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Article de méthode

Production de produits chimiques par

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DOI :

10.3791/55828

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29 juin 2017

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1Lab of Biorefinery, Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Biorefinery Research Center, Jeonbuk Branch Institute, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), 4School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University

Dans cet article

Résumé

La poudre de bambou a été prétraitée avec NaOH et hydrolysée enzymatiquement. L'hydrolysat de bambou a été utilisé comme matière première pour l'acide 2,3-butanediol, l'acide R- acétole, l'acide 2-cétogluconique et l'acide xylonique par Klebsiella pneumoniae .

Résumé

Le bambou est une biomasse importante et l'hydrolysat de bambou est utilisé par Klebsiella pneumoniae comme matière première pour la production chimique. Ici, la poudre de bambou a été prétraitée avec du NaOH et lavée à un pH neutre. La cellulase a été ajoutée à la poudre de bambou prétraitée pour générer l'hydrolysat, qui contenait 30 g / L de glucose et 15 g / L de xylose et a été utilisé comme source de carbone pour préparer un milieu pour la production chimique. Lorsqu'il a été cultivé dans des conditions de microaérobie, 12,7 g / L de 2,3-butanediol a été produit par le type sauvage K. pneumoniae . Dans les conditions aérobies, 13,0 g / L de R- acetine a été produite par le mutant BudC de K. pneumoniae . Un mélange de 25,5 g / L d'acide 2-cétogluconique et 13,6 g / L d'acide xylonique a été produit par le mutant BudA de K. pneumoniae dans une fermentation à deux étapes et contrôlée par le pH avec une supplémentation en air élevée. Dans la première étape de fermentation, la culture a été maintenue à un pH neutre; Après la croissance cellulaire, la fermentatioN a procédé à la deuxième étape, au cours de laquelle la culture a été autorisée à devenir acide.

Introduction

Klebsiella pneumoniae est une bactérie qui pousse bien dans des conditions aérobies et anaérobies. K. pneumoniae est un important microorganisme industriel utilisé pour produire de nombreux produits chimiques. Le 1,3-propanediol est un produit chimique précieux qui est principalement utilisé comme monomère pour synthétiser le téréphtalate de polytriméthylène. Le téréphtalate de polytriméthylène est un polyester biodégradable qui présente de meilleures propriétés que celles du 1,2-propanediol, du butanediol ou de l'éthylène glycol 1 . Le 1,3-propanediol est produit par K. pneumoniae en utilisant du glycérol comme substrat dans des conditions à limitation d'oxygène 2 . Le 2,3-butanediol et ses dérivés ont des applications dans le domaine des plastiques, de la production de solvants et du caoutchouc synthétique et peuvent être utilisés comme biocarburant 3 . Avec le glucose comme substrat, le 2,3-butanediol est le principal métabolite de la souche 4 de type sauvage. Le 2,3-butanediol est synthesiséÀ partir du pyruvate. Tout d'abord, deux molécules de pyruvate se condensent pour donner de l'α-acétonactate; Cette réaction est catalysée par l'α-acétolactate synthase. L'α-acétonactate est ensuite converti en acétoïne par l'α-acétonactate décarboxylase. La R- acétone peut encore être réduite en 2,3-butanediol lorsqu'il est catalysé par la butanediol déshydrogénase. Une méthode efficace de remplacement des gènes appropriée pour K. pneumoniae a été explorée et de nombreux mutants ont été construits 5 , 6 , 7 . Un mutant BudC , qui a perdu son activité 2,3-butanediol déshydrogénase, accumule des niveaux élevés d'acétomin dans un bouillon de culture. L'acétone est utilisée comme additif pour améliorer la saveur des aliments 8 . Lorsque BudA , qui code pour l'α-acétonactate décarboxylase, est muté, l'acide 2-cétogluconique s'accumule dans le bouillon. L'acide 2-cétogluconique est utilisé pour la synthèse de l'acide érythorbique (acide isoascorbique), Un antioxydant utilisé dans l'industrie alimentaire 9 . L'acide 2-cétogluconique est un intermédiaire de la voie d'oxydation du glucose; Dans cette voie, située dans l'espace périplasmique, le glucose est oxydé à l'acide gluconique et ensuite oxydé à l'acide 2-cétogluconique. L'acide glucique et l'acide 2-kétogluconique produits dans le périplasme peuvent être transportés vers le cytoplasme pour un métabolisme supplémentaire. L'accumulation d'acide 2-kétogluconique dépend de conditions acides et une supplémentation en air plus élevée favorise la production d'acide 2-kétogluconique 10 . Gluconate déshydrogénase, codée par gad , Catalyse la conversion de l'acide gluconique en acide 2-cétolguconique. Le mutant gad de K. pneumoniae a produit des niveaux élevés d'acide gluconique à la place de l'acide 2-cétogluconique, et ce processus dépend également des conditions acides. L'acide glucique est un acide organique en vrac et est utilisé comme additif pour augmenter les propriétés du ciment 11. L'oxydation du glucose dans l'acide gluconique est catalysée par la glucose déshydrogénase. Le xylose est également un substrat approprié de glucose déshydrogénase. Lorsque le xylose est utilisé comme substrat, K. pneumoniae produit de l'acide xylonique 12 .

La production chimique utilisant de la biomasse comme matière première est un sujet brûlant dans la biotechnologie 13 . Les principaux composants de la biomasse sont la cellulose, l'hémicellulose et la lignine. Cependant, ces composés macromoléculaires ne peuvent pas être catabolisés directement par la plupart des microorganismes (y compris K. pneumoniae ). La cellulose et les hémicelluloses dans la biomasse doivent être hydrolysées au glucose et au xylose et peuvent ensuite être utilisées par des microorganismes. La présence de lignine dans les lignocelluloses crée une barrière protectrice qui empêche l'hydrolyse de la biomasse par des enzymes. Ainsi, un processus de prétraitement qui élimine la lignine et les hémicelluloses et réduit la cristallinité de la cellulose est toujours effectué lors de l'utilisation de la biomasse par le microLes roorganismes. De nombreuses méthodes de prétraitement ont été développées: les prétraites acides, alcalines, à l'ammoniac et à la vapeur sont courantes.

Le bambou est abondant dans les régions tropicales et subtropicales et constitue une ressource biomasse importante. Ici, la préparation de l'hydrolysat de bambou et la production chimique à l'aide d'hydrolysat de bambou sont présentés

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Protocole

1. Préparation de l'hydrolysat de bambou

  1. Ajouter 5 g de poudre de bambou à 40 ml d'une solution de NaOH pour obtenir une concentration finale de 10% (g / g) dans un ballon de 250 ml. Utilisez une série de solutions de NaOH allant de 0,05 M à 0,50 M par incréments de 0,05 M.
    1. Incuber le mélange pendant 60 minutes à 60 ° C ou 100 ° C dans un bain d'eau. Incuber à 121 ° C dans un autoclave.
  2. Après incubation, laisser le mélange reposer pendant 4 h à température ambiante. Ensuite, retirer le surnageant. Ajouter 100 ml d'eau douce et mélanger.
    1. Répétez ce lavage 5-6 fois, jusqu'à ce que le pH du surnageant atteigne 6,8. Utiliser le solide obtenu pour l'étape suivante d'hydrolyse enzymatique.
  3. Pour l'hydrolyse, ajuster 50 ml du mélange ci-dessus à pH 5,0 en utilisant 98% de H 2 SO 4 . Ensuite, ajouter 0,5 mL d'une activité de papier filtre 200 (FPU) / mL de cellulase.
    NOTE: Le rapport final de la cellulase au bambou shSoit 20 FPU pour 1 g de bambou.
  4. Incuber le mélange à 50 ° C pendant 36 h dans un agitateur.
    REMARQUE: Après l'hydrolyse, certains solides resteront dans le mélange.
  5. Obtenir un hydrolysat clair par centrifugation à 7 690 xg pendant 5 min.
  6. Quantifier le glucose, le xylose et d'autres produits chimiques avec un système de chromatographie liquide haute pression équipé d'un détecteur d'indice de réfraction et d'un détecteur de matrice de photodiode. Utiliser une colonne HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) et une phase mobile de solution 5 mM de H 2 SO 4 à un débit de 0,8 mL / min 12 .
  7. Pour un grand volume de préparation d'hydrolysat, mélanger 2 kg de poudre de bambou et 18 L de NaOH 0,25 M dans un réservoir en acier inoxydable de 30 L.
    1. Incuber le réservoir à 121 ° C dans un autoclave pendant 60 min. Après incubation, laver le mélange avec 40 L d'eau dans un réservoir en plastique de 60 L. Répétez ce lavage 5 fois.
    2. Utilisez de l'eau pour ajuster le bambou total lavé à un volume de 20 L.Ajuster le pH du mélange à 5,0 en utilisant 98% de H 2 SO 4 .
    3. Hydrolysez enzymatiquement le mélange dans un bain d'eau secoué modifié, équipé d'un agitateur mécanique pour s'assurer que le mélange est bien réparti. Ajouter 200 ml de cellulase 200 FPU / mL et incuber le mélange à 50 ° C pendant 36 h.
    4. Après hydrolyse, centrifuger le mélange à 4 700 xg pendant 10 min.

2. Production de 2,3-butanediol par Wildtype K. pneumoniae

  1. Utiliser 3 L d'hydrolysat de bambou comme solvant pour une préparation moyenne.
  2. Préparer un milieu de fermentation contenant une liqueur abrupte de maïs de 4 g / L, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 et 0,2 g / L de MgSO 4 . Ajuster le pH du milieu au neutre en utilisant du NaOH 2,5 M. Utilisez un bioréacteur de 5 L contenant 3 L de milieu de fermentation autoclavé pour la fermentation.
  3. Utiliser K. pneumoniaeCellules stockées dans un réfrigérateur à température basse de -80 ° C.
  4. Pour la culture des semences, incuber un flacon de 250 ml contenant 50 ml de milieu Luria-Bertani (LB) pendant une nuit à 37 ° C, en agitant à 200 tr / min. Utilisez un milieu LB contenant 10 g / L de tryptone, 5 g / L d'extrait de levure et 10 g / L de NaCl.
    NOTE: La densité cellulaire de la culture de graines doit atteindre OD 2 (densité optique à 600 nm).
  5. Inoculer un flacon de 50 ml de la culture de graines dans le bioréacteur. Maintenir la culture à pH 6,0 et 37 ° C. Utilisez un taux de supplémentation en air de 2 L / min et un taux d'agitation de 250 tr / min, ce qui crée un état microaérobie.
  6. Recueillir 5 mL d'échantillons toutes les 2 h pendant la fermentation et les analyser avec une Chromatographie liquide haute pression pour déterminer les concentrations chimiques dans le bouillon 4 .
    1. Surveillez l'alcali ajouté au bioréacteur en ligne en utilisant MFCS / DA.
      NOTE: Les acides organiques sont produits dans le processus de fermentation, unEt on ajoute du NaOH pour maintenir le pH de la culture stable. Le volume d'alcalin ajouté représente la quantité d'acide produite. Lorsque les plateaux de lignes alcalines, le processus est terminé, soit en raison de l'épuisement de la source de carbone, soit de la mort cellulaire.

3. Production de R- acétone par le mutant BudC de K. pneumoniae

  1. Préparer un milieu pour la production d'acétogène contenant une liqueur abrupte de maïs de 4 g / L, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / L d'acétate de sodium, 0,4 g / L de KCl et 0,1 g / L de MgSO 4 .
  2. Utilisez K. pneumoniae-ΔbudC pour la production de R- acétone. Répétez les étapes 2.4-2.5.
    NOTE: BudC code pour la 2,3-butanediol déshydrogénase. K. pneumoniae-ΔbudC perd l'activité 2,3-butanediol déshydrogénase et produit de la R- acétone au lieu du 2,3-butanediol.
  3. Maintenir la culture à pH 6,0 et 37 ° C. Utiliser un taux de supplémentation en air de 4 L / min et un agitatioN vitesse de 450 tr / min, condition aérobie.
    NOTE: La supplémentation en oxygène est supérieure à celle de la production de 2,3-butanediol.
  4. Analyser les échantillons comme à l'étape 2.6.

4. Production d'acide 2-Ketogluconique par le budA Mutant de K. pneumoniae

  1. Pour la production d'acide 2-kétogluconique, utilisez le même milieu que pour la production de R- acétone.
  2. Utiliser K. pneumoniae-ΔbudA pour la production d'acide 2- kétogluconique . Répétez les étapes 2.4-2.5.
    NOTE: BudA code pour l'α-acétonactate décarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA perd l'activité α-acetolactate décarboxylase et produit de l'acide 2-cétogluconique, en utilisant du glucose comme substrat.
    REMARQUE: la synthèse de l'acide 2-kétogluconique est un procédé conforme à la condition acide. Une fermentation en deux étapes a été développée pour la production d'acide 2-kétogluconique 10 ; Dans la première étape, la culture de graines est inoculée dans le bioréacteur.
  3. Maintenir la culture à pH 7,0 et 37 ° C. Utilisez un taux de supplémentation en air de 4 L / min et un taux d'agitation de 500 tr / min.
    REMARQUE: Dans ces conditions, les cellules augmentent très rapidement (la densité cellulaire atteint la DO 7 en environ 4 h). Ensuite, la fermentation progresse à la deuxième étape, au cours de laquelle le pH de la culture diminue à 5,0. Aucun acide n'est ajouté; Les acides organiques produits dans la culture conduisent naturellement à la diminution du pH. Dans ces conditions acides, la croissance cellulaire s'arrête, mais l'acide 2-cétogluconique est synthétisé et s'accumule dans le bouillon.
  4. Analyser les échantillons comme à l'étape 2.6. Utilisation de l'hydrolysat de bambou comme source de carbone.
    NOTE: Le glucose dans le milieu est converti en acide 2-kétogluconique et le xylose est converti en acide xylonique. Ainsi, on obtient un mélange d'acide 2-kétogluconique et d'acide xylonique.

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Résultats

Dans ce protocole, le bambou a été prétraité à l'aide d'un alcali. Les paramètres d'incubation optimaux - une température de 121 ° C et 0,25 M de NaOH - ont été déterminés sur les figures 1 et 2 . Le bambou prétraité a été hydrolyse enzymatiquement et les concentrations de glucose et de xylose obtenues dans l'hydrolysat ont été mesurées. Des températures plus élevées ont favorisé la production de sucre, donc 121 ° C a été choisi comme tem...

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Discussion

K. pneumoniae appartient au genre Klebsiella dans la famille des Enterobacteriaceae . K. pneumoniae est largement distribué dans des milieux naturels comme le sol, la végétation et l'eau 14 . La souche sauvage de K. pneumoniae utilisée dans cette recherche a été isolée du sol et utilisée pour la production de 1,3-propanediol 15 . K. pneumoniae et les mutants de cette espèce produisent de nombreux produits chimiques ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21576279, 20906076) et le KRIBB Research Initiative Program (KGM2211531).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
autoclaveSANYO3780
bioréacteurSartorius stedim biotechBostat Aplus
agitateurIKARW 20
agitateur à bain d’eauZhichengZWY-110X50
système de chromatographe liquide haute performanceShimadzu Corp20AVP
centrifugeuse HitachiCR22G III
Poudre de bambouachetée dans la province du Zhejiang, Chinenuméro de maille, 50
cellulaseYoutell Biochemical, Shandong, Chine200 PFU/mL

Références

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