’apparition de maladies dues à la contamination bactérienne, il y a eu un certain nombre d’efforts pour développer des méthodes par lequel l’eau et nourriture peuvent être efficacement scannés avant la vente ou la consommation. ³ techniques comme la PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,(¹² ) amplification isotherme boucle-négociée LAMPE),^13,14 parmi d’autres,^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} a récemment utilisé pour la détection de pathogènes différents. Par rapport aux traditionnels bactéries cultivant des méthodes, ces techniques sont beaucoup plus efficaces en ce qui concerne la spécificité et l’heure. Toutefois, ces techniques se battent encore avec les faux positifs et négatifs, des procédures complexes et le coût. ^{1 , 3 , 25} c’est pour cette raison que multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) sont proposés comme une méthode alternative pour la détection bactérienne.

Ces Nano-capteurs paire unique ensemble relaxation magnétique et modalités fluorescentes, ce qui permet pour une plate-forme de détection de double qui est rapide et précise. La capacité de MFnS de détecter aussi peu que 1 UFC dans les minutes à l’aide d’e. coli O157 : H7 comme un contaminant de l’échantillon, est démontrée. Anticorps spécifiques sont utilisés pour augmenter la spécificité, et la combinaison des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification des contaminants bactériens dans les deux gammes de basse et la haute-contamination. ¹⁶ dans le cas de contamination bactérienne, la nano-capteurs envahiront autour de la bactérie en raison de la capacité de ciblage des anticorps spécifiques. La liaison entre les bactéries et les nano-capteurs magnétiques limite l’interaction entre le noyau de fer magnétique et les protons de l’eau environnante. Cela entraîne une augmentation du temps de relaxation T2, telles qu’enregistrées par un relaxometer magnétique. Lorsque la concentration de bactéries en solution augmente, les nano-capteurs se dispersent avec la multiplication des bactéries, aboutissant à des valeurs plus faibles de T2. A l’inverse, émission de fluorescence augmentera proportionnellement à la concentration des bactéries, en raison de l’augmentation du nombre de nano-capteurs directement lié à l’agent pathogène. Centrifugation des échantillons et l’isolement de la pastille bactérienne, conservera uniquement les nanoparticules liés directement à la bactérie, supprimant toute nanodétecteurs flottant librement et directement corrélées avec le numéro de l’émission de fluorescence bactéries présentes dans la solution. Une représentation schématique de ce mécanisme est représentée dans la Figure 1.

Cette plate-forme MFnS a été conçue avec projection de point-of-care à l’esprit, ce qui entraîne des caractéristiques avantageuses et portables. MFnS sont stables à température ambiante et sont seulement tenus dans des concentrations très faibles pour la détection précise des contaminants bactériens. En outre, après synthèse, utilisation de la MFnS est simple et ne nécessite pas l’utilisation de professionnels formés dans le domaine. Enfin, cette plate-forme diagnostique permet un ciblage hautement personnalisable, fournissant un moyen par lequel cette une plate-forme unique peut être utilisée pour détecter des agents pathogènes de toutes sortes, dans de nombreux contextes différents.

Protocol

1. synthèse et fonctionnalisation de multi paramétrique magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS).

1. Synthèse de superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONPs)
   1. à préparer pour la synthèse IONP, préparer les 3 solutions suivantes : Solution 1 : FeCl ₃ 0,70 g et FeCl ₂ H ₂ O (2 mL), Solution 2 : NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) H ₂ O (15 mL) et 3 Solution : acide polyacrylique (0,855 g) H ₂ O (5 mL).
   2. Ajouter 90 µL de 2 M d’acide chlorhydrique (HCl) à la Solution 1 et puis mélanger immédiatement avec la Solution 2 tout en produisant des tourbillons à 875 tr/min. Ajouter ensuite la Solution 3. Continuer de vortex pour 60 min.
   3. Centrifuger pendant 20 min à 1 620 x g. Centrifuger le surnageant pendant 20 min à 2 880 x g.
   4. Purifier le surnageant final par l’intermédiaire de dialyse. Versez le surnageant dans un sac de dialyse (MWCO 6 − 8 K) et le placer dans un bécher contenant solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,4) et barre de spin. Laisser tremper pendant 12 h, remplaçant avec tampon frais chaque 2-3 h.
2. Conjugaison des anticorps spécifiques à la cible à la surface du IONPs
   1. préparer quatre solutions suivantes : Solution A: 5 mg de 1-éthyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide chlorhydrate (EDC) pour 250 µL MES [2-(N- mémoire tampon morpholino) ethanesulfonic acide] (0,1 M, pH = 6,8), Solution b : 3 mg de N-Hydroxysuccinimide (NHS) dans 250 µL de tampon de MES (0,1 M, pH = 6,8), Solution C: 5 µg de IgG1, le mAb e. coli, dans 225 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4) et Solution D: 4 mL d’IONP (5,0 mmol) dans 1 mL de PBS (pH 7,4).
   2. Ajouter 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acide (MES) tampon de Solution A, puis immédiatement ajouter Solution A pour Solution D par petits incréments dans les 15 s, inversant la solution après chaque ajout pour mélanger.
   3. Commencer immédiatement à ajouter Solution B à D de la Solution par petite quantité sur une période de trois minutes. Mix en inversant la solution après chaque ajout.
   4. Ajouter la Solution C de solution par incréments de 5 µL, inversant la solution après chaque ajout pour mélanger.
   5. Laisser la réaction continue pendant 3 h à température ambiante et ensuite poursuivre l’incubation à 4 ° C du jour au lendemain.
   6. Purifier les résultantes IONPs Ab-conjugués via la colonne magnétique à l’aide de PBS (pH = 7,4, final [Fe] = 3,5 mmol) pour éliminer les anticorps non conjuguées.
      1. Laver la colonne magnétique avec du PBS (1 mL). Fixer la colonne sur la plaque magnétique et ajouter la solution IONP.
      2. Laver la colonne magnétique avec du PBS (1 mL) à nouveau. Supprimer la colonne magnétique de plaque magnétique. Ajoute la colonne de PBS et recueillir la solution. Conserver à 4 ° C
3. Encapsulation fluorescent 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-colorant tétraméthylindocarbocyanine Perchlorate (DiI) dans le revêtement d’acide polyacrylique des IONPs anticorps conjugués à l’aide une méthode de diffusion solvant.
   1. 4 mL des IONPs, ajouter goutte à goutte 2.0 µL de colorant DiI (2 mmol) dans 100 µL de DMSO avec mélange continu à 1100 tr/min.
   2. Dialyser la solution résultante (MWCO 6-8 KDa, 12 h) contre PBS, création d’une solution finale de MFnS dont la concentration finale de fer [Fe] = 2 mmol.
4. Caractérisation des MFnS
   1. pour l’analyse spectrophotométrique, utiliser un lecteur de plaques pour détecter encapsulé DiI colorant avec émission de fluorescence à 595 nM.
   2. Diffusion dynamique de la lumière
      1. Place un échantillon de la solution MFnS dans un zetasizer pour déterminer la taille moyenne et la charge superficielle de la MFnS.
         Remarque : Ici, la taille moyenne et la charge de surface des MFnS fonctionnelle se sont révélés 77.09 nm et -22,3 mV, respectivement.

2. Bactériennes Culturing et préparation de la Solution Stock

1. de culture bactérienne
   1. hydrater une pastille lyophilisée (e. coli O157 : H7) dans 1 mL de bouillon et ajouter ensuite 5 mL de bouillon supplémentaire.
   2. Appliquer 100 µL de cette solution à une boîte de gélose et l’ensemencer à l’aide d’une anse à inoculation stérile, suivie d’une incubation à 37 ° C pendant 24 h.
   3. Après 24 h, sélectionner une colonie isolée dans la gélose et ajoutez-le à un 15 mL de bouillon de culture. Incuber à 37 ° C pendant 4 à 6 h, tout en surveillant la valeur de densité optique (absorbance à 600 nm).
   4. Après avoir obtenu une valeur de densité optique de 0.1, arrêter la mise en culture et effectuer des dilutions sériées.
2. Des dilutions
   1. Ajouter 900 µL de bouillon nutritif à huit microtubes stériles à.
   2. Ajouter 100 µL de la suspension bactérienne dans le premier tube (dilution 10 ^-1).
   3. Prendre 100 µL dans le premier tube et ajoutez-le à la seconde, pour obtenir une dilution de 10 ^-2. Poursuivre cette tendance pour les tubes restants, se terminant par une dilution finale de 10 ^-8.
   4. Transférer 100 µL de chaque tube pour séparer les boîtes de gélose et incuber pendant 24 h à 37 ° C.
   5. Le lendemain, compter la colonie formant des unités (UFC) sur chaque plaque. Sélectionnez la plaque avec ~ 100 UFC. Utiliser les dilutions correspondantes d’autres expériences (100 µL = ~ 100 UFC).
      Remarque : Ici, c’est la dilution de 10 ^-6 qui a donné lieu à le 100 ~ UFC.

3. Rapide détection d’e. coli O157 : H7 à l’aide de MFnS

1. Spike diverses solutions de PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) avec l’augmentation des quantités de stock bactérienne 10 ^-6, ayant pour résultat UFC varie de 1 à 100. Ajouter un montant régulier de MFnS (100 µL) à ces solutions.
2. Créer une solution de base qui contient seulement le PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) et MFnS (100 µL).
3. Incuber pendant 30 min à 37 ° C des solutions et puis laissez-les refroidir à température ambiante.
4. Transfert des solutions individuelles à le relaxometer magnétique (0,47 Tesla) et enregistrer les modifications dans les temps de relaxation (T2) par rapport à l’UFC dans chaque solution.
   1. Pour enregistrer les modifications dans les valeurs de T2, commencez par mesurer la valeur de T2 de la solution de référence contenant uniquement les PBS et MFnS. Relaxometer
      1. Place de la solution dans le magnétique. Ouvrez le logiciel respectif, sélectionnez le " relaxation T2 " réglage et appuyez sur " mesure. "
   2. suite à la collection de la ligne de base T2, mesurer les valeurs de T2 des solutions complémentaires qui ont été fortifiées avec divers les concentrations de bactéries.
      Remarque : Le changement de T2 est équivalent à la référence T2 soustraite de la T2 enrichis.
5. Retirer des échantillons provenant de le relaxometer magnétique et centrifuger les tubes à 2880 x g pendant 10 min.
6. Éliminer le surnageant et remettre en suspension bactériennes boulettes dans 100 µL de PBS (1 X, pH 7,4).
7. Ajouter 80 µL de chaque remise en suspension à une plaque à 96 puits et les intensités de fluorescence record à 595 nM.
   Remarque : Test peut être répété à l’aide de solvants différents, y compris l’eau du lac, de lait et d’autres, tel que décrit dans la section résultats

Results

Le mécanisme d’action MFnS est représenté dans la Figure 1. Le regroupement des MFnS autour de la surface des contaminants bactériens interfère avec les interactions entre les noyaux de la MFnS et les noyaux d’hydrogène environnant. À la suite de cette relaxation clustering, magnétique, les valeurs augmentent. Augmentation de la concentration de contaminants bactériens, clustering réduit, et le changement des valeurs de T2 diminue. Par conséquent, l’ajout d’une modalité fluorescente est cruc...

Discussion

Ce protocole a été conçu pour produire MFnS entièrement fonctionnel aussi simplement que possible. Cependant, il y a beaucoup de points clés au cours de laquelle l’altération du protocole peut être utile, selon l’objectif final de l’utilisateur. Par exemple, l’utilisation de différents anticorps permettrait de ciblage de nombreux autres agents pathogènes. En outre, ce protocole n’est pas limité à l’utilisation d’anticorps comme ciblant les molécules. N’importe quelle molécule qui a une af...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure ferreux tétrahydraté	Fisher Scientific	I90-500
Chlorure ferrique hexahydraté	Fisher Scientific	I88-500
Hydroxyde d’ammonium	Fisher Scientific	A669S-500
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144S-500
Acide polyacryllique	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anticorps anti-E. coli O111  ;	sera care	5310-0352
Anticorps anti-E. coli O157 :H7 [P3C6]  ;	Abcam	ab75244
DiI Stain	Fisher	Scientific D282
Bouillon nutritif	Difco	233000
E. coli lyophilisé O157 :H7 granule	ATCC	700728
Relaxomteter magnétique  ;	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Lecteur de plaques  ;	Tecan	Infinite M200 PRO
Colonne Magnétique  ;	QuadroMACS	130-090-976
Centrifugeuse	Eppendorf	5804 Series
Centrifuge (accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Floor Model Shaking Incubator	SHEL LAB	SSI5
Balance analytique	Metler Toledo	ME104E
Mélangeur Vortex Numérique	Fisher Scientific	02-215-370
Agitateur à bascule en plein air	Fisher Scientific	02-217-765