Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

Résumé

Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.

Résumé

La taille énorme des familles mammifères odorant du récepteur (OR) présente des difficultés à trouver leurs ligands apparentés parmi de nombreux produits chimiques volatils. Pour efficacement et précisément deorphanize ORs, nous combinons l’utilisation d’une lignée de cellules hétérologues d’exprimer les mammifères ORs et un plasmide génétiquement modifié biocapteur permettant de mesurer la production d’AMPc en aval de l’activation d’OR en temps réel. Ce test peut être utilisé pour écran odorisants contre ORs et vice versa. Interactions positives odorant-récepteur à partir des écrans peuvent être confirmées par la suite en testant contre diverses concentrations d’odeurs, générant des courbes concentration-réponse. Ici, nous avons utilisé cette méthode pour effectuer un criblage à haut débit d’un composé odorant contre une bibliothèque OR humain exprimés dans les cellules Hana3A et a confirmé que le récepteur répond positivement est le récepteur apparenté du composé d’intérêt. Nous avons trouvé cette méthode de détection de haut débit pour être efficaces et fiables pour évaluer l’activation de l’OR et nos données fournissent un exemple de son utilisation possible dans les études fonctionnelles d’OR.

Introduction

Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate^1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respe....

Protocole

1. Culturing et Maintenance des cellules Hana3A

1. cellules de maintenir dans 10 mL de milieu essentiel minimum (MEM) avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 100 µg/mL la pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL amphotéricine B dans un 100 mm boîte de Petri de cellules dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C avec 5 % de CO ₂. Avec chaque autre passage, ajouter 1 puromycine µg/mL pour maintenir la transfection stable des plasmides (voir Introduction).
   Remarque : Effectuez toutes les étapes de culture cellulaire dans une classe II hotte biologique de sécurité afin d’assurer un environnement stérile.
2. Sous-culture ....

Résultats

Muscone est le principal composant aromatique du musc naturel. Récentes études OR5AN1 identifié comme un récepteur humain pour muscone et autres composés de musc macrocycliques issus d’homologie avec la souris ou, MOR215-1, clonée à partir des glomérules muscone réagissant en comportement souris^37,38. En sélectionnant le répertoire OR humain, notre groupe et le groupe Touhara également identifié OR5AN1 comme un récepteur majeur po.......

Discussion

Mesurer avec exactitude l’activation de l’OR après une exposition à une certaine substance odorante est la première étape en déchiffrant le codage de l’information olfactive. Les expériences montré dans cet étude représentent qu'un exemple de la façon dont on peut identifier, en utilisant un in vitro système d’expression OR, ORs sensibles parmi le répertoire OR humain pour la substance odorante d’intérêt et ensuite caractériser les récepteurs pharmacologie à l’aide de différentes concentrations du produit chimiq.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amphotéricine B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
Réactif GloSensor cAMP	Promega	E1290
pGloSensor-20F plasmide	cAMP Promega	E1171
Hana3A cellules			disponibles auprès des auteurs sur demande
HBSS, sans calcium ni magnésium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
Plasmide			cloné dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI
MEM, avec EBSS et L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musc tibétain	Sigma-Aldrich	S359165
Plasmides			clonés avec un Rho-tag dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI
PBS, sans calcium ni magnésium	Cellgro	21-040-CV
Pénicilline-streptomycine	Hyclone	SV30010
Plasmide miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Plasmide
RTP1S	cloné dans un vecteur d’expression de mammifère tel que pCI
	BD Falcon	352096
pipeteur multicanaux à 8 puits et/ou 12 puits	Eppendorf
		655098
100 mm x 20 mm Antenne parabolique	BD Falcon	353003
Enceinte de sécurité biologique de classe II à flux
laminaireIncubateur de culture cellulaire, avec 5 % de CO2
centrifugeuse, avec rotor à godets oscillants pour tubes
Lecteur de plaques Infinite F200	Microscope à
avec objectifs
Spectrophotomètre
Réservoirs de réactifs stériles pour la distribution
Essuie-tout

M3R OR Puromycin Sigma P8833 Trypsine-EDTA Hyclone SH30236 tube PCR de 0,2 mL Axygen PCR-02-C Tube Eppendorf de 1,5 mL Eppendorf 15 mL Tube conique de 17 mm x 120 mm Plaque de culture de cellules blanches à fond plat à 96 puits Greiner coniques de 15 ml contraste de phase Tecan x10 et x20multicanaux stérile