Article de méthode
Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.
L' électroporation in utero est une approche rapide et puissante pour étudier le processus de migration radiale dans le cortex cérébral du développement d'embryons de souris. Il a aidé à décrire les différentes étapes de la migration radiale et à caractériser les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce processus. Pour analyser directement et dynamiquement les neurones migrateurs, ils doivent être tracés dans le temps. Ce protocole décrit un flux de travail qui combine l' électroporation utérotique avec la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle, ce qui permet un examen direct et une analyse dynamique des neurones corticaux migrant radialement. En outre, une caractérisation détaillée des neurones migrateurs, tels que la vitesse de migration, les profils de vitesse, ainsi que les changements d'orientation radiale, est possible. La méthode peut facilement être adaptée pour effectuer des analyses fonctionnelles de gènes d'intérêt pour la migration radiale des neurones corticaux par perte et gain de fonction ainsi que des expériences de sauvetage. Laps de tempsL'imagerie des neurones migrateurs est une technique de pointe qui, une fois établie, est un outil puissant pour étudier le développement du cortex cérébral dans les modèles de souris des troubles de la migration neuronale.
Le néocortex est le principal site de fonctions cognitives, émotionnelles et sensoriomotrices. Il est composé de six couches horizontales orientées parallèlement à la surface du cerveau. Au cours du développement, les cellules progénitrices dans la paroi latérale du télencephalon dorsal donnent lieu à des neurones de projection qui migrent radialement vers la surface du pial et qui acquièrent une identité neuronale spécifique au type de couche. Après avoir été généré dans les zones ventriculaires / subventriculaires (VZ / SVZ), ces neurones deviennent transitoirement multipolaires et ralentissent leur migration. Après un court séjour dans la zone intermédiaire (IZ), ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité du bien-être animal (Regierungspräsidium Tübingen) et effectuées conformément à la loi allemande sur le bien-être animal et à la directive européenne 2010/63 / UE.
1. Dans Utero Electroporation
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Auparavant, nous avons montré que la suppression génétique de Bcl11a par l' électroporation in uuer altère la migration radiale des neurones de projection de la couche supérieure tardive 10 . L'électroporation d'un vecteur plasmidique d'ADN contenant Cre-IRES-GFP supprimé efficacement Bcl11a dans des cerveaux BCL11a flox / flox conditionnels 11 . Lorsq.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
La migration radiale est un processus clé dans le développement de neocortex. Les mutations dans les gènes affectant différentes étapes de ce processus peuvent provoquer des malformations corticales sévères, y compris lissencéphalie et hétérotopie blanche 1 , 2 . Nous avons récemment montré que Bcl11a, qui s'exprime dans les jeunes neurones de projection corticale migratoire, joue un rôle dans la migration radiale. Nous avons utilisé une imagerie confocale t.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Nous remercions Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka et Matthias Toberer pour une excellente assistance technique, ainsi que Victor Tarabykin pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| isoflurane | Laboratoires Abbott ; | 506949 | Forene |
| Plaque 6 puits | Corning | 351146 | |
| Plaque 12 puits | Corning | 351143 | |
| suture chirurgicale non résorbable | Ethicon | K890H | 3/8 cercle, 13 mm, pointe conique |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | dentelée, longueur : 12 cm |
| ciseaux fins | Fine Science Tools | 14063-09 | incliné sur le côté, longueur : 9 cm |
| Porte-aiguille Mathieu | Fine Science Tools | 12510-14 | carbure de tungstène, longueur : 14 cm |
| Pince à pointe fine | Fine Science Tools | 11370-40 | droite, 11 cm |
| Vannas Tü ; bingen Ciseaux à ressort | Fine Science Tools | 15005-08 | coudé vers le haut, 9,5 cm |
| pince à anneau | Fine Science Tools | 11103-09 | OD : 3 mm, ID, 2,2 mm, longueur : 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| sérum de cheval | Gibco | ||
| BME | Gibco | 41010026 | |
| capillaires en verre borosilicaté | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm |
| système d’anesthésie | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| chambre d’anesthésie | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| cartouche filtrante fluosorber | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| agarose à faible point de fusion | Invitrogen | 16520100 | |
| microscope à lame vibrante | Leica | VT1200 S | |
| stéréomicroscope à fluorescence | Leica | M205 FA | |
| Leica | M125 | ||
| Microscope de culture tissulaire à fluorescence inversée | Leica | DM IL LED | |
| microscope confocal à balayage laser | Détecteur hybride Leica | TCS SP5II | |
| Leica | HyD | ||
| , 40x/0,60 NA | Leica | 11506201 | |
| système de contrôle de la température | Life Imaging Services | Cube, Brick & Insert | |
| Millipore | PICM0RG50 | ||
| microbroyeur | Narishige | EG-45 | utiliser un angle de 38° ; pour le biseautage |
| du micro-injecteur | Parker Hannifin ; | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofène | Pfizer Santé animale | NDC 61106-8507 | |
| Moule emdedding | Polysciences | 18986-1 | |
| maxi kit plasmide sans endotoxines | Qiagen | 12362 | |
| vert rapide | Sigma | F7252 | |
| laminine | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| chlorure de calcium | Sigma | C7902 | |
| sulfate | de magnésium Sigma | M2643 | |
| sodium | Sigma | S6297 | |
| électroporateur à ondes carrées | Sonidel | CUY21EDIT | |
| pince à épiler avec électrodes à disque en platine de 5 mm | Sonidel | CUY650P5 | |
| Sutter Instrument | P-97 | ||
| à filament de boîte | Sutter Instrument | FB255B | de 2,5 mm x 2,5 mm |
| VWR | 231-0191 | de 185 mm x 5 mm | |
| , World | Precision Instruments | de 50 mmRéf. FD5040-100 |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation