Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Résumé

Nous vous présentons le développement des faisceaux auto-assemblés, en trois dimensions du corps alignés longitudinalement astrocytaires cellulaires et des processus dans un enrobage de nouveaux biomatériaux. Ces engineered « vie échafaudages », présentant le diamètre micron-échelle mais qui s’étend de centimètres de longueur, peut servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes du développement neurologique ou faciliter la neurorégénération en direction de la migration neuronale et/ou axonale pathfinding.

Résumé

Neurotraumatologie et neurodégénératives maladie se traduisent souvent par une durée des déficits neurologiques en raison de la capacité limitée du système nerveux central (CNS) pour remplacer les neurones perdus et régénérer les voies axonales. Cependant, au cours du développement du système nerveux, la migration neuronale et extension axonale surviennent souvent le long des voies, formés par les autres cellules, dénommé « échafaudages de vie ». Cherchant à imiter ces mécanismes et à concevoir une stratégie qui contourne l’environnement inhibiteur du SNC, ce manuscrit présente un protocole visant à fabriquer des tissus d’ingénierie axée sur les astrocytes « échafaudages de vie ». Pour créer ces constructions, nous avons utilisé un système de housse nouveau biomatériau pour induire des astrocytes de s’auto-assembler en denses faisceaux tridimensionnelle des bipolaires alignés longitudinalement corps cellulaires et des processus. Tout d’abord, creux hydrogel micro-colonnes ont été assemblés, et la lumière interne a été recouvert de collagène-matrice extracellulaire. Dissociées des astrocytes corticales cérébrales ont été livrés ensuite dans la lumière de la micro-colonne cylindrique et, à un diamètre intérieur critique du < 350 µm, spontanément auto aligné et contracté pour produire des câbles fibre longue comme consistant en des faisceaux denses des processus de l’astrocyte et des fibrilles de collagène mesurant < 150 µm de diamètre, mais s’étendant à plusieurs cm de longueur. Ces engineered échafaudages de vie exposées > 97 % viabilité cellulaire et étaient presque exclusivement composée d’astrocytes exprimant une combinaison de la filament intermédiaire protéines glial-protéine fibrillaire acide (GFAP), vimentine et nestin. Ces alignement astrocyte réseaux trouvées pour fournir un substrat permissif pour fixation neuronale et alignement les neurites extension. En outre, ces constructions de maintiennent l’intégrité et l’alignement lorsque extraites de la housse d’hydrogel, ce qui les rend appropriés pour l’implantation de la CNS. Ces constructions préformées émulent structurellement cytoarchitecturaux principaux éléments d’origine naturelle gliale basée sur « vivre échafaudages » in vivo. À ce titre, ces échafaudages machiné vivants peuvent servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes neurologiques du développement in vitro ou faciliter neurorégénération en orientant la migration neuronale et/ou novateur Axonal suite in vivo de la dégénérescence CNS .

Introduction

Le système nerveux central (CNS) a une capacité limitée pour contrebalancer la perte et/ou un dysfonctionnement des neurones et des voies axonales qui accompagnent les États tels que traumatisme crânien (TCC), accident vasculaire cérébral, la moelle épinière lésions Médullaires aigues et neurodégénératives maladie^{1 ,2,3,4,5}. La neurogenèse dans le SNC est limitée à un nombre limité de zones dans le cerveau, qui entravent la restauration de neurones perdus^6,7. En outre, la régénération du pertes axonales voies dans le système nerveux central est insuffisante en raison de l’absence d’orientation dirigée, la présence d’inhibiteurs de l’excroissance et réactive astrogliosis suite à une avarie de tissu neural^{2,8, 9,10}. Astrocytes ont généralement des fonctions diverses en aidant les neurones avec l’homéostasie ionique, dégagement de neurotransmetteur, la formation des synapses et neurovascular couplage¹¹. Néanmoins, suite de dommages même doux de tissu neural, astrocytes pourraient subir des changements moléculaires, structurales et fonctionnelles, comme la transition vers un État hypertrophique¹¹. En réponse à des traumatismes neurologiques sévères, ces changements entraînent la formation d’une cicatrice avec une pénombre contenant des astrocytes réactifs migration et un noyau de lésion qui inclut les leucocytes sont échappés de la rupture – barrière hémato encéphalique (BHE), la microglie, oligodendrocytes et fibroblastes^11,12,13. Ces astrocytes réactifs atteignent une morphologie des processus filamenteux, désorganisés et présentent une expression accrue de protéines des filaments intermédiaires et des protéoglycanes de sulfate de chondroïtine (CSPG), qui entravent la régénération neuronale¹². Même si au départ, la cicatrice gliale contribue à rétablir l’intégrité BBB et éviter la transmission de la réponse inflammatoire aux tissus sains avoisinants, il sert de barrière physique et biochimique contre axon régénération^{12,14 ,15,16}. Par exemple, les axones qui rencontrent la cicatrice gliale affichent les cônes de croissance dystrophiques bulbeux et chétive croissance¹². En outre, la désorganisation des processus astrocytaires après une blessure empêche l’extension de la régénération des axones¹⁷. Le résultat de ces caractéristiques inhibitrices se manifeste dans la handicaps physique et neurologique souvent permanents que les patients souffrent après neurotrauma sévère, y compris les TBI et Sci.

Quelles que soient les défis extrinsèques régénération fonctionnelle dans le SNC, les axones ont démontré posséder une capacité intrinsèque à se régénérer. Par exemple, la nature dynamique des cônes au contact de la cicatrice gliale dystrophiques croissance suggère que ces terminaisons conservent leur capacité de s’étendre ๲. Par conséquent, on croit qu’un obstacle principal à la repousse axonale est l’environnement inhibitrice de la CNS après l’accident et celui fournissant un environnement plus permissif via la réduction des cicatrices gliales et/ou la fourniture des ponts régénératrices dans la cicatrice serait avantageuse. En effet, les études antérieures ont démontré que les neurones de CNS étaient capables d’étendre des axones par une lésion à l’aide de greffes de nerfs périphériques comme des ponts, qui présente un environnement plus favorable pour axon régénération^{12,18, 19}. Plusieurs autres stratégies ont été poursuivies pour exploiter cette capacité régénératrice vestigiale. Par exemple, manipulation des voies de signalisation de la croissance cellulaire dans divers modèles de lésion entraîne la régénération axonale et cicatrice gliale réduction^10,20,21. En outre, des études ont montré que le traitement avec chondroïtinase ABC, qui s’attache à la plupart des chaînes de sucre dans le CSPG, diminue l’effet inhibiteur du CSPG sécrétée par les astrocytes réactifs²². Des résultats encourageant malgré, ces approches ne fournissent pas réalisé l’orientation des cônes de croissance, ce qui peut se traduire potentiellement par régénération aberrante¹²et ne tiennent pas compte de la perte de neurones. Approches axées sur les cellules ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter les effets de la cicatrice gliale et à reconstituer les cellules perdues, en particulier des neurones. Certains groupes ont dédifférenciées astrocytes réactifs en neurones, tandis que d’autres ont transplanté des cellules progénitrices neurales en lésions CNS à repeupler la zone de la blessure et de promouvoir l’axone régénération^{23,24, 25}. Cependant, greffe de cellules souches seule est limitée par les taux de survie faibles, mauvaise intégration et maintien modeste dans le tissu endommagé⁵. En outre, ces stratégies axées sur la cellule ne parviennent pas à restaurer sur de longues distances axonales étendues, en particulier d’une manière contrôlée. Par conséquent, les biomatériaux en combinaison avec d’autres approches est envisagées comme des véhicules de livraison pour les différents neurones et facteurs de croissance ou cellules progénitrices²⁶. Approches axées sur les biomatériaux disposent d’un haut degré de contrôle de la conception pour produire des constructions qui imitent le haptotaxic physique, spécifique et chemotaxic repères présent dans le micro-environnement d’en trois dimensions (3D) de l’hôte cible tissus^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduction de ces signaux environnementaux est primordiale pour les cellules transplantées à présenter la morphologie natif, prolifération, la migration et signalisation, entre autres caractéristiques neurobiologiques²⁹. Malgré ces propriétés avantageuses, avancement au-delà des traditionnelles cellules ensemencées biomatériau échafaudages est nécessaire pour favoriser la régénération axonale longue distance dirigée et remplacer les neurones perdus simultanément.

Une approche alternative est basée sur le tissu neural promettant d’ingénierie « échafaudages de vie », qui soient distinguent des autres approches basées sur les cellules en raison de la présence de cellules neuronales vivantes avec une cytoarchitecture préformé qui émule la neuroanatomie natif et/ou mécanismes de développement pour faciliter le remplacement ciblé, la reconstruction et la régénération des circuits neuronaux^4,35. Considérations relatives à la conception des échafaudages de vie incluent les phénotypes et les sources de cellules nerveuses, ainsi que les propriétés mécaniques et physiques et les signaux biochimiques dicté par la composition de tout accompagnement de biomatériaux³⁵. Après fabrication in vitro, ces échafaudages de vie peuvent être implanté en vivo de molécules d’adhésion cellulaire présentes et chimiotactiques et neurotrophiques signale à réguler activement la migration cellulaire neuronale et une excroissance axon selon l’État et progression du processus de régénération,³⁵. Les cellules gliales peuvent servir de base pour la cytoarchitecture machiné des échafaudages de la vie puisque ces cellules médient divers mécanismes de développement in vivo. Pendant le développement du cerveau, nouveaux neurones dépendent de processus basales prolongées de cellules gliales radiales de la zone ventriculaire vers la plaque corticale en voie de développement comme vie échafaudages pour migration réalisé^36,37. En outre, qui s’étend de la croissance, les cônes sont indiquées pour s’orienter en détectant les signaux attractifs et répulsifs, induites par les cellules gliales de point de repère et soi-disant « révolutionnaire » des axones sont proposées pour atteindre les objectifs corrects en étendant le long des motifs glial échafaudages^35,38,,³⁹. Ainsi, les cellules gliales sont nécessaires pour l’orientation des pionniers des axones, qui servent par la suite comme axée sur l’axone « échafaudages vivant » pour diriger la projection des axones « suiveur ». En outre, les mécanismes de croissance médiée par les cellules gliales ont démontré que persistent après la naissance, tout comme les neuroblastes suivent le flux migratoire rostral (RMS) pour naviguer de la zone sous-ventriculaire (SVZ), une des rares régions restantes de la neurogenèse dans le cerveau adulte, à la bulbe olfactif (OB)⁴⁰. Ces neuroblastes dans le RMS migrent à l’intérieur du tube glial (Figure 1 a-1), qui comprend des processus astrocytaires alignés longitudinalement, via les adhérences cellule-cellule directe et par des facteurs solubles^{37, 41}. Enfin, alors que les dégâts de la CNS à causes des mammifères perturbé arrangement processus astrocytaires formant une cicatrice gliale qui empêche physiquement la régénération axonale¹⁷, beaucoup de systèmes non mammifères n’ont pas la formation d’une cicatrice gliale préjudiciable. Plutôt, les cellules gliales non-mammifère d¿espèces maintiennent plus organisé, alignés sur les modèles qui sont utilisés comme guides à travers la région lésée^17,42,43. Par exemple, modèles de non-mammifère SCI, axones sont divulgués à se développer en étroite association avec gliales ponts traversant la lésion, ce qui suggère un rôle important pour échafaudages gliales organisées comme substrats facilitant la régénération axonale et la récupération fonctionnelle ( Figure 1 a -2) ^{42 , 44 , 45}. récapitulation des caractéristiques neuroanatomiques et les mécanismes du développement/régénératrice décrits ci-dessus peut-être donner une nouvelle classe d’échafaudages machiné vie gliales qui permet de piloter simultanément la migration neuronale immature et axonale découvrir à travers des environnements non permissif dans le cas contraire, ce qui peut atténuer les effets des neurones et axon tract dégénérescence associée aux maladies et des blessures de la CNS.

Notre groupe de recherche a déjà conçu plusieurs types d’échafaudages de vie pour la reconstruction et la régénération axonale parcelles dans le SNC et le système nerveux périphérique (PNS) via micro-tissu fabriqué réseaux neuronaux (micro-ados) et tissu ingénierie des greffes nerveuses (TENGs), respectivement^27,46,47,48. Les deux stratégies reposent fondamentalement sur "biomimétisme". Micro-ados sont des structures d’inspiration anatomiquement conçus structurellement et fonctionnellement remplacer tracts axones reliant les différentes populations de neurones du cerveau. TENGs exploiter le mécanisme du développement de la régénération axonale facilitées par axon, illustrée par croissance axonale « suiveur » le long des axones de « pionnier », pour atteindre l’hôte ciblé la régénération axonale^35,46,48. Nous avons récemment capitalisés sur la polyvalence de l’échafaudage de vie technique utilisant un modèle similaire de la housse comme micro-ados et cherchant l’inspiration dans les mécanismes de cellules gliales présentes tout au long du développement. Ici, nous avons développé des constructions constituée d’astrocytes alignés s’étendant sur la lumière du collagène d’un hydrogel micro-colonne⁴⁹. Ces échafaudages de vie astrocytaires sont mis au point par premier remplissage un pointeau de tube capillaire-acupuncture avec liquide d’agarose pour créer un hydrogel cylindrique creux avec un diamètre extérieur (OD) et le diamètre intérieur (ID) correspondant aux diamètres de la tube et l’aiguille, respectivement. Après gélification d’agarose et extraction de l’hydrogel micro-colonne du tube capillaire, l’intérieur creux est recouvert de type j’ai collagène pour fournir un environnement permissif pour adhérence astrocyte et aligné bundle formation (Figure 1 b -1). Par la suite, la lumière est ensemencée avec des astrocytes corticaux cérébraux isolées de ratons postnatal (Figure 1 b-2). Contrairement aux techniques bidimensionnelles (2D) alignement qui s’appuient sur l’application de champs électriques, micromotifs rainures et matrice extracellulaire protéines (ECM) le patterning, alignement des astrocytes dans l’échafaudage de vie technique se fonde sur l’auto-assemblage selon les variables contrôlables comme la courbure de substrat (ID de la colonne), la densité cellulaire et collagène concentration^50,51,52. Les astrocytes du contrat et remodèlent le collagène et d’acquièrent une morphologie bipolaire, alignés longitudinalement analogue aux échafaudages naturelles observées in vivo (Figure 1 b-3). En effet, nous poursuivons activement l’utilisation de ces structures ressemblant à des câbles comme substrats physiques d’orientation ciblée de la migration des neurones immatures ainsi que faciliter la régénération axonale dans l’environnement défavorable du SNC endommagé, particulièrement la cicatrice gliale chez les mammifères (Figure 1). Cet article va présenter la méthode de fabrication détaillées pour les astrocytes micro-colonnes, phase contraste et immunofluorescence des images de la cytoarchitecture attendue et un débat approfondi sur les limitations actuelles et les orientations futures de la technique.

Figure 1 : Inspiration, protocole de Fabrication et Applications proposées pour les réseaux astrocytaires alignées. Inspiration neurobiologiques (A) : (1) neuroblastes émanant de la zone sous-ventriculaire neurogène (SVZ) utilisent le tube glial aligné longitudinalement dans le flux migratoire rostral (RMS) pour une migration dirigée vers le bulbe olfactif (OB) ; (2) Non-mammifères tels que les amphibiens et les poissons peuvent soutenir la régénération après que tissu neural endommager en partie due à la formation d’un pont glial qui relie les extrémités d’une lésion (par exemple le percement la moelle épinière) et sert comme un échafaudage pour l’orientation des régénération des axones. (B) vue d’ensemble de la Fabrication : (1) construction d’une micro-colonne taille micron, creux hydrogel avec la lumière recouverte d’ECM, (2) semis des astrocytes corticales primaires, isolées de ratons postnatal, (3) l’auto-assemblage de l’orienté longitudinalement faisceaux dans la culture et l’extraction (4) du faisceau de la housse de biomatériau pour études d’implantation future. (C) In vivo applications : (1) ces échafaudages de vie peuvent servir des tubes gliales machinés pour la migration de neurone dirigé des centres neurogènes de repeupler des régions de neurone déficitaires ; (2) récapitulation du mécanisme du développement du pionnier de guidage axonal et le mécanisme régénératrice des ponts gliales non mammifères peut doter ces échafaudages astrocytaires avec la capacité de diriger la régénération axonale dans la non permissif environnement de la cicatrice gliale chez les mammifères. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par l’animalier institutionnel et l’utilisation des comités à l’Université de Pennsylvanie et le Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center et ont adhéré aux lignes directrices énoncées dans la politique de Service de santé publique de NIH sur sans cruauté Care and Use of Laboratory Animals (2015).

1. développement de l’Agarose Hydrogel Micro-colonnes

1. Faire une solution de poids/volume (p/v) de 3 % d’agarose en pesant 3 g d’agarose et de le transférer dans un bécher stérile contenant 100 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD). Ajouter une barre magnétique stérile dans le bécher et placez-le sur la surface d’une plaque chauffante/agitateur. Garder le récipient couvert pour éviter l’évaporation de son contenu à l’étape suivante.
2. Faire chauffer l’agarose et SPD à une température de 100 ° C et mélanger à 60-120 t/mn. Réglez ces paramètres au besoin et constamment surveiller la progression du processus de dissolution que la solution vire au départ d’opaque à un aspect clair qui signifie que l’agarose a été complètement dissous.
   ATTENTION : Le bol chaud et la solution sont chauds !
3. Comme la solution de gel d’agarose est chauffée et brassée, récupérer quatre plats de Pétri vide de 10 cm et ajouter 20 mL de SPD à deux d'entre eux. Placer les aiguilles d’acupuncture (diamètre : 300 µm, longueur : 40 mm), microlitre tubes capillaires de verre (diamètre : 701,04 µm, longueur : 65 mm, capacité : 25,0 µL) et un distributeur de l’ampoule à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Lorsque la solution liquide d’agarose efface, maintenir constante chauffage à environ 50 ° C et en remuant pour éviter la gélification de l’agarose.
4. Introduire une aiguille d’acupuncture dans l’ouverture inférieure d’un distributeur de l’ampoule. Insérer un tube capillaire au fil de l’aiguille exposé à l’extérieur. Fixez le tube capillaire en entrant la partie de celui-ci dans la partie en caoutchouc du cylindre distributeur ampoule.
5. Transférer 1 mL de liquide d’agarose avec une micropipette à la surface d’une boîte de Pétri vide, puis placez une extrémité du tube capillaire verticalement (avec l’aiguille insérée) au contact de l’agarose, tandis que le bouchon sur la distributeur ampoule se coince à l’intérieur. Relâcher lentement la pression sur le bouchon du distributeur ampoule dessiner d’agarose dans le tube capillaire.
   Remarque : Le transfert d’agarose liquide dans les tubes capillaires doit être exécuté rapidement. Si l’agarose liquide est laissé à refroidir la surface de la boîte de Pétri pendant assez longtemps (environ 60 s), il commence à gel, empêchant l’aspiration adapté de l’agarose le long du tube capillaire.
6. Place chaque ampoule-tube-pointeau dans un gratuit de Pétri et laissez l’agarose gel à l’intérieur des tubes capillaires se solidifient pour 5 min. Retirer soigneusement le tube capillaire avec vos mains sur le bouchon en caoutchouc dans le cylindre de distributeur ampoule, laissant l’aiguille et la gel d’agarose à l’intérieur du tube.
7. Extrayez manuellement l’aiguille d’acupuncture en le tirant lentement hors du tube capillaire ; le cylindre d’agarose nouvellement solidifiée aussi glisse hors du tube dans cette procédure, toujours autour de l’aiguille. Déplacer doucement vers micro-poteau le long de l’aiguille d’acupuncture avec la pointe d’une pince stérile pour le déplacer vers la fin. Placez l’aiguille sur un plat de Pétri contenant du SPD ouvert et poussez la micro-colonne dans le SPD avec une pince.
   Remarque : En si l’agarose micro-colonne reste dans le tube capillaire de verre lors du retrait de l’aiguille d’acupuncture, pousser doucement l’agarose micro-colonne hors du tube capillaire avec une aiguille de calibre 25 mm et dans le plat avec le SPD.
8. Stériliser à le microscalpels ou une pince à l’aide d’un stérilisateur de boudin chaud. Faire 4 % p/v d’agarose en pesant 4 g d’agarose et de le transférer à 100 mL de SPD. Faire chauffer et remuer comme expliqué à l’étape 1.2 pour obtenir une solution claire d’agarose liquide 4 %. Maintenir le chauffage et l’agitation de la solution dans l’ensemble les étapes suivantes.
9. Placer les boîtes de Petri contenant les colonnes-micro à une hotte de dissection et déplacer une colonne en micro avec une pince fine pour un plat de Pétri vide. Utiliser le stéréoscope pour guidage visuel et un microscalpel pour couper les micro-colonnes à la longueur désirée. Coupez les deux extrémités aux extrémités de la forme biseauté à 45^o angle par rapport à l’horizontale pour faciliter la manipulation des micro-colonnes au cours de l’ECM et les cellules plus.
10. Répétez la précédente étape pour trois micro-plus de colonnes dans la même boîte de Pétri et alignez les quatre constructions en parallèle avec une séparation de < 3 mm entre chacun des cylindres. Charger 50 µL de solution à 4 % d’agarose avec une micropipette et versez une strie/ligne de liquide sur le tableau de micro-colonne pour connecter et regrouper les constructions en groupes de quatre (ci-après appelés « micro-colonne boats »). Éviter tout mouvement de 4 % d’agarose jusqu’aux extrémités des micro-colonnes, qui peuvent obstruer l’intérieur, en minimisant la distance entre les constructions et en ajoutant l’agarose rapidement en une fine ligne.
    Remarque : Organiser des groupes de micro quatre-colonnes « bateaux » n'est pas nécessaire pour fabriquer les astrocytes. Néanmoins, les bateaux servent d’accélérer le processus de fabrication et d’offrir un moyen plus sûr de circuler et de traiter les micro-colonnes dans les étapes ultérieures.
11. Laissez refroidir le micro-colonne bateau pendant 1-2 min permettre la gélification de l’agarose supplémentaire de 4 %. Soulever le bateau micro-colonne avec une pince fine par le raccordement 4 % d’agarose et déplacez les micro-colonnes vers l’autre contenant du SPD Pétri préparées à l’étape 1.1.3. Fabriquer des bateaux plus avec les micro-colonnes restantes comme vous le souhaitez.
12. Déplacez les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes ou les bateaux d’une armoire de biosécurité et stériliser à l’exposition aux rayons ultraviolets (UV) pendant 30 min.
    ATTENTION : Porter une protection adéquate pour prévenir l’exposition aux UV.
13. Stocker les plats avec les bateaux micro-colonne au SPD à 4 ° C, si l’addition de l’ECM et le placage de cellule ne produira pas immédiatement par la suite, jusqu'à 1 semaine. Répétez les étapes de la fabrication de micro-colonne si les constructions ne sont pas utilisées pendant cette période.

2. isolement et Culture cellulaire de primaire

1. Isolement des astrocytes corticaux de ratons
   1. Pour préparer les étapes suivantes, ajouter 20 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) à quatre plats de Pétri de 10 cm qui lui serviront de réservoirs pour les tissus disséqués. Garder tous les plats sur la glace. Stériliser ciseaux chirurgicaux propre, pinces, micro-spatule et micro-scalpels dans un stérilisateur de boudin chaud.
   2. Préchauffer la trypsine 0,25 % avec l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM et 0,15 mg/mL par désoxyribonucléase (DNase) I en HBSS à 37 ° C. En outre, Préchauffer le milieu de culture des astrocytes à 37 ° C, qui se compose de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec F-12 mélange du jambon de nutriments et 10 % sérum fœtal (SVF).
   3. Offrir une jour post-natal 0 ou ratons de jour 1 Sprague-Dawley en les exposant aux conditions de l’hypothermie et euthanasier par décapitation. Broche la tête dans un stade à l’aide d’un 19 mm jauge aiguille placée dans le museau devant les yeux.
   4. Faites une incision au scalpel au milieu postérieur à la partie antérieure, de la base du cou jusqu’au juste derrière les yeux. Effectuer une autre incision passant latéralement directement derrière les yeux vers le bas, formant une forme en T. Pince fine permet de retirer la peau/crâne crâne sur le côté.
   5. Maintenez la tête par le museau (vers le haut) en plaçant une branche de la pince dans la bouche de l’animal et l’autre sur la surface extérieure. Enlever le cerveau avec une micro-spatule stérile et placez-le dans un des plats Petri rempli de HBSS réfrigérés. Place ce Pétri sur glace immédiatement après et en tout temps sauf lorsque vous l’utilisez.
   6. Situer un bloc de granit précédemment stocké à-20 ° C au-dessous d’un stéréoscope à l’intérieur d’une hotte de dissection. Place la boîte de Pétri avec le tissu de cerveau sur la surface du bloc de granit pour préserver sa basse température au cours de la procédure de dissection. Servir le stéréoscope de guidage visuel tout au long de la procédure suivante.
   7. Si les bulbes olfactifs restent intacts, les extraire en coupant avec une pince ou microscalpels. En outre, utiliser un microscalpel pour enlever le cervelet et faire une incision médiane qui sépare les deux hémisphères cérébraux. Transférer les hémisphères avec une pince à une boîte de Pétri contenant HBSS fraîches, réfrigérées.
   8. Disséquer les structures mésencéphale depuis l’intérieur des hémisphères avec un microscalpel pour obtenir uniquement le cortex séparées. Utilisez des pinces fines à décoller les méninges, une structure en feuille, du tissu cortical et de transférer le cortex isolé à nouveau Pétri avec froid HBSS. Le microscalpel permet de découper le tissu afin d’augmenter la surface d’action de la trypsine dans l’étape suivante.
   9. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer le cortex dans un tube à centrifuger 15 mL contenant 4 mL de préchauffée trypsine-EDTA (8 cortex dans chaque tube). Exposer le tissu cortical de la trypsine-EDTA pour 5-7 min à 37 ° C.
   10. Avec une pipette Pasteur, soigneusement retirer la trypsine-EDTA et ajouter 400 µl de 0,15 mg/mL DNAse I solution dans le tube à centrifuger. Agiter le tube ou le vortex jusqu'à ce que tous les tissus sont dissocié, et il n’y a aucune pièce de tissu restant dans le liquide. S’il n’est pas possible de dissoudre complètement le tissu, enlever les fragments restants avec la pointe d’une pipette Pasteur.
   11. Centrifuger le tube contenant la solution dissocié de cellules à 200 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant avec une pipette Pasteur sans déranger les cellules. Ajouter 1 mL de milieu de culture des astrocytes (définie à l’étape 2.1.2) dans le tube avec une micropipette et agiter pour remettre en suspension et obtenir une solution homogène.
   12. Transférer 10 mL de milieu de culture astrocyte avec une pipette sérologique dans une fiole de T-75. Ajouter 250 µl de la solution de cellule de 1 mL (préparée à l’étape 2.1.11) avec une micropipette dans le ballon à un cerveau chiot d’une valeur de cellules par flacon sur plaque. Répartir la solution cellule déchargée dans le milieu de culture et agiter doucement le flacon pour mieux promouvoir une répartition uniforme.
   13. Les fioles plaqués dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂humidifié à la culture. Après avoir atteint 24 et 72 h en culture, mécaniquement agiter le flacon pour détacher des types de cellules non adhérentes, telles que des neurones et des oligodendrocytes.
   14. Par la suite, à chacun de ces points, effectuer un changement de support. Tenir le flacon verticalement pour les milieux de culture se trouve sur le fond du flacon, ne couvrant pas les cellules adhérentes. Aspirez le milieu de culture avec une pipette Pasteur, en appuyant sur l’extrémité de la pipette contre le coin en bas du ballon pour éviter l’extraction des cellules. Placer le ballon dans la position horizontale originale et doucement ajouter 10 mL de milieu astrocyte sur les cellules avec une pipette sérologique.
   15. Remettez les fioles dans l’incubateur après chaque changement de support. Après que la confluence de 90 % est atteint, mécaniquement agiter la fiole une fois de plus pour enlever toutes les cellules restantes non adhérents.
   16. Passage les astrocytes en ôtant le milieu de culture avec un vide et une pipette Pasteur. Ajouter 5 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA avec une pipette sérologique sur les cellules adhérentes. Agiter doucement le flacon pour s’assurer que la trypsine couvre toutes les cellules et incuber le ballon pendant 5-7 min à 37 ° C et 5 % de CO₂.
   17. Étancher la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu astrocyte dans les cellules avec une pipette sérologique. Extrait de la solution de la cellule du flacon avec une pipette sérologique et transférez-le dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 3 min.
   18. Retirez le surnageant avec une pipette sérologique et il resuspendre dans 1 mL de milieu de culture des astrocytes. Agiter le tube afin de s’assurer que la solution de la cellule est homogène. Compter le nombre de cellules dans la solution avec un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
       Remarque : Un ballon qui est 90 % anastomosé typiquement donne environ 3 millions d’astrocytes.
   19. Ajouter 10 mL de milieu de culture des astrocytes dans une fiole de T-75. Effectuer une dilution au 1:4 en transférant 250 µl de la solution de la cellule (point 2.1.18) avec une micropipette dans le ballon T-75 contenant déjà le milieu de culture. Agiter doucement pour assurer une distribution cellulaire homogène sur toute la surface du ballon.
   20. Répétez les étapes 2.1.16-2.1.19 chaque fois confluence de 90 % est atteint pour les cellules.
2. Isolement des neurones corticaux de foetus de Rat
   1. Suivre les préparations similaires comme étapes 2.1.1 et 2.1.2, sauf que les médias préchauffées sont des milieux de culture Co, consistant en Neurobasal moyen + Supplément B-27 2 % (pour les neurones), Supplément d’exempt de sérum de la G-5 de 1 % (pour les astrocytes) + 0,25 % L-glutamine.
   2. Euthanasier les rats Sprague-Dawley chronométré-enceintes embryonnaires jour 18 avec asphyxie de dioxyde de carbone et de confirmer la mort par décapitation.
   3. Extraire les foetus de rat et de disséquer le cortex du reste du tissu cérébral en boîtes de Pétri contenant HBSS sur la surface du bloc de granite surgelée, à l’aide d’un stéréoscope pour guidage visuel et ciseaux stérilisés, microscalpel et⁵³ de la pince . Après la dissection successive des chefs, cerveaux, les hémisphères cérébraux et cortex, transférer chaque tissu à un récipient Petri HBSS nouvelle.
   4. Émincer le tissu cortical en fragments plus petits pour augmenter la surface pour la trypsine. Transfert cortex 4-6 avec un Pasteur Pipeter dans un tube contenant 5 mL d’EDTA-trypsine préchauffée et maintenir à 37 ° C, de dissocier le tissu. À 5-7 min manuellement agiter le tube pour mélanger et empêcher l’agglutination du tissu.
   5. Retirez le tube de 37 ° C après 10 min. Comme expliqué précédemment à l’étape 2.1, extraire la trypsine-EDTA et remplacer par 1,8 mL de 0,15 mg/mL solution de DNAse. Par la suite, vortex le tissu jusqu'à la solution apparaît homogène, avec aucun fragment de tissu flottant dans le liquide.
   6. Centrifuger la solution tissus dissociés à 200 x g pendant 3 min. Après avoir retiré le liquide surnageant, resuspendre dans 2 mL de milieu de culture mixte. Compter le nombre de cellules dans cette solution avec un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
      Remarque : Le rendement habituel est de 3,0 à 5,0 x 10⁶ cellules/corticale hémisphère.
   7. Préparer une nouvelle solution de cellule avec une densité de 2,0 à 4,0 x 10⁵ cellules/mL dans les milieux de culture co définies ci-dessus.

3. développement des astrocytes câbles à l’intérieur des Micro-colonnes

1. Fabrication de noyau ECM
   Remarque : L’ECM doit être ajoutée à l’intérieur de l’hydrogel micro-colonnes le même jour où cell semis seront effectué.
   1. À l’intérieur d’une armoire de biosécurité, préparer un 1 mg/mL solution de queue de rat collagène de type I dans le milieu de culture mixte dans un tube de microcentrifuge stérile. Maintenir le tube de microcentrifuge avec la solution ECM sur glace en tout temps sauf lorsqu’il est en cours d’utilisation.
   2. Transférer 1-2 µL de la solution ECM avec une micropipette sur une bande de papier de tournesol pour estimer son pH. Ajouter 1 µL de 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) ou l’acide chlorhydrique (HCl) avec une micropipette pour augmenter ou diminuer le pH de la solution ECM, respectivement et Pipeter de haut en bas pour homogénéiser. Vérifier le pH de nouveau avec une bande de papier de tournesol et ajouter plus acide ou base, si nécessaire, jusqu'à ce que le pH soit stable dans la gamme 7,2 – 7,4.
   3. Déplacez les boîtes de Pétri d’étape 1.2 à une hotte de dissection et déposer 4-5 micro-colonnes ou un bateau avec une pince fine stérile dans un vide et stérile 35 ou 60 mm Pétri. En utilisant le stéréoscope pour orientation, situer la pointe 10 µL d’une micropipette à une extrémité de chaque micro-colonne et aspiration de vider la lumière des bulles d’air et le SPD. Confirmer l’absence de bulles d’air avec le stéréoscope pour s’assurer que l’ECM a ajouté à l’étape suivante puisse s’écouler librement à travers la lumière.
   4. Charger une micropipette P10 avec solution ECM, place les 10 µL Astuce contre une extrémité de l’hydrogel micro-colonnes et fournir suffisamment de solution pour combler la lumière (environ 3-5 µL), observant l’entrée de l’ECM avec le stéréoscope. Pipetter un petit réservoir (2-4 µL) de solution ECM aux deux extrémités de la micro-colonne.
      NOTE : Toujours gérer 4-5 micro-colonnes ou un bateau à la fois pour éviter une longue séchage des constructions, car cela pourrait entraîner la froisser de la structure micro-colonne. Micro-colonnes complètement séchés fixent fermement à la surface de la boîtes de Pétri, qui empêche leur utilisation pour l’ensemencement de la cellule. Impossible d’ajouter des quantités excessives de milieux de culture Co (comme une mesure de l’hydratation) aux micro-colonnes car cela pourrait provoquer l’ECM s’écoule pendant la période d’incubation décrite ci-dessous.
   5. Pipetter médias culture mixte dans un anneau autour de la boîte de Pétri pour fournir un récepteur d’humidité afin d’éviter les colonnes ne se dessèchent pas durant l’incubation. Incuber le plat de Pétri contenant les colonnes micro ECM-contenant à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 1 h à promouvoir la polymérisation du collagène avant d’ajouter les neurones ou les astrocytes.
      Remarque : L’ECM devrait former une couche de revêtement de la surface intérieure de la lumière du creuse, plutôt que d’un noyau solide de ECM englobant l’intérieur, qui peuvent être observés à l’aide du stéréoscope. Si l’ECM forme un noyau, poursuivre la période d’incubation jusqu'à ce que la couche est à gauche. Avec cette couche formée, la solution de cellules astrocytes peut remplir l’intérieur de la micro-colonne dans les étapes de l’électrodéposition.
   6. Au cours de la période d’incubation, préparer la solution de cellule d’astrocyte (comme décrit ci-dessous).
2. Astrocytes et neurones ensemencement dans les Micro-colonnes
   1. Passage des astrocytes plaqués (entre le passage de la quatrième et douzième) comme expliqué dans les étapes 2.1.16-2.1.19. Après avoir compté le nombre de cellules dans la fiole, préparer la solution de cellules à une densité de 9.0-12,0 x 10⁵ cellules/mL de solution suspendue dans les milieux de culture cellulaire.
   2. À l’aide d’un stéréoscope, placer l’extrémité d’une micropipette P10 à une extrémité des micro-colonnes et transférer la solution cellulaire suffisante (~ 5 µL) dans la lumière pour le remplir complètement. Comme ci-dessus avec l’ECM, ajouter des petits réservoirs de solution de la cellule aux deux extrémités de chaque micro-colonne.
   3. Incuber les micro-colonnes plaqués sur les boîtes de Pétri à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 1 h à promouvoir l’attachement des astrocytes à l’ECM. Si les neurones ne seront pas ajoutés aux micro-colonnes, passez à l’étape 3.2.5.
   4. Après la période initiale d’incubation, ajouter 1-2 µL de la solution de neurones corticaux obtenue à l’étape 2.2.7 dans les deux extrémités des micro-colonnes avec une micropipette, tout en observant sous le stéréoscope. Veiller à ce que les médias suffisant sont présent dans les plats pour éviter le séchage et incuber à nouveau pendant 40 min à 37 ° C et 5 % de CO₂ pour permettre l’adhérence des neurones.
      NOTE : Solution de neurones corticaux peut également être ajoutée 1-2 jours après la formation de bundle, exécution étape 3.2.4 après avoir soigneusement enlevé les milieux de culture de la boîte de Pétri avec une micropipette.
   5. Après l’incubation, période, soigneusement remplir les boîtes de Pétri contenant les colonnes micro plaqués avec 3 ou 6 mL de milieux de culture Co pour boîtes de Petri 35 ou 60 mm, respectivement. Maintenir les micro-colonnes plaqués en culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pour promouvoir l’auto-assemblage des faisceaux astrocytaires alignés, qui devraient former une structure groupée, comme câble après 6 à 10 h.
3. Stabilisation de l’Astrocyte câble Architecture
   Remarque : Après la formation de faisceaux, environ 6 à 12 h de culture les constructions, effectuez les opérations suivantes pour empêcher l’effondrement de la structure alignée des astrocytes utilisés.
   1. Dans un tube stérile microcentrifuge, préparer un collagène de queue de rat de 3 mg/mL j’ai solution dans des milieux de culture mixte. Ajuster le pH de la solution à 7,2-7,4 suivant la procédure décrite à l’étape 3.1.2. Maintenir les médias de stock et co-culture de collagène sur la glace quand pas en service et placer la solution de collagène préparés sur la glace en permanence.
   2. Retirez le support de la boîtes de Pétri contenant les échafaudages astrocytaires avec une micropipette, laissant certains médias sur les côtés du plat pour créer un récepteur d’humidité qui assure l’hydratation des micro-colonnes. Placer le plat dans un stéréoscope pour aider à la visualisation.
   3. Avec une micropipette, prendre 2 à 3 µL de solution de collagène et décharge à chaque extrémité des micro-colonnes en utilisant le stéréoscope pour guidage visuel. Assurez-vous que le plat a suffisamment médiatique autour des côtés d’agir comme un réservoir d’humidité sur les bords du plat. Incuber les boîtes de Pétri avec les micro-colonnes pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié pour favoriser la gélification du collagène nouvellement ajouté.
   4. Ajouter lentement les 3 ou 6 mL de milieu de culture Co (35 ou 60 mm Petri plats, respectivement) à la Petri plats avec une pipette et la culture de la vaisselle dans un incubateur humidifié à 37 ^oC et 5 % de CO₂.

4. extraction des astrocytes faisceaux de l’intérieur de l’Hydrogel

1. Stériliser des lamelles de verre dans un autoclave. Préparer une solution de 20 µg/mL de la poly-L-lysine (PLL) dans l’eau de la culture de la qualité cellule stérile.
2. Manuellement à l’intérieur d’une armoire de biosécurité, transférer les lamelles de verre stérilisé dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm et ajouter la solution PLL suffisante pour couvrir les lamelles.
3. Incuber les lamelles, recouvert de la solution de la PLL, pendant 30 min à 37 ° C à recouvrir la surface. Enlever la solution PLL avec une pipette Pasteur après 30 min. Rincer trois fois en ajoutant l’eau qualité de culture cellulaire à la lamelle et retirer avec une pipette Pasteur.
4. Après la formation du faisceau glial aligné, transférer la micro-colonne délicatement dans une boîte de Petri stérile avec une pince fine stérile et ajouter un petit bassin de 10 µL de milieux de culture Co avec une micropipette pour prévenir la déshydratation et assurer la santé bundle. Extrait le bundle astrocytaires l’hydrogel micro-colonne en tirant doucement d’un bout avec une pince chirurgicale stérile, à l’aide d’un stéréoscope pour guidage visuel.
5. Le bundle astrocytaires en tenant avec une pince, monter sur une lamelle de PLL-enduit. Difficulté et tacher avec le protocole ci-dessous.

5. l’immunocytochimie pour des études In Vitro

Remarque : Pour cette étude, les anticorps primaires étaient de lapin anti-acides protéine fibrillaire gliale (GFAP) (1/500), anti-β-tubuline III (1/500) de souris, de lapin anti-collagène I (1/500), souris anti-nestin (1 : 200) et lapin anti-vimentine (1/100). Les anticorps secondaires sont âne anti-souris 568, 568 anti-lapin d’âne, anti-lapin d’âne 488 et anti-souris âne 568 (1/500 pour tous). Dans tous les cas, ajouter un volume suffisant de chaque solution pour couvrir entièrement les micro-colonnes.

1. Préparer une solution de formaldéhyde de volume/volume (v/v) de 4 % à 1 x DPBS à l’intérieur d’une hotte chimique.
   ATTENTION : le formaldéhyde est un composé toxique, connu pour être cancérigènes et doit être jeté dans un récipient séparé. Toujours manipuler ce composé à l’intérieur d’une hotte chimique et d’utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) comme manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants.
2. Dans le cas des micro-colonnes, jeter les milieux de culture, de la vaisselle de Petri contenant les constructions avec une pipette Pasteur sans aspiration accidentellement les cylindres d’hydrogel. Ajouter la solution de formaldéhyde suffisante pour couvrir les micro-colonnes ou les lamelles montés (qui restent sur les boîtes de Pétri) et incuber pendant 35 min à 18-24 ° C.
3. La solution de formaldéhyde de 4,0 % extrait des micro-colonnes fixes ou les lamelles couvre-objet avec une pipette sérologique. Rincez les micro-colonnes fixes trois fois avec du PBS par rapidement en ajoutant et supprimant les PBS deux fois et puis les laisser tremper pour 10 min une troisième fois.
4. Sérum de cheval normal (NHS), dissoudre dans du PBS pour une concentration de 4 % v / c. préparer une solution avec un détergent non ionique à une concentration de 0,3 % v/v à l’aide de la solution de NHS comme solvant.
5. Enlever les PBS de la vaisselle de Petri contenant les colonnes micro ou les lamelles couvre-objet avec une pipette. Ajouter suffisamment 0,3 % solution détergente pour couvrir le micro-colonnes/lamelles pendant 60 min à 18-24 ° C pour permeabilize des cellules.
6. Sortez la solution détergente et rincez rapidement deux fois avec du PBS et trois fois en faisant tremper pendant 5 min. calculer le volume requis de 4 % NHS et chacun des anticorps primaires pour préparer une solution avec les concentrations d’anticorps désiré.
7. Retirer les PBS de la boîtes de Pétri et ajouter suffisamment d’anticorps primaire (dilué dans 4 % NHS-SPD) solution pour couvrir les micro-colonnes ou les faisceaux astrocytaires extraites. Incuber pendant la nuit (12-16 h) à 4 ° C.
8. Souscrire à la solution d’anticorps primaire et rincer rapidement deux fois avec du PBS et trois fois en faisant tremper pendant 5 min chacun. Préparer la solution d’anticorps secondaire, dans l’obscurité, avec chaque anticorps présent à une dilution de 1/500 dans la solution de NHS de 4,0 %.
9. Incuber les cellules avec la solution d’anticorps secondaire pendant 2 h 18 et 24 ° c. Pendant toute la durée de l’incubation, couvrir les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
10. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et ajouter la solution de Hoechst (01:10, 000) pendant 10 min à 18-24 ° C pour colorer les noyaux.
    ATTENTION : Hoechst est un mutagène connu qui devrait être considéré comme une substance cancérogène. Par conséquent, il doit être jeté dans un récipient séparé et EPI doit être utilisé à tout moment lors de la manipulation de cet agent.
11. Rincer avec du PBS cinq fois, à chaque fois pendant 5-10 min. par la suite, stocker les micro-colonnes colorées à 4 ° C dans du PBS et la couverture de papier d’aluminium. Dans le cas des faisceaux astrocytaires montés, ajouter une goutte de milieu de montage aqueux à un forfait, placez une autre lamelle de verre sur le faisceau fixe et scelle les deux lamelles couvre-objet avec vernis à ongles pour stockage à long terme et l’imagerie ultérieur.

6. viabilité dosage avec Live-dead (homodimère de calcéine-AM / d’éthidium) coloration

1. Préparer la solution de réactif en ajoutant 5 μl calcéine AM (4 mM en anhydre diméthyl sulfoxyde (DMSO)) et 20 μl d’éthidium homodimère-1 (EthD-1) (2 mM de DMSO/H₂O 1:4 v/v) à 10 mL de 1 x DPBS. Couvrir la solution avec du papier aluminium ou stocker dans l’obscurité pour le protéger de la lumière.
2. Aspirer les médias de la boîte de Pétri contenant les colonnes micro plaqués avec une pipette Pasteur et ajouter suffisamment de solution (préparé ci-dessus) pour couvrir les constructions. Incuber 30 min à 37 ° C et 5 % CO₂, garder la boîte de Pétri couverts pour protéger la solution de la lumière.
3. Supprimer la solution avec une micropipette ou d’une pipette Pasteur. Rincer 2 - 3 fois avec le SPD comme expliqué dans l’étape 5.3. Inonder les boîtes de Pétri avec SPD selon la taille du plat. Cellules d’image immédiatement après utilisation épifluorescence ou imagerie confocale.
   Remarque : Conversion de la membrane perméable calcéine AM de calcéine par cellules métaboliquement actives donne la fluorescence verte de calcéine. Les cellules mortes sont marqués comme cellules de membrane-compromise, permettant l’entrée de EthD-1 dans la cellule et sa liaison aux acides nucléiques, causant une fluorescence rouge.

Résultats

Au départ, contraste de phase microscopie a été utilisée pour surveiller la progression de la formation groupée et adhérence astrocyte et la stabilité globale de la cytoarchitecture en fonction du temps. À 1 h après l’ensemencement, les astrocytes ont été trouvés tout au long de la lumière des micro-colonnes avec une morphologie sphérique (Figure 2 a). À 5 h, astrocytes a commencé à étendre les processus et passation de marchés, même si après 8 h cellules pré...

Discussion

Par rapport à l’environnement plus favorable de la PNS, le système nerveux central est particulièrement limité pour traiter les conséquences néfastes de neurotraumatologie et neurodégénérescence. Après une grave insulte dans le SNC chez les mammifères, une cicatrice gliale est formée, composé d’un noyau de cellules fibreuses et inflammatoires, entouré d’un réseau dense de désorganisé astrocytes réactifs qui sécrètent axon inhibant l’excroissance des protéoglycanes¹⁴. Cette cicatrice agit comme une...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguille d’acupuncture (300 & micro ; m diamètre)	Lhasa Medical	HS.30x40	Le diamètre peut être modifié en fonction de la taille souhaitée pour la lumière de la micro-colonne.
Boîte de Pétri	Fisher	08772B
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Pipette sérologique jetable en polystyrène	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Tube capillaire en verre Microliter (701 µ ; m)	Fisher	21-170J	Le diamètre peut être modifié en fonction de la taille souhaitée pour la coque de la micro-colonne.
Distributeur d’ampoules à microcaps	Fisher	21-170J	Bulb est livré avec les tubes à microcaps.
Plaque chauffante	Fisher	SP88857200
Barre magnétique	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
Aiguille de calibre 25 mm	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Ciseaux	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Stérilisateur à billes chaudes	Sigma	Z378550-1EA
Stéréoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatule	Fisher	S50821
Queue de rat type I collagène	Corning	354236	Maintenir à 4 º ; C et ne retirer qu’en cas de besoin. Utilisez de la glace pour préserver sa température lors de l’utilisation.
Tube de microcentrifugation	Fisher	02-681-256
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher	SS2661
Acide chlorhydrique (HCl)	Fisher	SA48-1
Papier tournesol	Fisher	09-876-18
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Conserver à 4 º ;C.
0,25 % Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056	Se conserve à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Désoxyribonucléase pancréatique bovine (Dnase) I	Sigma	10104159001	Se conserve à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec mélange de nutriments Ham’s F-12	Gibco	11330-032	Stocker à 4 º ;C.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Se conserve à -20º ;C.
Postnatal jour 0 ou jour 1 Bébés rats Sprague Dawley		Charles River Souche 001
Neurone embryonnaire neurobasal milieu basal	Invitrogen	21103049	Magasin chez 4º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
B-27 sérum sans supplément	Invitrogen	12587010	Se conserve à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Se conserve à -20 º ; C et chaud à 37 º ; C avant utilisation.
G5 supplément astrocytaire	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley jour embryonnaire 18 rats	Charles River	Strain 001
Pipette Pasteur	Fisher	22-042816
15 mL tube à centrifuger	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifugeuse	Fisher	05-413-115
Hémocytomètre	Fisher	02-671-6
Incubateur	Fisher	13 998 076
Formaldéhyde 40 %	Fisher	F77P-4	Le formaldéhyde est un composé toxique connu pour être cancérigène et doit être éliminé dans un contenant séparé.
Housse en verre	Fisher	12-548-5M
Vernis à ongles	Microscopie électronique Sciences (EMS)	72180
Fluoromont support de montage	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Saline tamponnée au phosphate	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Sérum de cheval normal	Gibco	16050-122
Anticorps primaire de la protéine fibrillaire acide gliale de lapin (GFAP)	Millipore	AB5804	Stocker à -20º ;C.
Anticorps primaire anti-bêta-tubuline III de souris	Sigma	T8578	Se conserve à -20º ;C.
Anticorps primaire anti-collagène I de lapin	Abcam	ab34710	Se conserve à -20º ;C.
Lapin anti-vimentine	Millipore	AB3400	Magasin à -20º ;C.
Souris anti-nestin	Millipore	AB5326	Stocker à -20º ;C.
Âne anti-souris 568 anticorps secondaire	Invitrogen	A10037	Stocker chez 4º ;C.
Âne anti-lapin 568 anticorps secondaire	Invitrogen	A10042	Magasin chez 4º ;C.
Âne anti-lapin 488 anticorps secondaire	Invitrogen	A21206	Stocker chez 4º ;C.
Hoechst 33342, Trichlorhydrate	Invitrogen	H3570	Magasinez au 4º ;C. Hoechst est un mutagène connu qui doit être traité comme cancérigène. Par conséquent, il doit être éliminé dans un récipient séparé.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM dans le DMSO anhydre
Homodimère d’éthidium-1	Life Technologies	E1169	2 mM dans le DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Diméthyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Microscope confocal à balayage laser	Nikon		Utilisé pour la prise des reconstructions confocales de constructions immunomarquées.
Microscope Eclipse Ti-S	Nikon		Utilisé pour prendre les images en contraste de phase. Avec acquisition d’images numériques à l’aide d’un appareil photo QiClick interfacé avec le logiciel de recherche de base Nikon Elements (4.10.01).