Induction de la différenciation cellulaire et de l&#39;imagerie cellulaire unique<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

Résumé

Ce protocole permet la microscopie à une seule cellule des cellules Swimmer et Swarmer Vibrio parahaemolyticus différentiellement distinctes. La méthode produit une population de cellules moustiques facilement disponibles pour une analyse cellulaire unique et couvre la préparation de cultures cellulaires, l'induction de la différenciation des mollusques, la préparation des échantillons et l'analyse d'image.

Résumé

La capacité d'étudier la localisation intracellulaire des protéines est essentielle pour la compréhension de nombreux processus cellulaires. À son tour, cela nécessite la possibilité d'obtenir des cellules individuelles pour la microscopie de fluorescence, ce qui peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans les communautés bactériennes. Par exemple, le pathogène humain Vibrio parahaemolyticus existe comme de petites cellules nageuses en forme de tige dans des conditions liquides qui, lors du contact de surface, se différencient en une sous-population de cellules de bourgeons fortement allongées spécialisées dans la croissance sur des surfaces solides. Cet article présente une méthode pour effectuer une analyse de microscopie de fluorescence à une seule cellule de V. parahaemolyticus dans ses deux états différentiels. Ce protocole induit de manière très reproductible la différenciation de V. parahaemolyticus dans un cycle de vie de la cellule gonflante et facilite leur prolifération sur les surfaces solides. La méthode produit des étincelles de cellules de bourgeons différenciées s'étendant de tIl se dirigea vers la colonie d'essaims. Notamment, à la pointe même des évasements d'essaim, les cellules de mollusque existent dans une seule couche de cellules, ce qui permet leur transfert facile vers une lame de microscope et une microscopie à fluorescence ultérieure d'une seule cellule. En outre, le flux de travail de l'analyse d'image pour la représentation démographique des sociétés bactériennes est présenté. En tant que preuve de principe, on décrit l'analyse de la localisation intracellulaire des réseaux de signalisation chimiotaxique dans les cellules nageuses et moustiques de V. parahaemolyticus.

Introduction

Les bactéries connaissent constamment des changements dans leur environnement externe et ont développé plusieurs techniques pour modifier et adapter leurs comportements en conséquence. Un tel mécanisme implique une différenciation en types de cellules distinctes qui complètent mieux l'environnement altéré. La différenciation implique souvent des changements majeurs dans la régulation du cycle cellulaire, de la morphologie cellulaire et de l'organisation spatio-temporelle des cellules. Un organisme qui peut subir une différenciation est Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartient aux Vibrionaceae , qui est une famille de....

Protocole

1. Préparation de cellules électro-compétentes V. parahaemolyticus et électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules nageuses

NOTE: La section suivante du protocole permet la préparation de cellules électro-compétentes et l'électroporation ultérieure d'ADN plasmidique dans des cellules nageuses. Cette étape est importante si des protéines fluorescentes s'expriment par voie ectopique à partir d'un plasmide.

1. Sortir des cellules V. parahaemolyticus d'un stock de glycerol -80 ° C sur une plaque d'agar LB fraîche contenant 100 ug / ml d'ampicilline et incuber p....

Résultats

Induction de la différenciation et de la génération des colonies en essaimage

La figure 1 fournit un schéma des étapes importantes impliquées dans la production de colonies grouillantes de V. parahaemolyticus ( figure 1A-C ). Une culture de nageur a été repérée sur swarm-agar et incubée à 24 ^o C, induisant une différenciation et une prolifération des mollusques sur la.......

Discussion

Cet article rapporte une méthode pour l'imagerie microscopique de cellules de moustiquaires V. parahaemolyticus , suivie d'analyses en aval destinées à résoudre et quantifier la localisation subcellulaire et d'autres caractéristiques des protéines étudiées fluorescentes. Bien que plusieurs outils existent pour le traitement et l'analyse de l'image microscopique ^{14 , 15 , 16 ,}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Media components
LB medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulé	BD	214510	Pour la préparation de gélose LB avec LB medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Pour la préparation de plaques d’essaimage de gélose HI
Agarose NEEO, ultra qualité	Roth	2267.3	Pour la préparation des tampons d’agarose de microscopie<
strong>Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Additifs
L-arabinose	Roth	5118.3	Utilisé pour induire des dérivés pBAD
2,2'-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
Chlorure de calcium dihydraté	Roth	5239.1	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
Sel d’ampicilline sodique	Roth	K029.3
Chloramphénicol	Roth	3886.3
Tampon PBS		--Recette	standard pour la solution saline
D(+) Sucrose	Roth	4621.1	Pour la préparation des piles électrocompétentes
Glycérol	Roth	3783.5	Pour la préparation des piles électrocompétentes
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hardware
Boîte de Pétri 150 mm x 20 mm avec cames	Sarstedt	82.1184.500	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Utilisé		pour le séchage des plaques d’essaimage de gélose HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Utilisé pour l’élimination de l’ADN plasmidique
Nom	Entreprise<	strong>Numéro de catalogue<	strong>Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices-Used		for microscopy image analysis
Excel	Microsoft-Used		for microscopy data analsis

tamponnée au phosphate