Article de méthode

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

DOI :

10.3791/55836

⸱

3 juin 2017

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cartographie à l'échelle du génome des interactions protéine-ADN est essentielle pour la compréhension de la régulation des gènes, du remodelage de la chromatine et d'autres processus résistant aux chromatines. La réticulation par formaldehyde suivie de l'immunoprécipitation de la chromatine et du séquençage à haut débit (X-ChIP-seq) a été utilisée pour obtenir de nombreuses informations précieuses sur la biologie du génome. Cependant, X-ChIP-seq a des limitations remarquables liées à la réticulation et à la sonication. Le ChIP indigène évite ces inconvénients en omettant la réticulation, mais entraîne souvent une mauvaise récupération des protéines liées à la chromatine. En outre, toutes les méthodes basées sur le ChIP sont soumises à des considérations de qualité d'anticorps. Les méthodes enzymatiques pour cartographier les interactions protéine-ADN, qui impliquent la fusion d'une protéine d'intérêt pour une enzyme modifiant l'ADN, ont également été utilisées pour cartographier les interactions protéine-ADN. Nous avons récemment combiné une telle méthode, le clivage endogène de la chromatine (ChEC), avec un séquençage à haut débit comme ChEC-seq. ChEC-seq repose sur la fusion d'une chromatine-assocUne protéine d'intérêt intéressant pour la nuclease micrococcique (MNase) génère un clivage d'ADN ciblé en présence de calcium dans les cellules vivantes. Le ChEC-seq n'est pas basé sur l'immunoprécipitation et contourne ainsi les préoccupations potentielles liées à la réticulation, à la sonication, à la solubilisation de la chromatine et à la qualité des anticorps tout en fournissant une cartographie haute résolution avec un signal de fond minimal. Nous envisageons que ChEC-seq sera une contrepartie puissante de ChIP, fournissant un moyen indépendant permettant de valider les résultats de ChIP-seq et de découvrir de nouvelles idées sur la régulation génomique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), des remodelateurs de la chromatine et d'autres facteurs réglementaires associés à la chromatine est essentielle pour comprendre tous les processus basés sur la chromatine. Bien que les approches d'immunoprécipitation à la chromatine et de séquençage à haut débit (ChIP-seq) aient été utilisées pour obtenir de nombreuses connaissances importantes sur la biologie du génome, elles ont des limitations notables. Nous avons récemment introduit une méthode alternative, appelée clivage endogène de la chromatine et séquençage à haut débit (ChEC-seq) 1 , pour contourner ces inconvénients.

ChIP-seq est le plus souvent réalisé avec une étape initiale de réticulation de formaldéhyde (X-ChIP-seq) pour préserver les interactions protéine-ADN. Cependant, un certain nombre d'études récentes ont indiqué que X-ChIP-seq capture des interactions protéines-ADN transitoires ou non spécifiques 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , donnant lieu à des sites de liaison faussement positifs. En outre, la sonication, couramment utilisée pour fragmenter la chromatine dans les expériences X-ChIP-seq, cisaille préférentiellement les régions de la chromatine ouverte, ce qui conduit à une récupération partielle des fragments de ces régions 9 , 10 . La sonication produit également un mélange hétérogène de longueurs de fragments, limitant finalement la résolution du site de liaison, bien que l'ajout d'une étape de digestion par une exonucléase puisse grandement améliorer la résolution 11 , 12 . Les méthodes ChIP indigènes telles que les régions occupées des génomes provenant de la chromatine naturellement isolée purifiée par affinité (ORGANIQUE) 13 n'utilisent pas de réticulation et de fragmentation de la chromatine avec la nucléase micrococcie (MNase), en atténuant les biais potentiels associés à la réticulation au formaldéhyde et à la sonication. cependant,La solubilité de nombreuses protéines liées à la chromatine dans les conditions relativement douces requises pour l'extraction de la chromatine native est médiocre, entraînant potentiellement une réduction de la dynamique et / ou des faux négatifs 14 .

Alors que diverses itérations de ChIP-seq sont le plus couramment utilisées pour la cartographie génomique des interactions protéine-ADN, plusieurs techniques de cartographie basées sur la fusion de protéines d'intérêt pour diverses enzymes modifiant l'ADN ont également été mises en œuvre. Une telle approche est l'identification par l'ADN adénine méthyltransférase (DamID) 15 , dans laquelle une protéine de liaison à la chromatine est génétiquement fusionnée à Barrage et cette fusion est exprimée dans des cellules ou des animaux, entraînant une méthylation de séquences de GATC proches des sites de liaison de la protéine. DamID est avantageux en ce qu'il ne repose pas sur l'immunoprécipitation et évite ainsi la réticulation, les anticorps ou la solubilisation de la chromatine. Il est également réalisé in vivo . toutefois, La résolution de DamID est limitée à l'échelle de kilobase et l'activité de méthylation de la protéine de fusion du barrage est constitutive. Une deuxième méthode basée sur la fusion enzymatique est Calling Card-seq 16 , qui utilise une fusion d'un facteur d'intérêt pour une transposase, en dirigeant l'intégration spécifique au site des transposons. Comme DamID, Calling Card-seq n'est pas basé sur l'immunoprécipitation et a donc des avantages similaires, avec l'avantage supplémentaire d'une résolution accrue. Toutefois, Calling Card-seq peut être limité par des biais de séquences de transposases et dépend également de la présence de sites de restriction proches des sites d'insertion de transposon.

Une troisième méthode de fusion enzymatique, développée dans le laboratoire de Laemmli, est le clivage endogène de la chromatine (ChEC) 17 . Dans ChEC, une fusion entre une protéine associée à la chromatine et la MNase est exprimée dans les cellules et, après l'addition de calcium pour activer la MNase, l'ADN est clivé proximal aux sites de liaison pour les étiquetésFacteur ( figure 1 ). En conjonction avec Southern Blot, ChEC a été utilisé pour caractériser la structure de la chromatine et la liaison des protéines à un certain nombre de loci individuels dans la levure 17 , 18 et a été combiné avec une analyse de microarrays à basse résolution pour sonder l'interaction des composants des pores nucléaires avec la levure Génome 19 . ChEC offre des avantages similaires à DamID et Calling Card-seq, et sa résolution est presque une paire de base unique lorsqu'elle est analysée par l'extension d'amorçage 19 . ChEC est également contrôlable: le clivage d'ADN robuste par MNase dépend de l'ajout de calcium millimolaire, ce qui garantit que la MNase est inactive aux faibles concentrations de calcium libres observées dans les cellules vivantes 20 .

Auparavant, nous avons postulé que la combinaison de ChEC avec le séquençage à haut débit (ChEC-seq) fournirait des cartes haute résolution des sites de liaison TF. En effet, ChEC-seq a généré des cartes haute résolution des facteurs de régulation généraux de la levure bourgeonnaire (GRF) Abf1, Rap1 et Reb1 à travers le génome 1 . Nous avons également appliqué avec succès ChEC-seq au complexe Mediator modulaire, un conservateur, un coactivateur de transcription global essentiel 21 , élargissant l'applicabilité de ChEC-seq aux complexes de taille megadalton qui ne contactent pas directement l'ADN et peuvent être difficiles à cartographier par ChIP- Méthodes basées. ChEC-seq est une méthode puissante à la fois pour la validation indépendante des résultats de ChIP-seq et la génération de nouvelles connaissances sur la régulation des processus résistant aux chromatines. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour la mise en œuvre de cette méthode dans la levure bourgeonnante.

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Protocole

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1. Génération de souches de levure

  1. Générer une souche de levure portant le facteur d'intérêt marqué avec MNase.
    1. La PCR amplifie la cassette de marquage MNase du vecteur souhaité ( Tableau 1 ) en utilisant le mélange réactionnel spécifié ( Tableau 2 ) et les conditions cycliques ( Tableau 3 ). Mélanger 5 μL de la réaction de PCR et 1 μL de colorant de chargement d'ADN 6X. Exécutez chaque portion aliquote de PCR sur un gel d'agarose à 0,8% à 120 V pendant 40 minutes. La taille de produit attendue est de ~ 2,3 kb.
    2. Transformer la cassette de marquage amplifiée en la souche de choix en utilisant une transformation standard en acétate de lithium 22 et effectuer une sélection.
    3. Vérifiez l'intégration correcte de la cassette de marquage avec la PCR des colonies.
      1. Préparer le mélange réactionnel spécifié ( Tableau 4 ) pour le nombre de colonies à tester. Continuez à glisser jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
      2. Choisissez une partie de chaque colonie pour être tesAu bout d'un tube PCR en utilisant un cure-dent stérile ou une pipette.
      3. Micro-ondes aux colonies sélectionnées à haute puissance pendant 1 minute.
      4. Ajouter 50 μL de mélange PCR ( Tableau 4 ) à chaque colonie à micro-ondes et faire pipeter vers le haut et vers le bas pour mélanger. Effectuer la PCR en utilisant les conditions de cyclage spécifiées ( Tableau 5 ).
      5. Mélanger les 50 μL de réaction de PCR et 10 μL de colorant de chargement d'ADN 6X directement dans chaque tube de PCR. Exécuter 10 μL de chaque échantillon sur un gel d'agarose à 1% à 120 V pendant 40 min. La taille prévue du produit est de ~ 700 pb.
        NOTE: Si vous le souhaitez, vérifiez l'expression appropriée de la protéine de fusion MNase par Western Blot. On s'attend à un changement de ~ 20,6 kilodalton dans le poids moléculaire de la protéine marquée.
  2. Générer une souche MNase gratuite par clonage homologique du promoteur du gène d'intérêt dans pGZ136 (Tableau 1) et transformation et sélection comme dans l'étape 1.1.2.
    1. AlternatiEn particulier, assembler le promoteur du gène d'intérêt et 3xFLAG-MNase-SV40 NLS dans un vecteur plasmidique, transformer et sélectionner comme dans l'étape 1.1.2 et faire pousser la souche dans l'état sélectif approprié pour la maintenance du plasmide.

2. ChEC

  1. Dans l'après-midi / soir du jour précédant l'expérience ChEC, inoculer 3 mL de levure-peptone-dextrose (YPD) ou milieu sélectif approprié avec une seule colonie de la souche portant le facteur marqué MNase. Incuber cette culture tout au long de la nuit (180 tr / min de secousse, 30 ° C).
  2. Dans la matinée du jour de l'expérience ChEC, diluer la culture de nuit dans 50 ml de densité moyenne à 600 nm (OD 600 ) de 0,2 à 0,3. Incuber cette culture (180 tr / min secouillant, 30 ° C) jusqu'à ce qu'elle atteigne une DO 600 de 0.5-0.7. Au fur et à mesure que la culture s'approche de la DO 600 appropriée, régler le bloc de chaleur ou le bain d'eau à 30 ° C et commencer à décongeler les additifs Buffer A ( TaBle 6).
  3. Préparer 5 mL d'additifs Buffer A plus ( Tableau 6 ) par culture. Conserver le tampon A à la RT pendant la procédure.
  4. Préparez des tubes à microcentrifuges contenant 90 μl de solution d'arrêt ( Tableau 7 ) et 10 μL de SDS à 10% pour chaque point horaire à collecter. Pour chaque nouveau facteur analysé, prenez des échantillons à 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min et 10 min.
  5. Décanter la culture dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à 1 500 xg et la température ambiante (RT) pendant 1 min.
  6. Remplacer complètement les cellules dans 1 mL de tampon A et transférer les cellules remises en suspension dans un tube à microcentrifugation. Pellets remis en suspension dans une microcentrifugeuse à 1 500 xg et RT pendant 30 s.
  7. Aspirer le surnageant et ré-endiguer complètement les cellules dans 1 mL de tampon A en pipetant vers le haut et vers le bas. Pellets remis en suspension dans une microcentrifugeuse à 1 500 xg et RT pendant 30 s. Répétez cette étape une fois.
  8. Remplacer complètement les cellules dans 570 μl de tampon A. Ajouter 30 μL de 2% de digitonine(0,1% de concentration finale) pour faciliter la perméabilisation des cellules, et inverser à mélanger.
  9. Perméabiliser les cellules dans un bloc de chaleur ou un bain d'eau à 30 ° C pendant 5 min.
  10. Pipeter la réaction vers le haut et vers le bas pour assurer une répartition uniforme des cellules. Enlevez une aliquote de 100 μL de cellules perméabilisées en tant que témoin négatif sur un tube à microcentre contenant une solution d'arrêt et un SDS (étape 2.4) et vortex brièvement pour mélanger.
  11. Ajouter 1,1 μl de CaCl 2 1 (concentration finale 2 mM) aux cellules perméabilisées pour activer MNase et inverser plusieurs fois rapidement ou vortex brièvement pour mélanger. Réintroduire immédiatement la réaction mixte à 30 ° C et démarrer une minuterie.
  12. À chaque fois que l'on doit recueillir, faire pipeter la réaction vers le haut et vers le bas pour assurer une répartition uniforme des cellules, puis enlever une aliquote de 100 μL de cellules perméabilisées à un tube de microcentrure contenant une solution d'arrêt et un SDS et un vortex brièvement pour mélanger. Pour chaque nouveau facteur analysé, prendre 0 s (pas de CaCl 2 ajouté), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min et 10 min points de temps.
    NOTE: Les expériences de ChEC avec des facteurs qui coupent rapidement l'ADN à 30 ° C peuvent être effectuées à des températures plus basses pour ralentir la cinétique de clivage de MNase.
  13. Une fois que tous les points de temps ont été recueillis, ajouter 4 μL de 20 mg / mL de protéinase K à chaque échantillon, vortex brièvement pour mélanger et incuber à 55 ° C pendant 30 minutes.
  14. Ajouter 200 μL de 25: 24: 1 phénol: chloroforme: alcool isoamylique à chaque échantillon, vortex vigoureusement à mélanger et centrifuger à vitesse maximale et RT dans une microcentrifugeuse pendant 5 min.
  15. Retirez chaque phase aqueuse (~ 150 μL) d'un nouveau tube. Ajouter 30 μg de glycogène et 500 μL d'éthanol à 100%. Vortex vigoureusement pour mélanger et précipiter sur de la glace sèche pendant 10 minutes ou jusqu'à ce que la solution soit visqueuse.
  16. Pellet a précipité l'ADN à la vitesse maximale et 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 10 min.
  17. Décanter les surnageants et les pastilles de lavage avec 1 ml de RT à 70% d'éthanol.
  18. Décanter l'éthanol, retirer le reste en inversant unD en tapant doucement les tubes sur une serviette en papier. Essuyez brièvement les échantillons à l'aide d'une centrifugeuse de table et utilisez une pipette pour éliminer l'éthanol résiduel, en prenant soin de ne pas gêner la pastille. Granulés secs à l'air à la RT pendant 5 min.
  19. Alors que les granulés sont en train de sécher, faire un mélange maître pour ré-endommager les pastilles séchées dans 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL chacun. Digest ARN à 37 ° C pendant 20 min.
  20. Mélanger 1 μL de colorant de chargement d'ADN 6X avec 5 μL de chaque échantillon et exécuter sur un gel d'agarose à 1,5% à 120 V pendant 40 min.

3. Sélection des tailles

NOTE: L'objectif de la sélection de taille est d'éliminer les fragments multi-kilobase d'ADN génomique de l'échantillon à séquencer et d'enrichir des fragments de ~ 150 pb (approximativement la taille de l'ADN nucléosomique) ou plus petits. Dans les données séquentielles, des fragments <400 pb sont enrichis, avec un pic notable autour de la taille de l'ADN nucléosomique (~ 150 pb) et une répartition maximale ou large des fragments subnucléosomaux.

  1. À chaque échantillon, ajouter 75 μL de perles d'immobilisation réversible en phase solide (SPRI) dans une solution de polyéthylène glycol (PEG) 23 et faire pipeter jusqu'à 10 fois pour mélanger. Incuber le cordon: mélange d'ADN à la température ambiante pendant 5 min.
  2. Au cours de l'incubation du talon SPRI, préparer des tubes à microcentrifuges contenant 96 μL de Tris 10 mM, pH 8,0 et 4 μL de NaCl 5 M pour chaque échantillon.
  3. Placer les tubes dans une grille magnétique pour recueillir des perles sur le côté du tube. Permettre aux perles de se coller sur le côté du tube pendant 2 min.
  4. Transférer chaque surnageant dans un nouveau tube contenant Tris et NaCl (étape 3.2).
  5. Ajouter 200 μL de phénol 25: 24: 1: chloroforme: alcool isoamylique à chaque échantillon, vortex pour mélanger et centrifuger à vitesse maximale et RT dans une microcentrifugeuse pendant 5 min.
  6. Retirez chaque phase aqueuse d'un nouveau tube. Ajouter 30 μg de glycogène et 500 μL d'éthanol à 100%. Précipiter l'ADN sur de la glace sèche pendant 10 min ou jusqu'à ce que la solution soit visqueuse.
  7. Pellet preciADN cokéfié à vitesse maximale et 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 10 min.
  8. Décanter les surnageants et les pastilles de lavage avec 1 ml d'éthanol à 70%.
  9. Décanter l'éthanol, retirer le reste en inversant et en tapotant doucement les tubes sur une serviette en papier. Essuyez brièvement les échantillons à l'aide d'une centrifugeuse de table et utilisez une pipette pour éliminer l'éthanol résiduel, en prenant soin de ne pas gêner la pastille. Granulés secs à l'air à la RT pendant 5 min.
  10. Remplacer à nouveau les pastilles séchées dans 25 μL de Tris, pH 8.0. Déterminer la concentration de l'échantillon en utilisant un dosage à haute sensibilité. Pour les expériences TF ChEC, 10-100 ng d'ADN est régulièrement récupéré après la sélection de la taille.
  11. Préparez les bibliothèques de séquençage. Les protocoles de préparation de la bibliothèque qui ne dépendent pas de la sélection de la taille, comme décrit précédemment 24 , sont souhaitables pour permettre le séquençage d'une large gamme de tailles de fragments (25-500 pb).
  12. Bibliothèques de séquence en mode apparié. Un minimum de 25 bases de séquence à chaque extrémité est nécessaire pour une lecture de haute qualitéCartographie. Entre 1 et 2 millions de lectures offrent une couverture suffisante pour un échantillon ChEC.
    NOTE: L'analyse des données ChEC-seq est une procédure complexe et dépasse la portée de cet article. Des informations détaillées sur l'analyse des données se trouvent dans les publications précédentes 1 , 21 , et les scripts personnalisés utilisés pour l'analyse sont disponibles sur GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) peut également être utilisé pour l'analyse de ligne de commande des données ChEC-seq.

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Résultats

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Dans le cas d'une expérience réussie de ChEC, l'analyse de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose révélera une augmentation de la fragmentation de l'ADN par rapport au calcium, comme l'indiquent les frottis et la digestion éventuelle complète de l'ADN génomique. Dans certains cas, une échelle de bandes similaire à celle observée avec une digestion MNase traditionnelle est observée après une digestion prolongée. C'est le cas pour l'analyse ChEC de Reb1, un facteur de régulation généra...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons montré que ChEC peut cartographier diverses classes de protéines de levure sur la chromatine et anticiper qu'il sera largement applicable à différentes familles de TF et d'autres facteurs de liaison à la chromatine dans la levure. ChEC-seq est avantageux en ce qu'il ne nécessite pas de réticulation, de solubilisation de la chromatine ou d'anticorps. Ainsi, ChEC évite les artefacts potentiellement présents dans X-ChIP-seq, tels que l'artefact hyper-ChIPable 3 ,<...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Nous remercions Moustafa Saleh et Jay Tourigny pour la lecture critique du manuscrit et Steven Hahn et Steven Henikoff pour le mentorat et le soutien lors du développement de ChEC-seq et son application au complexe Mediator. SG est soutenu par les subventions du NIH R01GM053451 et R01GM075114 et GEZ est soutenu par les fonds de démarrage de l'Université d'Indiana.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
dNTPNEBN0447
Q5 ADN polymérase haute fidélitéNEBM0491LD’autres ADN polymérases haute fidélité, telles que Phusion, peuvent être utilisées pour l’amplification sur cassette.
TrackIt 1 Kb Plus Échelle d’ADNThermoFisher Scientific10488085
Taq ADN polyméraseNEBM0273L
cOmplete Mini cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTASigma-Aldrich11836170001Il est important d’utiliser un mélange d’inhibiteurs de protéase sans EDTA, afin de ne pas inhiber le clivage de la MNase par chélation de Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, haute puretéEMD Millipore300410-250MGProduire un stock de 2 % en dissolvant 20 mg de digitonine dans 1 mL de DMSO avec un vortex vigoureux.
Protéinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP billesBeckman CoulterA63880Les billes de type ampure peuvent être générées à l’aide d’un protocole publié (ref 24).
Rack magnétique MagneSpherePromegaZ5342

Références

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