Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

Summary

Dans cette méthode, nous utilisons la photopolymérisation et techniques chimie clic pour créer des motifs protéique ou peptidique sur la surface des hydrogels de polyéthylène glycol (PEG), fournissant immobilisée bioactifs signaux pour l’étude des réponses cellulaires in vitro .

Abstract

Il existe de nombreux stimuli biologiques qui peuvent influencer le comportement et les cellules souches la différenciation cellulaire. Cellule générale culture approches reposent sur des facteurs solubles dans le milieu au comportement de cellule de contrôle. Cependant, ajouts solubles ne peuvent imiter certains motifs, tels que matrix-lié aux facteurs de croissance de signalisation, signalisation de cellules et spatiales indices biochimiques, qui sont des influences communes sur les cellules. En outre, les propriétés biophysiques de la matrice, comme la rigidité du substrat, jouent des rôles importants dans le sort de cellule, qui n’est pas facilement manipulé à l’aide de cellules conventionnelles pratiques de culture. Dans cette méthode, les auteurs décrivent un protocole simple pour fournir des protéines bioactives modelés sur hydrogels synthétiques polyéthylène glycol (PEG) à l’aide de la photochimie. Cette plate-forme permet le contrôle indépendant de la rigidité du substrat et des signaux biochimiques spatiales. Ces hydrogels peuvent atteindre un large éventail de valeurs de rigidité physiologiquement pertinents. En outre, les surfaces de ces hydrogels peuvent être photopatterned avec des peptides bioactifs ou protéines par l’intermédiaire de thiol-ene cliquez sur les réactions de chimie. Ces méthodes ont été optimisées afin de conserver la fonction de protéine après l’immobilisation de surface. Il s’agit d’un protocole polyvalent qui peut être appliqué à n’importe quel protéique ou peptidique d’intérêt à créer une variété de modèles. Enfin, les cellules ensemencées sur les surfaces de ces hydrogels bioactifs peuvent être surveillés au fil du temps qu’ils réagissent aux signaux spécifiques dans l’espace.

Introduction

Il y a de nombreux stimuli qui influencent le comportement de la cellule. En général, techniques de culture cellulaire typique dépendent de facteurs solubles pour provoquer des réponses cellulaires ; Cependant, il y a des limites de cette approche. Ces méthodes ne peuvent afficher correctement tous les motifs de signalisation trouves couramment in vivo. Ces mécanismes de signalisation incluent séquestré des facteurs de croissance, signalisation de cellules et les indices biochimiques spécifiques dans l’espace. En outre, rigidité du substrat peut jouer un rôle important dans la différenciation cellulaire comportement et cellules souches et n’est pas facilement manipulée à l’aide de la commune cell culture pratiques^1,2. Biomatériau approches offrent une nouvelle plateforme pour commencer à explorer ces mécanismes de signalisation. En particulier, les hydrogels sont d’excellents candidats pour tuning substrat raideur^3,4, immobilisation des protéines et peptides de^5,6et en créant des profils spécifiques dans l’espace^{7, 8}.

Les hydrogels sont couramment utilisés comme les échafaudages en génie tissulaire en raison de leurs similitudes biochimiques et biophysiques avec la matrice extracellulaire (ECM)^9,10. Polymères naturels sont des choix communs pour les échafaudages, car elles sont biocompatibles et sont retrouvent dans nombreux tissus de l’organisme. La limitation de l’utilisation de polymères naturels comme substrats est qu’ils manquent des fractions chimiques facilement manipulables pour bioconjugaison. En revanche, hydrogels synthétiques, ainsi que PEG, sont excellentes plates-formes pour chimies ciblées^11,12. En outre, PEG hydrogels ne pas susciter une réaction cellulaire et donc sont utilisés comme des backbones inertes pour créer des échafaudages bioactifs.

Pour créer des hydrogels bioactifs, photopolymérisation et thiol-ene cliquez sur chimie réactions sont employées. Ces photoréactions nécessitent un photo-initiateur et une source de lumière UV. Lorsque photoamorceurs sont introduits à la lumière UV, obligations casser aux radicaux de la forme. Radicaux de thèses sont nécessaires pour initier la réaction mais peuvent compromettre la bioactivité de protéine^12,13. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser photo-initiateur et temps d’exposition UV à maintenir la bioactivité de la protéine.

Dans cette méthode, hydrogels sont synthétisés par le biais de l’acrylate d’éthyle-acrylate chaîne croissance photopolymérisation. PEG-diacrylate (PEGDA) monomères réagissent entre eux pour former des réseaux de polymères ramifiés responsable de la structure de l’hydrogel. La concentration des monomères PEGDA au sein de la solution de gel précurseur contrôlera la rigidité du substrat. En raison de la petite taille de l’hydrogel de pore, protéines ECM comme la fibronectine peuvent être facilement intégrés au sein de l’hydrogel aux fins de la fixation des cellules. Enfin, ces hydrogels peut être surface à motifs avec des peptides bioactifs ou protéines par l’intermédiaire de thiol-ene cliquez sur les réactions de chimie. Ici, n’ayant pas réagis acrylates libres au sein du système d’hydrogel réagira avec les thiols libres situés sur la protéine ou peptide lorsqu’il est exposé à la lumière UV. Après que les protéines ou les peptides sont immobilisées sur la surface de l’hydrogel, l’hydrogel peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines sans perdre la bioactivité. Ceci offre la commodité, la planification expérimentale flexibles et la possibilité d’une collaboration entre les laboratoires. Dans l’ensemble, cette plate-forme permet de contrôle biochimique biomécanique et spatial, indépendant des uns des autres, pour l’occasion d’influer sur le comportement cellulaire.

Protocol

1. préparation du matériel pour la synthèse de l’Hydrogel

1. préparation des solutions mères PEGDA lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) et la fibronectine dans des conditions stériles et basé sur calculs (tableau 1).
   1. Peser et dissoudre des composés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). En règle générale, maintenir PEGDA travail de concentration de la solution entre 50 et 200 mg/mL (5 à 20 % poids/volume). Déposer la solution PEGDA à travers un filtre de seringue de 0,22 µm pour la stérilisation.
      NOTE : Conserver les solutions PEGDA, couvertes d’un papier d’emballage pour les protéger de la lumière. Préparer une nouvelle solution de PEGDA (recommandé) pour chaque expérience.
   2. Reconstituer la fibronectine protéine poudre basée sur le fabricant ' Recommandation s. Maintenir la solution mère de fibronectine à 1 mg/mL, aliquote dans 60 à 100 µL d’extraits et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Décongeler les aliquotes à 4 ° C pendant plusieurs heures ou toute la nuit avant leur utilisation. Si le stock de protéines n’est pas déjà prévu dans des conditions stériles, utiliser une seringue-filtre de 0,22 µm pour la stérilisation.
      Remarque : La fibronectine est utilisée pour la fixation des cellules. Autres protéines ECM peuvent être substitués.
   3. Peser au tour de la solution mère et dissoudre dans du PBS ; une concentration stock typique est de 25 mg/mL. Laisser agir si il n’y a aucun problème avec le dissolvant. Passer la solution à travers un filtre de 0,22 µm pour la stérilisation. Couvrir le tour avec un emballage de papier d’aluminium et le conserver à 4 ° C pendant plusieurs mois.
      NOTE : LAP est le photo-initiateur utilisé pour la photochimie.
2. Préparer des moules de diapositive de verre stériles pour la formation de l’hydrogel. Feuille de
   1. autoclave un polyester ; on est nécessaire pour chaque moule de gel. Faites tremper deux lames de verre et trois entretoises en plastique (épaisseur 0,5 mm) pour chaque moule de gel dans l’éthanol à 70 % pendant au moins 2 h, mais généralement, laissez-les tremper toute la nuit. Faire tremper cinq clips liant pour chaque moule de gel dans l’éthanol à 70 % pour 10 min avant de l’utiliser.
   2. Placer les lames de verre, des entretoises et clips de liant sur une petite feuille stérilisés à l’autoclave dans la hotte de culture cellulaire pour les laisser à l’air sec pendant plusieurs heures.
   3. Moules hydrogel Prepare en plaçant des entretoises en plastique sur le pourtour d’une lame de verre. Placer la deuxième lame de verre sur le dessus. Fixer les entretoises étroitement juxtaposées avec des clips de liant, deux sur chaque côté le plus long et l’autre sur le dessus.
      Remarque : Si ce n’est pas correctement assemblé, la solution de gel fuira.
   4. Surface-stériliser le moule avec la culture cellulaire hotte ultraviolets pour 30 min avant de l’utiliser. A mi-parcours, flip le moule pour exposer les deux surfaces.

2. Modification des protéines avec un Thiol libre

1. préparer les solutions à l’aide de calculs de la feuille de calcul pour la conversion des amine en thiols des protéines (tableau 1).
   1. Faire le tampon de réaction, régler les PBS à pH 8 et ajouter 5 mM EDTA. Tampon de réaction pipette dans une seringue-filtre de 0,22 µm pour la stérilisation.
      NOTE : EDTA est important, car il protège les thiols de former des ponts disulfures. Des groupements thiol doivent rester sous leur forme réduite à la réaction.
   2. Peser 2-iminothiolane (Traut ' s réactif) et dissoudre dans le tampon de réaction pour une concentration de la solution mère de 2 mg/mL (14 mM). Passer la solution à travers un filtre de seringue de 0,22 µm pour la stérilisation. Stocker la solution-mère à 4 ° C pendant plusieurs mois.
      Remarque : le 2-iminothiolane est la molécule qui réagit avec les amines libres exposés au solvant sur les protéines et les convertit en thiols libres.
   3. Reconstituer la protéine dans un tampon de réaction à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mg/mL. À moins que précédemment stérile, déposer cette solution à travers un filtre de seringue de 0,22 µm pour la stérilisation.
      Remarque : Cette protéine est le signal biochimique qui va être modelé sur la surface de l’hydrogel. En outre, alors que les concentrations de protéine peuvent varier, des concentrations plus élevées sont idéales pour les profils protéiques plus forts.
2. Réagir la protéine avec le 2-iminothiolane en mélangeant les deux solutions mères ; tableau 1 b permet de calculer le ratio volume correct. En général, utiliser un rapport molaire de 8:1 2-iminothiolane à protéine.
   Remarque : Pour plus de protéines ou plus diluer les concentrations, utiliser un rapport molaire supérieur de 2-iminothiolane. Référence du fabricant ' s protocole ¹⁵.
3. Incuber la réaction pendant 1 h à température ambiante. Utilisez une micro-colonne dessalement pour supprimer le produit protéique THIOLÉS de réactifs restants, après le fabricant ' s protocole ¹⁶.
   Remarque : La limite de l’exclusion de cette résine est 5 KDa.
4. Utilisation Ellman ' s d’analyse pour mesurer quantitativement le nombre de thiols libres par protéine. Suivez le fabricant ' protocole de s pour le test ¹⁷.

3. Hydrogel Formation

1. crée la base de la solution de précurseur de gel sur les valeurs calculées à partir de Table 1. Mélanger ensemble la PEGDA, la fibronectine et volumes LAP. Déposer la solution vigoureusement pour garantir une solution homogène, mais éviter de créer des bulles. Conserver la solution à l’abri de la lumière.
2. Distribuer la solution de précurseur de gel avec soin entre les diapositives de deux lentilles en verre de la moulure de gel. En général, ajouter un volume compris entre 800 et 1 000 µL au moule. Exposer la solution de gel dans le moule à la lumière UV (longueur d’onde : 365 nm, puissance : 3-4 mW/cm ²) pendant 1-2 min former l’hydrogel.
   NOTE : Ne pas exposer l’hydrogel aux rayons ultraviolets prolongée, limiter la protéine de surface capacités le patterning.
3. Enlever les clips de liant et retirez doucement la lame de verre haut de la page en appliquant en face de la pression sur les entretoises de deux côté.
4. Utiliser un coup de poing de calibre approprié biopsie pour découper les échantillons d’hydrogel. Poinçonner des hydrogels multiples depuis le rectangle de gel pour servir de répétitions et d’échantillons de contrôle.

4. Les mesures de rigidité hydrogel

1. Punch out hydrogels avec un 8 mm de diamètre biopsie punch pour un rhéomètre de plaques parallèles de 8 mm. Charger un hydrogel échantillon dans le rhéomètre (voir la Table des matières).
2. Bas la géométrie des plaques parallèles c'est-à-dire 8 mm de diamètre jusqu'à la prise de contact avec la surface du gel. Gardez une distance d’écart de 0,5 mm pour un échantillon de 0,5 mm d’épaisseur hydrogel.
3. Balaie temps effectuer pendant 5 min à 0,1 % de déformation, fréquences de 0,1 Hz et 37 ° C. moyenne du G ' les valeurs dans chaque balayage de temps. Exécuter des hydrogels indépendants pour les répétitions de chaque composition.
   Remarque : Le G ' valeurs devraient être stables dans l’ensemble de points dans le temps ; Si elles ne sont pas, pour cent de la souche et balayage de fréquence doit être effectuée pour sélectionner le cas échéant les valeurs ¹⁴.

5. Structuration des protéines

1. Prepare le motif désiré pour la photolithographie à l’aide d’un programme de conception assistée par ordinateur. Imprimer le masque photographique sur une feuille transparente à l’aide d’une imprimante haute résolution. Faire tremper le photomasque dans l’éthanol à 70 % pour 10 min avant de l’utiliser. Laissez la photolithographie à l’air sec sous une hotte de culture cellulaire avant l’utilisation.
2. Ajouter la solution de protéines THIOLÉS préparée à l’étape 2 à la surface de l’hydrogel pour la structuration de surface. Pipetter 1-2 µL/cm ² de THIOLÉS solution de protéine à la surface de chaque gel découpe.
   Remarque : Il est important de minimiser le volume de la protéine ; Ajouter seulement assez pour couvrir uniformément toute la surface de l’échantillon de l’hydrogel.
3. Placer soigneusement le photomasque sur la surface de l’hydrogel. Ne pas laisser de bulles d’air entre le photomasque et la surface de l’hydrogel. Appuyer doucement sur le masque pour enlever les bulles qui se forment.
4. Exposer l’hydrogel à un deuxième tour de lumière UV (longueur d’onde : 365 nm, puissance : 3-4 mW/cm ²) pour 30 à 60 s.
   Remarque : Il est important de l’exposition le modèle à assez de lumière UV pour créer un modèle solide sans provoquer la perte de fonction de protéine.
5. Laver les hydrogels avec PBS pour retirer des espèces n’ayant pas réagis et placer chaque hydrogel au sein de la plaque bien. Soyez prudent lorsque vous placez les gels dans chaque puits ; Assurez-vous que la surface à motifs est face vers le haut. Laver les gels dans du PBS à 4 ° C ; les gels sont stables pendant au moins deux semaines à 4 ° C.

6. Préparation des Hydrogels pour l’ensemencement de la cellule

1. Incuber les gels dans le milieu de base pendant 5-10 min à 37 ° C avant le semis. Pour les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), utiliser le milieu EGM-2 sans facteurs de croissance. Réduire le volume de liquide ajouté à chaque bien d’empêcher hydrogel flottant. Pour une plaque de 48 puits, utiliser un volume de 250 µL de milieu.
2. Spin vers le bas de la plaque à 300 x g pendant 3 min pour que les hydrogels sont situés au fond du puits et ne flottent pas. Cela immédiatement avant l’ensemencement de la cellule.

7. Semis sur Hydrogels de cellules

1. utilisation des procédures de culture des cellules de mammifères stérile standard pour l’ensemencement de la cellule et les procédures expérimentales. Retirer les flacons de culture de tissus à l’aide de protocoles de détachement cellulaire standard HUVECs. Laver le plat de culture tissulaire avec du PBS stérile et incuber à la trypsine pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
2. Étancher la suspension cellulaire trypsine avec cellule excédentaire moyen ou la trypsine neutralisant solution.
3. Spin down la suspension cellulaire dans la centrifugeuse à 300 g pour 5 min. avec précaution Retirez le surnageant et garder le culot cellulaire.
4. Resuspendre le culot dans basale EGM-2 sans facteur de croissance. Utiliser un hémocytomètre pour le comptage cellulaire.
5. Ajouter 75 000 cellules/cm ² pour chaque hydrogel surface par pipetage lentement dans le centre de chaque bien de manière à ne pas déranger les gels. Placer la plaque bien dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C. Pour plusieurs jours, périodiquement, retirer le plat pour observation.

8. Évaluation de la bioactivité

1. Culture de e. coli du jour au lendemain en suspension dans un bouillon LB dans une suspension orbitale à 37 ° C et 200 tr/min. Tournez en bas la culture d’e. coli, décanter et reconstituer le culot cellulaire dans un volume minimal de PBS. Peser le lysozyme et de reconstituer à 1 mg/mL de la solution mère.
2. Distribuer un petit volume (25 µL) de solution mère de lysozyme dans des tubes de microcentrifuge. Ajouter des niveaux variables de LAP photoinitiateur (0-12 mM) et d’exposer les échantillons à 1 min de la lumière UV. Dans un groupe distinct, ajouter la même quantité de LAP (2 mM) à la solution de lysozyme et exposer des échantillons à divers moments de lumière UV (0-4 min). Inclure les répétitions pour chaque traitement.
Solution de
3. volume égal d’ajouter du concentré d’e. coli dans chaque échantillon de lysozyme pour une concentration de protéines de lysozyme final de 0,5 mg/mL. Incuber les solutions mixtes de 4 h à température ambiante.
   NOTE : Cela permet à temps pour le lysozyme fonctionnelle à la lyse de la paroi cellulaire bactérienne et libèrent des protéines dans la solution.
4. Utiliser non traitée lysozyme incubé à e. coli pour un contrôle positif ; pensez-y une mesure bioactifs de 100 %. Utiliser la solution de lysozyme incubée avec du PBS seul comme témoin négatif.
5. Spin down les échantillons pour éliminer les débris cellulaires et garder le liquide surnageant. Exécuter une analyse de Bradford pour quantifier la concentration totale de protéine dans le surnageant pour mesurer la quantité de lysat bactérien.
6. Exécuter une analyse de Bradford suivant le fabricant ' s protocole ¹⁸. Calculer le giron change dans la concentration de protéines comparée au témoin négatif.

Results

Le protocole pour créer des motifs bioactifs sur la surface des hydrogels PEG est illustré à la Figure 1. Une feuille de calcul a été développé pour calculer le volume et la concentration de chaque solution mère (tableau 1). Protéines pour être immobilisé sur la surface de l’hydrogel sont complétés par le 2-iminothiolane (Figure 1B). Cette réaction est effectuée en utilisant les volumes du

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour créer des profils de protéines bioactives pour applications biologiques. Il y a plusieurs modifications qui peuvent être faites pour adapter ce protocole pour différentes expériences. Tout d’abord, les exigences de raccordement cellule variera pour différents types de cellules. Si on observe initialement fixation des cellules pauvres pour les gels, augmentation de la concentration de la protéine de l’ECM dans la solution de précurseur est conseillé. Autres protéines ECM peuvent être ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Peut également être synthétisé ou acheté auprès d’autres vendeurs. Différents poids moléculaires peuvent être utilisés.
Lithium Phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)			Synthétisé en laboratoire
Fibronectine	Corning	356008	D’autres protéines de fixation cellulaire peuvent être utilisées, telles que la laminine, le matrigel
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Impressions personnalisées sur des feuilles transparentes avec DPI haute résolution.
Pinces à reliure	Divers fournisseurs
Source de lumière UV compacte (365nm)	UVP	UVP-21	D’autres sources de lumière UV peuvent être utilisées, un étalonnage de la puissance est requis.
2-iminothiolane (Pierce Traut' s Réactif)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Réactif : DTNB ; 5,5-dithio-bis(acide 2-nitrobenzoïque)	Thermo Sci.	22582
cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs)	Lonza		entre 6 et 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 sans facteurs de croissance a été utilisé dans les expériences. Un média EGM-2 complet a été utilisé pour le maintien des cellules
0,25 % Trypsine EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralisateur de trypsine	Life Tech	R-002-100
Centrifugeuse	Divers fournisseurs
Hémocytomètre	Hausser Sci. Acide
éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22 et micro ; m filter	Cell Treat	229743
1mL Seringue
Verre Lames de microscope	Fisher Sci.	12-550C
Entretoises en plastique	Divers Venders		0,5 mm d’épaisseur
70 % Éthanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent  ;	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Colonnes Microspin	Thermo Sci.
réhometer AR-G2	TA Instruments