Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Résumé

Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADNc infectieux à deux plasmides.

Résumé

Les clones d'ADNc infectieux permettent une manipulation génétique d'un virus, facilitant ainsi le travail sur les vaccins, la pathogenèse, la replication, la transmission et l'évolution virale. Nous décrivons ici la construction d'un clone infectieux pour le virus Zika (ZIKV), qui provoque actuellement une épidémie explosive dans les Amériques. Pour éviter toute toxicité pour les bactéries qui sont communément observées avec les plasmides dérivés du flavivirus, nous avons généré un système à deux plasmides qui sépare le génome du gène NS1 et est plus stable que les constructions complètes qui ne peuvent pas être récupérées avec succès sans mutations. Après la digestion et la ligature pour rejoindre les deux fragments, l'ARN viral complet peut être généré par une transcription in vitro avec de l'ARN polymérase T7. Après l'électroporation de l'ARN transcrit dans les cellules, le virus a été récupéré qui a montré une cinétique de croissance in vitro similaire et des phénotypes de virulence et d'infection in vivo chez les souris et les moustiques, respectivement.

Introduction

Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s'est répandue dans les Amériques ¹ . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés ² . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l'hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d'outils moléculaires, entravant ainsi la re....

Protocole

1. Transformer et récupérer des plasmides de clones infectieux

1. Transformez les deux plasmides (séparément) en utilisant un protocole de transformation commercial ( p. Ex . NEB 5 Minute Transformation Protocol) avec quelques modifications. Les deux plasmides contiennent un gène codant pour la résistance à l'ampicilline, utilisent donc l'ampicilline ou la carbénicilline pour la sélection. La carbénicilline est préférée, car elle est plus stable.
   1. Enlevez les cellules (voir la table des matériaux) à partir de un congélateur -80 ° C et dégonflez sur de la glace pendant 5 à 10 minutes. Préchauffer le lysogénie de bouill....

Résultats

Le protocole décrit ici permet la récupération du virus infectieux dérivé du clone Zika. La manipulation du système de clones infectieux à deux plasmides est simple lorsqu'ils sont exécutés avec précaution, par rapport aux versions intégrales très instables (données non représentées). Après la digestion et la ligature des deux pièces distinctes, l'ARN coiffé est produit en utilisant une transcription in vitro avec une polymerase T7 qui est ensuite électroporée d.......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode de récupération d’un système bipartite de clonage d’ADNc infectieux pour le virus Zika. Les clones précédemment décrits pour le ZIKV souffrent d’une atténuation ou nécessitent l’ajout d’introns, ce qui rend les plasmides plus grands et empêche le sauvetage dans les cellules d’insectes. Le virus infectieux peut être récupéré à l’aide du système de clonage à deux plasmides dans des cellules de mammifères ou d’insectes (données non présentées). De plus, le virus récupéré à partir de ce système.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NEB Stable CompetentE. coli	New England BioLabs	C3040H
Carbenicilline, sel disodique	divers
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit	Zymo Research	D4202
SalI-HF	New England BioLabs	R3138S	20 000 unités/ml
NheI-HF	New England BioLabs	R3131S	20 000 unités/ml
ApaLI	New England BioLabs	R0507S	10 000 unités/ml
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	20 000 unités/ml
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S	20 000 unités/ml
HindIII-HF	New England BioLabs	R3104S	20 000 unités/ml
illustra TempliPhi 100 Kit d’amplification	GE Healthcare Life Sciences	25640010
NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage	Macherey-Nagel	740609.5
Crevette Phosphatase alcaline (rSAP)	New England BioLabs	M0371S	1 000 unités/ml
Phosphatase alcaline, veau intestinal (CIP)	New England BioLabs	M0290S	10 000 unités/ml
ADN T4 Ligase	New England BioLabs	M0202S	400 000 unités/mL
HiScribe T7 ARCA Kit ARNm	New England BioLabs	E2065S
Cellules Vero	ATCC	CCL-81
ECM 630 Système d’électroporation à haut débit	BTX	45-0423	D’autres machines sont acceptables.
LB Bouillon à l’agar (Miller)	Sigma	L3147	Peut également être fait maison.
Terrific Broth	Sigma	T0918	Peut également être fait maison.
Boîte de Pétri	Celltreat	229693
Tubes de Culture	VWR International	60818-576
Fioles T75	Celltreat	229340
Fioles T182	Celltreat	229350
1x PBS	Corning	21-040-CV
RPMI 1640 avec L-glutamine	Corning	10-040-CV
DMEM avec L-glutamine et 4,5 g/L de glucose	Corning	10-017-CV
Sérum fœtal bovin (FBS)	Atlas Biologicals	FP-0500-A
Tragacanth Powder	MP Bio	MP 104792
Crystal Violet	Amresco	0528-1006
Ethanol Denatured	VWR International	BDH1156-1LP
Plaque	6 puitsCelltreat	229106
12 plaques de puits	Celltreat	229111
Séquençage Oligos	IDT	voir tableau 1
Qubit 3.0	ThermoFisher	Qubit 3.0	d’autres méthodes sont acceptables.
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher	Q32850	d’autres méthodes sont acceptables.
Qubit RNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32852	d’autres méthodes sont acceptables.
Classe II Enceinte de biosécurité	Varie	S.O	. Ceci est nécessaire pour le travail sur les virus vivants.