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Une méthode d’isolement roman de Grade clinique pour les cellules stromales de rein humain périvasculaires

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DOI :

10.3791/55841

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7 août 2017

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1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode d’isolation et de la culture de roman de grade clinique pour rein périvasculaires des cellules stromales (kPSCs) basé sur la perfusion des organes entiers avec des enzymes digestives et enrichissement NG2-cellule. Avec cette méthode, il est possible d’acquérir le nombre de cellules suffisant pour la thérapie cellulaire.

Résumé

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont homéostatiques et immunitaire modulateurs cellules des tissus qui ont montré des effets bénéfiques dans les maladies des reins et de la transplantation. Cellules stromales périvasculaires (PSC) partagent des caractéristiques avec la moelle osseuse MSCs (bmMSCs). Cependant, ils possèdent également, probablement en raison de l’empreinte locale, les propriétés spécifiques des tissus et jouent un rôle dans l’homéostasie tissulaire locale. Cette spécificité tissulaire peut entraîner réparation spécifique des tissus, également dans le rein humain. Nous avons montré précédemment que rein humain PSC (kPSCs) ont amélioré rénales épithéliales de cicatrisation tandis que bmMSCs n’avait pas ce potentiel. De plus, kPSCs peut améliorer de lésion rénale in vivo. Par conséquent, les kPSCs constituent une source intéressante pour la thérapie cellulaire, en particulier pour les maladies des reins et de la transplantation rénale. Ici, nous montrons aux méthodes d’isolement et de la culture pour kPSCs de transplantation-grade des reins humains basés sur la perfusion ensemble-orgue d’enzymes digestives via l’artère rénale et un enrichissement pour le marqueur périvasculaires NG2. De cette façon, les quantités de grandes cellules peuvent être obtenues qui conviennent à la thérapie cellulaire.

Introduction

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules modulateurs immunitaires qui ont été initialement isolées de la moelle osseuse. Ils sont caractérisés par leur morphologie, capacité à se différencier en gras, des os et du cartilage et adhérence plastique fusiforme. MSCs expriment les marqueurs stromales CD73, CD90, CD105 tout en étant négatif pour les marqueurs CD31 et CD451,2,3. MSCs sont un candidat prometteur pour la thérapie cellulaire en raison de leurs tissus homéostatique et immunomodulatrices. bmMSCs sont actuellement à l’étude dans des essais cliniques pour plusieurs maladies, dont les maladies des reins et une transplantation rénale comme revu ailleurs4.

Antérieurement, il a été montré que périvasculaires des cellules de plusieurs différents organes solides, y compris le tissu adipeux, placenta et le muscle squelettique partagent des caractéristiques avec MSCs9. Cependant, ces cellules présentent également des fonctions spécifiques des tissus qui peuvent se traduire par organotypique réparation10. Les cellules humaines périvasculaires myocardique, par exemple, stimulent angiogénique réponses après l’hypoxie et se différencient en cardiomyocytes, tandis que les cellules périvasculaires isolées des autres tissus n’ont pas montré de ces potentiels11.

Cellules stromales périvasculaires peuvent également être isolées des souris12,,du13,14 et15,de rein humain16. Abondamment, nous avons caractérisé kPSCs et par rapport aux bmMSCs. Nous avons constaté que kPSCs, similaires à bmMSCs, ont des capacités immunosuppresseurs peut prendre en charge la formation du plexus vasculaire. Cependant, il sont a des tissus des différences spécifiques entre les types de cellules, comme kPSCs a montré une signature d’expression transcriptionnelle organotypique, y compris les facteurs de transcription néphrogénique HoxD10 et HoxD11. kPSCs, contrairement à bmMSCs, n’a pas subi de transformation des myofibroblastes après stimulation par TGF-β et ont été incapables de se différencier en adipocytes. En outre, kPSCs accéléré intégrité épithéliale dans un essai gratter plaie épithéliales tubulaires du rein, un phénomène qui n’a été observé avec bmMSCs. Cette plaie renforcée réparation a été véhiculée par le communiqué de facteur de croissance des hépatocytes. En outre, kPSCs amélioré des lésions rénales dans un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë lésion15. Par conséquent, les kPSCs semblent avoir des capacités de réparation rénale supérieure et sont une source intéressante de nouveau pour la thérapie cellulaire dans les maladies des reins.

Pour pouvoir utiliser kPSCs à des fins de thérapie cellulaire, kPSCs devraient être isolés d’une manière de grade clinique avec les enzymes de grade clinique et protocoles. En outre, pour être en mesure de traiter plusieurs patients avec kPSCs du 1 donneur, nombre de cellules suffisant devrait être obtenu. Nous montrons ici en détail, la technique d’isolation de grade clinique de kPSCs de reins de toute transplantation de grade, ce qui donne un nombre suffisant de cellules à utiliser pour la thérapie cellulaire clinique.

Protocole

Le comité local d’éthique médicale et le conseil consultatif éthique du consortium européen (STELLAR) ont approuvé la recherche et la collecte de reins de qualité transplantation humaine mis au rebut principalement pour des raisons chirurgicales. Le consentement à la recherche a été donné pour tous les reins.

1. Préparations pour la culture cellulaire

  1. Préparez un pool de lysats plaquettaires.
    1. Conservez les plaquettes périmées pendant moins de 2 jours à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées (pendant 1 an maximum).
      REMARQUE : Les plaquettes provenaient à l’origine d’un vendeur commercial. Le surplus de matériel hospitalier distribué par la banque de sang locale a été obtenu.
    2. Décongeler les plaquettes d’au moins 5 donneurs (de préférence 10) O/N à 4 °C.
    3. Regrouper les plaquettes dans un grand flacon stérile, les transférer dans des tubes à centrifuger coniques et les faire tourner pendant 10 min à 1 960 x g à 4 °C
      REMARQUE : Le volume de plaquettes dépend du nombre de donneurs et de la quantité de matériel hospitalier excédentaire par donneur.
    4. Pipeter le surnageant dans les poches de sang (50 mL/sac) à travers le canon d’une seringue de 50 mL. Conserver à -80 °C.
  2. Préparation du milieu de culture cellulaire.
    1. Décongelez un sachet de lysats plaquettaires dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Ajouter 1 L (c.-à-d. 2 bouteilles) de Milieu Essentiel Minimum - modification alpha (alphaMEM), 5 mL de 200 mM de glutamine et 20 mL de pénicilline (5 000 U/mL)/streptomycine (5 000 μg/mL) (stylo/streptocoque) dans le sac.
    3. Incuber pendant 3 h à 37 °C.
    4. Secouez le sac pour le dégelage en tapotant doucement sur le sac lorsque le sac repose sur une surface plane.
    5. Filtrez le milieu des lysats plaquettaires à 5 % en tirant les lysats à travers le filtre du système de transfusion à l’aide d’une seringue stérile de 50 ml.
    6. Aliquote le milieu dans des tubes de 50 mL et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Chaque nouveau lot de lysats plaquettaires est testé en culture cellulaire et comparé au lot précédent par des cellules d’intérêt en croissance (bmMSC ou kPSC) jusqu’à la confluence dans les deux lots. En ce qui concerne le nombre de cellules et la viabilité, les kPSC ou les bmMC cultivés dans le nouveau lot ne doivent pas différer de plus de 10 %, et l’expression des marqueurs CD73, CD90, CD105 et CD31, CD34 et CD45 analysée par cytométrie en flux ne doit pas différer. Les méthodes de culture cellulaire sont décrites au point 6 du protocole (Culture de kPSC).

2. Préparations pour la récolte cellulaire

  1. Préparation des solutions.
    1. Préparez le milieu nature en ajoutant 10 ml de stylo/streptocoque à 500 ml (1 bouteille) de milieu essentiel minimum (DMEM)-F12 de Dulbecco.
    2. Préparez le produit de lavage en ajoutant 50 ml de sérum humain normal (NHS) et 10 ml de stylo/streptocoque à 1 bouteille de DMEM-F12.
    3. Préparez le tampon enzymatique en ajoutant 2,9 mL d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 1,2 mL de NaHCO3 à 2,5 % [p/v] et 160 μL de CaCl2 (1 M) à 160 mL de solution de l’Université du Wisconsin.
    4. Préparez la solution de collagénase en ajoutant lentement 20 ml de tampon enzymatique dans le flacon de collagénase de qualité GMP contenant >2 000 U/bouteille de collagénase. Dissoudre à 4 °C pendant environ 40 min. Agitez doucement plusieurs fois pendant la période de dissolution.
    5. Préparez le milieu de congélation en ajoutant 5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 45 ml de NHS.
  2. Préparation du plateau de perfusion (Figure 1A).
    1. Nettoyez la cabine d’écoulement et couvrez-la avec des champs chirurgicaux. Chauffer un bain-marie à environ 40 - 45 °C pour chauffer le plateau de perfusion à 37 °C. Mettez des blouses chirurgicales et des gants chirurgicaux.
    2. Connectez un plateau de perfusion stérilisé au bain-marie pour préchauffer le plateau de perfusion avec de l’eau tiède. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air dans le plateau de perfusion en commençant par le plateau de perfusion en position verticale. Si nécessaire, ajoutez plus d’eau dans le bain-marie pour éviter l’infusion d’air dans le plateau de perfusion.
    3. Placez le tube LS25 dans la pompe. Laissez les deux extrémités stériles du tube dans l’armoire d’écoulement. Placez une pince de Kocher sur une extrémité du tube et laissez reposer au fond du plateau de perfusion. Placez une gaze stérile sur le dessus du tube pour éviter toute obstruction. Fixez un connecteur Luer à l’autre extrémité du tube.
    4. Ajoutez environ 100 ml de fluide ordinaire dans le plateau de perfusion et commencez à rincer le tube à une vitesse de pompe de 100 ml/min.

3. Isolement des cellules rénales

  1. Préparation du rein.
    1. Retirer le rein des sacs stériles doubles et le placer sur le plateau de perfusion stérile (Figure 1B). Retirez le tissu adipeux périrénal et la capsule rénale à l’aide de ciseaux et d’une déchirure douce (Figure 1C) et identifiez l’artère rénale sur le patch aortique comme indiqué dans Figure 1D.
    2. Canulez l’artère rénale avec l’accessoire spike, fixez-le à l’aide d’un tie-rip stérilisé et fixez-le à l’extrémité du tube de la pompe avec le connecteur Luer pendant que la pompe est en marche. Si les tubes ne sont pas complètement remplis, ajoutez d’abord plus de fluide dans le plateau et rincez les tubes en démarrant la pompe (Figure 1E - F). Rincer le rein avec un fluide ordinaire à l’aide de la pompe avec un débit de 100 mL/min.
  2. Traitement de la collagénase et isolement des cellules rénales.
    1. Ajouter la collagénase (20 mL, >2 000 U) et la DNase (2,5 mL, 1 mg/mL) dans le plateau de perfusion (Figure 1G). Retournez le rein de temps en temps doucement à la main. Attendez que le rein devienne mou et que le liquide de perfusion devienne moins transparent (environ 30 à 40 min).
    2. Massez doucement le rein (Figure 1H) jusqu’à l’obtention d’une suspension cellulaire (Figure 1I). Retirez le matériel non digéré et le spicule dans l’artère rénale.
  3. Lavage et collecte des cellules rénales.
    1. Ajouter 50 ml de NHS à la suspension cellulaire. Vidangez la suspension cellulaire du plateau de perfusion en plaçant la pompe à faible débit et en plaçant le tube d’abord connecté au rein au-dessus des tubes de 50 ml (Figure 1J).
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 7 min à 4 °C et retirer le surnageant. Lavez les granulés avec un produit de lavage contenant 10 % de NHS et centrifugez-les à nouveau à 300 x g pendant 7 min. Répétez le lavage une fois de plus. Mesurez le volume des granules de cellules et ajoutez un volume égal de milieu de culture cellulaire.
    3. Soit cryoconserver les cellules d’ici en ajoutant un milieu de congélation 1:1 à la suspension cellulaire et les stocker dans des flacons cryogéniques selon les protocoles standard, soit continuer à cultiver les cellules (section 4).
      REMARQUE : La suspension cellulaire contient des amas de cellules et nécessite des étapes supplémentaires pour obtenir des cellules uniques, ce qui entraîne une augmentation de la mort cellulaire. Par conséquent, les cellules sont maintenues en suspension et ne sont pas comptées à ce stade.

4. Culture cellulaire de cellules rénales brutes

  1. Ajouter environ 1 mL de suspension cellulaire à 24 mL de lysats plaquettaires alphaMEM à 5 % (milieu de culture cellulaire) dans une fiole de culture cellulaire T175 (classe Figure 1K) et cultiver à 37 °C, 5 % CO2. Retirez le milieu et les débris cellulaires après 2 jours des cellules adhérentes et rafraîchissez le milieu avec 25 ml de milieu de culture cellulaire.
  2. Rafraîchir le milieu de culture deux fois par semaine en prélevant la moitié du milieu (12,5 ml) et en ajoutant du milieu frais (12,5 ml) en utilisant des techniques aseptiques.
  3. Culture jusqu’à confluence (généralement 5 - 7 j) (Figure 1L). Retirer le milieu, laver deux fois avec du PBS et trypsiniser les cellules en ajoutant 5 mL de trypsine dans chaque fiole T175 pendant 5 min à 37 °C. Laver dans un milieu de culture et centrifuger à 490 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.

5. Enrichissement des cellules pour NG2 par séparation magnétique des cellules (Figure 1M)

  1. Préparez le tampon de séparation des cellules selon le protocole du fabricant.
  2. Remettre en suspension les kPSC trypsinisées dans un tampon de séparation cellulaire de 10 mL. Centrifuger à 490 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un tampon de séparation cellulaire de 300 μL.
  3. Ajouter 100 μL de reagen/5 x 107 cellules, ajouter 100 μL de billes d'anti-mélanome (NG2) par 5 x 107 cellules et incuber pendant 30 min à 4 °C. Séparer la fraction NG2-positive selon le protocole du fabricant. Ajouter 10 mL de milieu et centrifuger les cellules pendant 5 min à 490 x g.
  4. Comptez les cellules à l'aide d'une chambre de comptage Bürker selon le protocole du fabricant. Ensemencez les cellules dans une fiole de culture (environ 4 x 103 cellules/cm2) et incubez.
    REMARQUE : Ensemencer les cellules aux concentrations suivantes : 250 000 < dans une fiole T25, 250 000 à 500 000 dans une fiole T75 et 700 000 à 800 000 dans une fiole T175. Après l’enrichissement magnétique de la cellule, une fraction positive d’environ 1 à 2 % est isolée. Cependant, comme il s’agit d’un enrichissement cellulaire et non d’un tri cellulaire, d’autres types de cellules seront présents dans la culture (Figure 1N). Après plusieurs passages (généralement autour de 4 - 5), seule une population homogène de kPSC est présente (Figure 1P).

6. Culture des kPSC

  1. Rafraîchissez le milieu deux fois par semaine en enlevant la moitié du milieu et remplacez-le par un milieu de culture fraîchement décongelé (Figure 1N).
    REMARQUE : Les kPSC ont tendance à être plus viables et prolifératives lorsque seulement la moitié du milieu est rafraîchie.
  2. Passage des kPSCs.
    REMARQUE : Passez les kPSC à une confluence de 90 à 100 %, ou lorsque des structures 3D apparaissent (voir Figure 1O), ou lorsqu'il n'y a pas eu de croissance cellulaire depuis plus d'une semaine. Ces deux derniers en particulier pourraient se produire dans les premiers passages après l’enrichissement cellulaire. Dans ce cas, après le passage, les cellules recommenceront généralement à se développer en culture monocouche (Figure 1P).
    1. Retirez le milieu des cellules de 90 à 100 % confluentes (conservez le milieu pour une utilisation ultérieure). Lavez la fiole deux fois avec du PBS (1 mL dans T25, 5 mL dans T75, 10 mL dans T175). Ajouter la trypsine (0,5 mL dans T25, 2 mL dans T75, 5 mL dans T175) et incuber 5 min à 37 °C. Ajouter l’ancien milieu dans la fiole et remettre doucement en suspension.
    2. Transférer dans un tube de 15 ou 50 mL (selon le volume) et centrifuger à 490 x g pendant 5 min. Compter les cellules viables et la plaque <250 000 dans un T25, 250 000 - 500 000 dans un T75 ou 700 000 - 800 000 dans un T175 (environ 4 x 103 cellules/cm2).
  3. Tester les kPSC au passage 5 ou 6 (par exemple, test de grattage, section 7).
    REMARQUE : Caractérisez les cellules propagées par cytométrie en flux à l’aide de protocoles standard. L’expression des marqueurs NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC doit être positive et CD31, CD34, CD45 et HLA-DR doit être négative. Testez les mycoplasmes, les bactéries et les champignons dans le milieu de culture selon les protocoles standard du laboratoire de microbiologie clinique. Testez le fonctionnement des kPSC dans un test de grattage de la plaie épithéliale rénale. Les expériences sont généralement réalisées avec des populations de kPSC homogènes stériles, confirmées par cytométrie en flux, avec une capacité de cicatrisation des plaies entre le passage 6 et 8.
  4. Cryoconservez les kPSC en ajoutant 0,5 mL de milieu de cryoconservation à 0,5 mL de suspension cellulaire (2 millions de cellules par mL de milieu de culture) à l’aide des protocoles standard.
    REMARQUE : Après décongélation, ensemencez les kPSC à une densité plus élevée (106 cellules dans un T175).

7. Test fonctionnel des kPSC : Essai de grattage de la plaie épithéliale rénale

  1. Cultivez les kPSC dans une plaque à 6 puits à une densité de 200 000 cellules/puits dans un milieu de culture de 2 ml. Après 48 h de culture à 37 °C, 5 % de CO2, recueillir le surnageant. C’est le milieu conditionné.
  2. Implantez le HK-2 (cellules épithéliales tubulaires proximales)17 dans 2 mL de milieu de cellules épithéliales tubulaires proximales (PTEC) composé d’un rapport de 1:1 de DMEM-F12 complété par de l’insuline (5 mg/mL), de la transferrine (5 mg/mL), du sélénium (5 ng/mL), de l’hydrocortisone (36 ng/mL), de la triiodothyrinine (40 pg/mL), du facteur de croissance épidermique (10 ng/mL) et du pen/streptocoque, dans une densité de 500 000 cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits.
  3. Culture pendant 48 h à 37 °C, 5 % CO2. Retirez le milieu de culture cellulaire des HK-2 et créez une égratignure dans la monocouche des HK-2 en faisant une égratignure avec la pointe d’une pipette jaune du haut vers le bas du puits. Lavez les HK-2 avec du PBS et ajoutez le milieu conditionné des kPSC ou le milieu témoin. Marquez au bas de la plaque la zone à imager.
    REMARQUE : Les HK-2 doivent être confluents. Imagez deux zones par puits.
  4. Imagez la rayure à 4, 8, 12 et 24 h à la même position marquée avec un microscope à fond clair inversé.
  5. Mesurez la zone de rayure dans l’image J à l’aide de l’outil de sélection de polygone pour déterminer le pourcentage de fermeture.

Résultats

La méthode d’isolement de grade clinique kPSCs est résumée dans la Figure 1. Les cellules rénales brut sont isolés des reins de grade de la transplantation humaine par perfusion de collagénase. La suspension de cellules qui en résulte est cultivée jusqu’au confluent dans les lysats de plaquettes de 5 %. Ensuite la fraction de cellules stromales périvasculaires est isolée en fonction sur expression NG2.

kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique en forme de fuseau (Figure 2A) et sont positifs pour les marqueurs stromales marqueurs CD73, CD90, CD105 et périvasculaires NG2, PDGFR-B et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34, CD45 et HLA-DR (Figure 2B). En règle générale, une population homogène de kPSCs peut être rejoint au passage 4, et le kPSCs atteindre sénescence autour du passage 9-10 (Figure 2C). Nous conseillons donc d’effectuer des expériences entre passage 5-8.

Pour évaluer la capacité fonctionnelle de le kPSCs isolés, nous effectuons un essai in vitro rénales épithéliales plaie gratter avec sur chaque nouveau lot de kPSCs, comme nous l’avons montré précédemment que le milieu conditionné de kPSCs peut accélérer la cicatrisation épithéliale dans ce dosage zéro15. Le milieu conditionné de kPSC fait en cultivant kPSCs pendant 48 h dans les lysats de plaquettes alphaMEM 5 % et en recueillant le liquide surnageant. Ensuite, le rein humain immortalisées tubule proximal des cellules épithéliales (HK-2)17 sont cultivées jusqu’au confluent et puis faite une plaie de grattage. Alors soit le milieu conditionné de milieu kPSCs ou le contrôle est ajouté aux puits et la vitesse de cicatrisation est mesurée. Lors de l’ajout du milieu conditionné de kPSCs, la plaie referme beaucoup plus rapide (Figure 2D).

figure-results-1
Figure 1 : Clinique Grade Isolation méthode of Human kPSCs. Transplantation de reins de grade sont canulés et perfusés avec la collagénase par l’intermédiaire de l’artère rénale (A - G) et la suspension de cellules qui en résulte est lavée et soit cryopréservés ou mis en culture (H - K). Lorsque les cellules atteignent la confluence (L), NG2 enrichissement cellulaire est exécutée (M). Les cellules sont trypsinisées quand ils sont confluentes, ont cessé de proliférer ou lorsque ces structures 3D apparaissent (N - P). Les critères de publication pour kPSCs sont la stérilité, expression du marqueur et la capacité d’améliorer la cicatrisation épithéliale tubulaire (Q). Flèche : artère rénale. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2: Characterization of Human kPSCs. Un) kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique, en forme de fuseau. KPSCs B) sont positifs pour les marqueurs mésenchymateux CD73, CD90, CD105, marqueurs périvasculaires NG2, PDGFR-β et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34 et CD45. kPSCs express MHC classe I (HLA-ABC) mais pas de classe II (HLA-DR). C) caractéristiques de la croissance des trois donneurs de kPSC différentes de cytométrie confirment homogène NG2 populations positives (au passage 4). kPSCs rejoindre la sénescence autour du passage 9-10. KPSCs D) sont en mesure d’améliorer la réparation épithéliales rénales dans un dosage zéro blessure. Les images représentant des moyens de contrôle et milieu de kPSC conditionné à t = 0, 4, 8 et 12 h sont indiqués. Echelle a) = 200 µm, d) = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les cellules périvasculaires ont été isolées de nombreux différents organes solides humaines, y compris le pancréas, la graisse, du cartilage et le rein de15,9,16. La plupart des méthodes, cependant, sont basés sur de petits échantillons de tissu, qui sont disséqués et ensuite traités avec des enzymes digestives. En outre, c’est généralement pas réalisée avec des produits de qualité clinique. Cela rend ces stratégies moins approprié pour une traduction clinique directe où de grandes quantités de cellules cliniques de qualité sont nécessaires.

Nous montrons ici une méthode d’isolement roman de kPSCs humain pour des organes entiers, basé sur la perfusion avec les enzymes de grade clinique et matériaux. Le protocole est adapté à partir du protocole d’isolement clinique îlots de Langerhans en cours d’utilisation pour des applications cliniques dans notre centre18.

C’est la première méthode de grade clinique où de grandes quantités de kPSCs est possible. La variabilité du rendement de la cellule est dans une large mesure les donateurs dépendant. Toutefois, lorsque le rendement cellulaire que nous obtenons actuellement d’une fraction de la suspension cellulaire brut de trois différents donateurs est extrapolé, en théorie, un rendement moyen de 2,7 x 1012 kPSCs par donneur pourrait être atteint. Comme MSC thérapie consiste généralement en 2 perfusions de cellule avec 1-2 x 106 cellules/kg corps poids4, nombre de ces cellules est suffisant pour un traitement allogénique de plusieurs patients.

Une étape cruciale dans la procédure d’isolement est la durée de la digestion de collagénase. Lorsque la période de digestion est trop courte, grosses touffes de tissu restera, qui sera plus difficile à la culture. Lorsque la période de perfusion est trop longue, la mort cellulaire accrue peut-être être observée. Par conséquent, dès que le rein commence à devenir mou et des fluides moins transparents, le rein doit se faire masser doucement et la collagénase de traitement doit être arrêtée.

Une autre étape critique est la culture des cellules après enrichissement cellulaire NG2. Parfois après l’enrichissement de cellule NG2, les cellules périvasculaires ne commencent pas à proliférer ou commencent à se développer dans les structures 3D. Dans ce cas, lorsque les cellules sont trypsinisées et redéfinies, les cellules habituellement commencera à croître en culture monocouche.

Comme matériau de départ, reins de grade de la transplantation humaine rejetés principalement pour des raisons chirurgicales ont été utilisés. Voici les organes fonctionnels sans fibrose importante. Nous reconnaissons que cela pourrait être une limitation, car c’est une maladie relativement rare et difficile à obtenir la source de l’orgue. Reins explantés pourraient constituer une autre source ; Toutefois, selon le motif de l’explantation rein, ces reins peuvent contenir plus de fibrose et donc myofibroblastes, et c’est pourquoi il faut veiller car les myofibroblastes peuvent être isolées et cultivées au lieu de cellules périvasculaires.

Comme le kPSCs isolés avec ce spectacle de protocole propriétés organo-typic avec rein épithélial enroulait guérison capacités15, thérapie cellulaire avec kPSCs dans les maladies des reins et transplantation serait une intéressante application future. À cette fin, il y a plusieurs stratégies de livraison du produit cellule/cellule. La première stratégie est perfusion IV de kPSCs, tel qu’il est actuellement utilisé dans les études cliniques de bmMSC. Une autre application intéressante est l’utilisation des kPSCs ou des facteurs de kPSC-excrétés dans la perfusion de la machine avant la transplantation. De cette façon, la qualité du rein explanté pourrait améliorer qui pourrait conduire à la fonction rénale améliorée après la transplantation. Pour les deux stratégies, kPSCs sont une source intéressante de cellules nouvelles à explorer davantage à des fins cliniques.

Déclarations de divulgation

D.G.L., M.A.E., et T.J.R. sont associés à une demande de brevet concernant cette étude. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a reçu un financement du septième programme-cadre (7e PC/2007-2013) de la Communauté européenne en vertu de la concession numéro de contrat 305436 STELLAR.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sacs BaxterFenwalR4R-7004
Plaquettes humainesSanquinhôpital surplus de matériel périmé depuis moins de 2 jours est utilisé
lysatsur mesure
Bouteilles stériles jetablesCorning09-761-11
500 mL Tubes à centrifugerPP Corning431123
a-MEM moyenLonzaBE12-169F
glutamaxthermo fisher35050038
stylo/streptocoque  ;Invitrogen15070063
Codan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Sérum humain normal (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7,5 %LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWBridge to life32911
HeparineLeo Pharma
collagénase NB1 GMP gradeSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
champs chirurgicaux3M NederlandDH999969404
pompe à perfusionmetrohmx007528300
tête de pompemetrohmx077202600
plateausur mesure
LS25 masterflex tubes MasterflexHV-96410-25
accessoire pointeGambro DASCO6038020
pulmozymeRoche
flacons de culture 25 CM2Greiner690175
Flacon de culture 75 cm2greiner658170
Flacon de culture 175 cm2greiner661160
Trypsinsigmat4174
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR réactif bloquantmiltenyi130-059-901
billes anti mélanome (NG2)miltenyi130-090-452
passoire cellulaire 70 µ ; mCorning352350
LS colonnesMiltenyi130-042-401
MACS aimantmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD  ;
CD45 APCBD  ;
CD146 PEBD  ;
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD  ;
HLA ABCAPC BD  ;
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD  ;
CD56 PEBD  ;
CD73 PEBD  ;
CD31 FITCBD  ;
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r  ;R& Dmab 1263
souris IgG1 FITCBD  ;
souris IgG1 PEBD  ;
souris IgG1 APCBD  ;
IgG2b PEBD  ;
chèvre anti souris PEDakoR0480
azoture de sodiumMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (insuline, transferrine, sélénium)SigmaI1884
hydrocortisoneSigmaH0135
triiodothyrinineSigmaT5516
Facteur de croissance épidermique (EGF)sigmaE9644
Immortalisé PTEC rénal humain (HK2)courtoisie de M. Ryan, collège universitaire de Dublin
de plaquettes Système de transfusion de perfusion 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Références

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