Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

Résumé

La présente méthode sert à identifier les inhibiteurs de l’isoforme spécifique des histones désacétylases (HDAC) dans les cellules HeLa par l’analyse UHPLC-MS de plusieurs substrats. Il s’agit d’une méthode sans anticorps mis au point afin de tenir compte de l’activité HDAC1 et HDAC6 dans la vie cellule environnement, contrairement à l’isoforme unique acellulaire dosages.

Résumé

La recherche de nouveaux inhibiteurs d’histone désacétylase (HDAC) est d’un intérêt croissant pour la découverte de médicaments. Sélectivité de l’isoforme a été sous le feu des projecteurs depuis l’approbation du romidepsin, une classe j’ai HDAC inhibiteur pour le traitement du cancer et l’investigation clinique des inhibiteurs de HDAC6 spécifiques pour le myélome multiple. La présente méthode sert à déterminer l’activité inhibitrice des composés d’essai sur HDAC1 et HDAC6 dans les cellules. L’activité de l’isoforme est mesurée à l’aide de la chromatographie liquide à ultra performant – analyse de spectrométrie de masse (UHPLC-MS) des substrats spécifiques incubées en présence de cellules HeLa traitées et non traitées. La méthode a l’avantage de refléter l’activité HDAC endogène dans l’environnement de la cellule, à la différence des épreuves biochimiques acellulaires menées sur les isoformes isolés. En outre, parce qu’elle est fondée sur la quantification des substrats synthétiques, la méthode ne requiert pas la reconnaissance d’anticorps des protéines endogènes d’acétylés. Il est facilement adaptable à plusieurs lignées cellulaires et un processus automatisé. La méthode a déjà prouvé utile dans la recherche de composés HDAC6 sélectif en neuroblastes. Résultats représentatifs sont montrées ici avec le standard HDAC inhibiteurs trichostatine A (non spécifiques), MS275 (HDAC1-spécifique), et tubastatin un HDAC6 (spécifique) à l’aide de cellules HeLa.

Introduction

HDAC appartiennent à une famille d’enzymes capables de deacetylate des histones au sein de la structure de la chromatine. Aussi, ils ont d’autres substrats protéiques dans le cytosol et sont situés dans divers compartiments de la cellule. Un total de 18 HDAC isoformes ont été identifiés à ce jour et ont été associés à plusieurs mécanismes de la cellule, y compris la réglementation des facteurs de transcription et l’expression des gènes, ainsi que la signalisation de cellules et transport^1,2,3,4,5,

Protocole

1. Culture cellulaire

Remarque : Les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte de vitroplants standard. Familiarité avec la technique de stérilisation est prévue.

1. La culture de cellules HeLa à confluence de 80 % dans un flacon de culture cellulaire T75 dans MEM additionné de 10 % sérum de veau fœtal, la pénicilline G (100 U/mL) et à la streptomycine (100 mg/mL).
   NOTE : Culture cellulaire, le traitement et mesures de lyse sont menées sous flux laminaire, avec les étapes d’incubation de cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ dans des conditions stériles.
2. Laver les cellules deux....

Résultats

Pour illustrer l’application de la méthode pour identifier des inhibiteurs non sélectifs et sélectifs pour HDAC1 (classe I) et HDAC6 (classe IIb), les cellules HeLa ont été traités avec des composés standards connus : trichostatine A (non sélectif entre HDAC1 et HDAC6)¹⁸, MS275 (inhibiteur sélectif HDAC1)¹⁹et tubastatin (inhibiteur sélectif de HDAC6)²⁰. À l’aide de la méthode actuelle (Figure 1

Discussion

HDAC l’inhibition est un sujet brûlant dans la découverte de médicaments, avec un accent mis sur les inhibiteurs sélectifs HDAC6 pour cancer thérapie²¹. Sélectivité des HDAC est habituellement évaluée par une série d’épreuves de haut-débit, acellulaire, qui ont l’intention de déterminer la puissance inhibitrice vers individuels HDAC isoformes²¹. Cependant, la sélectivité d’un inhibiteur doit être confirmée par ailleurs dans les cellules vivantes en évaluant le statut d’acét.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Synonyme : BOC-AC-LYS-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatine A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubatatine A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acétonitrile, grade HPLC	Fisher Scientific	10660131
Acide formique, grade LC/MS	Fisher Scientific	10596814
H2O, grade			distillé H2O filtré par un système de purification Milli-Q
Cellules ATCC	ATCC	CRM-CCL-2
Dissociation cellulaire réactif TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, qualité culture cellulaire	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Sérum fœtal bovin	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Pénicilline-Streptomycine	Bioconcept	4-01F00-H
10x tampon RIPA	Abcam	ab156034
SigmaFast comprimés inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	S8820
Plaques à 96 puits, stériles, à fond plat, traitées pour culture tissulaire Corning	VWR	29442-058
Plaques à 96 puits, non stériles, à fond en V Corning	VWR	29442-404	utilisées dans l’étape de centrifugation
Plaque 96 puits, fond conique, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible avec le système UHPLC Acquity
Fioles de culture cellulaire T75 Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Feuille thermosoudable pelable	Waters	186002789
Système UPLC	Acquity Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Logiciel d’intégration : MassLynx V4.1	Waters		Numéro de catalogue non disponible
Thermosoudeuse combi SP-0669/240	Waters		Numéro de catalogue non disponible
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Numéro de catalogue non disponible

HPLC