Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

Summary

Dans cette méthode, nous utilisons la photopolymérisation et techniques chimie clic pour créer des motifs protéique ou peptidique sur la surface des hydrogels de polyéthylène glycol (PEG), fournissant immobilisée bioactifs signaux pour l’étude des réponses cellulaires in vitro .

Abstract

Il existe de nombreux stimuli biologiques qui peuvent influencer le comportement et les cellules souches la différenciation cellulaire. Cellule générale culture approches reposent sur des facteurs solubles dans le milieu au comportement de cellule de contrôle. Cependant, ajouts solubles ne peuvent imiter certains motifs, tels que matrix-lié aux facteurs de croissance de signalisation, signalisation de cellules et spatiales indices biochimiques, qui sont des influences communes sur les cellules. En outre, les propriétés biophysiques de la matrice, comme la rigidité du substrat, jouent des rôles importants dans le sort de cellule, qui n’est pas facilement manipulé à l’aide de cellules conventionnelles pratiques de culture. Dans cette méthode, les auteurs décrivent un protocole simple pour fournir des protéines bioactives modelés sur hydrogels synthétiques polyéthylène glycol (PEG) à l’aide de la photochimie. Cette plate-forme permet le contrôle indépendant de la rigidité du substrat et des signaux biochimiques spatiales. Ces hydrogels peuvent atteindre un large éventail de valeurs de rigidité physiologiquement pertinents. En outre, les surfaces de ces hydrogels peuvent être photopatterned avec des peptides bioactifs ou protéines par l’intermédiaire de thiol-ene cliquez sur les réactions de chimie. Ces méthodes ont été optimisées afin de conserver la fonction de protéine après l’immobilisation de surface. Il s’agit d’un protocole polyvalent qui peut être appliqué à n’importe quel protéique ou peptidique d’intérêt à créer une variété de modèles. Enfin, les cellules ensemencées sur les surfaces de ces hydrogels bioactifs peuvent être surveillés au fil du temps qu’ils réagissent aux signaux spécifiques dans l’espace.

Introduction

Il y a de nombreux stimuli qui influencent le comportement de la cellule. En général, techniques de culture cellulaire typique dépendent de facteurs solubles pour provoquer des réponses cellulaires ; Cependant, il y a des limites de cette approche. Ces méthodes ne peuvent afficher correctement tous les motifs de signalisation trouves couramment in vivo. Ces mécanismes de signalisation incluent séquestré des facteurs de croissance, signalisation de cellules et les indices biochimiques spécifiques dans l’espace. En outre, rigidité du substrat peut jouer un rôle important dans la différenciation cellulaire comportement et cellules souches et n’est pas facilement....

Protocol

1. préparation du matériel pour la synthèse de l’Hydrogel

1. préparation des solutions mères PEGDA lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) et la fibronectine dans des conditions stériles et basé sur calculs (tableau 1).
   1. Peser et dissoudre des composés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). En règle générale, maintenir PEGDA travail de concentration de la solution entre 50 et 200 mg/mL (5 à 20 % poids/volume). Déposer la solution PEGDA à travers un filtre de seringue de 0,22 µm pour la stérilisation.
      NOTE : Conserver les solutions PEGDA, couvertes d’un papier d’emballage pour les protéger de la lu....

Results

Le protocole pour créer des motifs bioactifs sur la surface des hydrogels PEG est illustré à la Figure 1. Une feuille de calcul a été développé pour calculer le volume et la concentration de chaque solution mère (tableau 1). Protéines pour être immobilisé sur la surface de l’hydrogel sont complétés par le 2-iminothiolane (Figure 1B). Cette réaction est effectuée en utilisant les volumes du

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour créer des profils de protéines bioactives pour applications biologiques. Il y a plusieurs modifications qui peuvent être faites pour adapter ce protocole pour différentes expériences. Tout d’abord, les exigences de raccordement cellule variera pour différents types de cellules. Si on observe initialement fixation des cellules pauvres pour les gels, augmentation de la concentration de la protéine de l’ECM dans la solution de précurseur est conseillé. Autres protéines ECM peuvent être .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Peut également être synthétisé ou acheté auprès d’autres vendeurs. Différents poids moléculaires peuvent être utilisés.
Lithium Phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)			Synthétisé en laboratoire
Fibronectine	Corning	356008	D’autres protéines de fixation cellulaire peuvent être utilisées, telles que la laminine, le matrigel
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Impressions personnalisées sur des feuilles transparentes avec DPI haute résolution.
Pinces à reliure	Divers fournisseurs
Source de lumière UV compacte (365nm)	UVP	UVP-21	D’autres sources de lumière UV peuvent être utilisées, un étalonnage de la puissance est requis.
2-iminothiolane (Pierce Traut' s Réactif)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Réactif : DTNB ; 5,5-dithio-bis(acide 2-nitrobenzoïque)	Thermo Sci.	22582
cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs)	Lonza		entre 6 et 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 sans facteurs de croissance a été utilisé dans les expériences. Un média EGM-2 complet a été utilisé pour le maintien des cellules
0,25 % Trypsine EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralisateur de trypsine	Life Tech	R-002-100
Centrifugeuse	Divers fournisseurs
Hémocytomètre	Hausser Sci. Acide
éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22 et micro ; m filter	Cell Treat	229743
1mL Seringue
Verre Lames de microscope	Fisher Sci.	12-550C
Entretoises en plastique	Divers Venders		0,5 mm d’épaisseur
70 % Éthanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent  ;	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Colonnes Microspin	Thermo Sci.
réhometer AR-G2	TA Instruments