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Article de méthode

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

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DOI :

10.3791/55913

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12 juillet 2017

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1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Résumé

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été l'une des méthodes de choix pour isoler les populations enrichies de cellules germinales testiculaires de mammifères. Actuellement, il permet de discriminer jusqu'à 9 populations de cellules germinales murines à haut rendement et à la pureté. Cette résolution élevée en matière de discrimination et de purification est possible en raison de changements uniques dans la structure et la quantité de la chromatine pendant la spermatogenèse. Ces motifs peuvent être capturés par cytométrie de flux de cellules germinales mâles colorées avec des colorants fluorescents liés à l'ADN tels que Hoechst-33342 (Hoechst). Voici une description détaillée d'un protocole récemment développé pour isoler les cellules germinales testiculaires de mammifères. En bref, des suspensions de cellules individuelles sont générées à partir du tissu testiculaire par dissociation mécanique, doublement colorées avec Hoechst et iodure de propidium (PI) et traitées par cytométrie en flux. Une stratégie de verrouillage en série, y compris le choix des cellules vivantes (PI négatif) avec une teneur différente en ADN (intensité Hoechst), iS utilisé lors du tri FACS pour discriminer jusqu'à 5 types de cellules germinales. Ceux-ci incluent, avec des puretés moyennes correspondantes (déterminées par évaluation microscopique): spermatogonie (66%), spermatocytes primaires (71%) et secondaires (85%) et spermatides (90%), séparés en rond (93%) et allongés (87%) sous-populations. L'exécution de l'ensemble du flux de travail est simple, permet d'isoler 4 types de cellules simultanément avec la machine FACS appropriée et peut être effectuée en moins de 2 h. Étant donné que le temps de traitement réduit est crucial pour préserver la physiologie des cellules ex vivo , cette méthode est idéale pour les études à haut débit en aval de la biologie des cellules germinales masculines. En outre, un protocole normalisé pour la purification multispécifique de cellules germinales de mammifères élimine les sources méthodologiques de variables et permet d'utiliser un seul ensemble de réactifs pour différents modèles animaux.

Introduction

Compte tenu de l'absence d'un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d'une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , car il fournit un rendement et une pureté élevés et surpasse d'autres méthodes d'isolement dans le nombre de types de cellules germinales qu'il peut identifier et Sélectionnez 6 , 7 , 8 . Le principe de l'analyse par cytométrie de flux est basé sur la détection de modèles de lumière différentielle suite à l'excitation du faisceau laser de cellules individuelles. À mesure que la cellule passe à travers le laser, elle reflète / diffuse la lumièreÀ tous les angles, proportionnel à la taille de la cellule (diffusion vers l'avant, FSC) et à la complexité intracellulaire (scatter latéral, SSC). Voir Ormerod 9 pour des informations détaillées sur la cytométrie en flux.

Les cellules germinales mâles subissent des modifications spécifiques de la teneur en ADN, la structure de la chromatine, la taille et la forme dans différents stades de la spermatogenèse. Ainsi, des populations de cellules distinctes peuvent être identifiées et séparées en combinant la diffusion de la lumière et la coloration de l'ADN avec des colorants fluorescents 10 , 11 . Plusieurs colorants peuvent être utilisés à cet effet (revus dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), tels que Hoechst-33342 (Hoechst) qui a été fréquemment utilisé dans l'analyse par cytométrie de flux de cellules testiculaires au cours de la dernière décennie 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN d'excitation avec la lumière UV, Hoechst émet une fluorescence bleue proportionnelle à la teneur en ADN cellulaire, alors que la fluorescence lointain reflète la variabilité dans la structure de la chromatine et la compaction 1 , 13 , 14 . En conséquence, les cellules germinales mâles dans différents stades de différenciation présentent des modèles spécifiques pendant FACS des suspensions de cellules individuelles colorées par Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Fait intéressant, en raison d'un mécanisme d'efflux de colorant qui n'est actif que pendant le stade spermatogoniale, l'intensité de la fluorescence Hoechst bleu n'est pas proportionnelle à la teneur en chromatine dans ces cellules, et elles se groupent en tant que population latérale pendant Ho-FACS 15 . De plus, la combinaison de la coloration Hoechst avec l'iodure de propidium (PI) non perméable permet aux utilisateurs de discriminer en direct (PI négatif) des cellules mortes (PI positives) pendant FACS 1 , 2 , 10 , 12 . Cette stratégie a été précédemment utilisée dans les analyses cytométriques de flux de cellules germinales testiculaires et optimisée de manière approfondie dans la souris pour discriminer jusqu'à 9 types de cellules germinales, y compris les cellules dans 4 différents stades de la méiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Aux fins de ce travail, la coloration Hoechst présente trois avantages principaux. Tout d'abord, Ho-FACS a été appliqué avec succès à l'isolement des cellules germinales masculines dans les modèles de souris 1 , 2 , 12 et d'autres rongeurs tels que le rat et le cochon d'Inde 17 , 18 , 19 . Deuxièmement, Hoechst est un colorant perméable aux cellules et ne nécessite pas la perméabilisation de la membrane, de sorte qu'il préserveIntégrité des cellules. Enfin, aucun traitement par RNase n'est requis puisque Hoechst se lie préférentiellement aux séquences d'ADN 1 , 20 (ce qui signifie que l'ARN est conservé et, en plus de l'ADN et des protéines, peut être utilisé pour d'autres études moléculaires en aval du germe différenciation cellulaire.

Malgré la similitude dans la pléoïde de l'ADN et / ou la colorabilité observée dans les analyses de cytométrie de flux d'espèces de mammifères (revues dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), il existe une grande variabilité dans les protocoles décrits pour l'isolement masculin des cellules germinales par cytométrie de flux. Différentes études ont utilisé des protocoles spécifiques pour la dissociation des tissus et ont utilisé des colorants distincts liés à l'ADN (seul ou en combinaison) et des stratégies de fermeture de FACS dans différents organismes modèles, principalement la souris, le rat et le cochon d'inde. Par conséquent, la comparaison directe des données recueillies pour différentes espèces peut être affectée par le tabagismeDes artefacts techniques non issus de la variabilité entre les méthodologies. Il est important de noter que la conservation frappante de la dynamique de la chromatine dans la spermatogenèse des mammifères (2N-4N-2N-1N) suggère qu'un protocole standardisé pourrait être appliqué transversalement à une variété d'espèces de mammifères.

L'objectif de cette étude était de développer un flux de travail unique applicable à différentes espèces de mammifères, en combinant et en adaptant les techniques 2 , 20 précédemment publiées. La normalisation d'une méthode de traitement des tissus a été obtenue en effectuant une dissociation mécanique afin de surmonter la nécessité d'effectuer des ajustements propres aux espèces nécessaires à la digestion enzymatique 5 . Il est à noter que la dissociation mécanique du tissu testiculaire des rongeurs s'est révélée supérieure à la digestion enzymatique des tissus 20 et Ho-FACS des suspensions de cellules individuelles générées par les deux méthodes.Des résultats comparables 5 . En tant que preuve de principe, ce protocole décrit les paramètres utilisés pour isoler jusqu'à 5 populations de cellules germinales: la spermatogonie (SPG); Les spermatocytes primaires (SPC I) et les spermatocytes secondaires (SPC II) et les spermatides (SPD) - round (rSPD) et allongement (eSPD). Fait important, il est facile à mettre en œuvre dans le laboratoire, les principales exigences étant le système de dissociation des tissus et l'accès à un trieur de cellules équipé d'un laser UV. Ce flux de travail ( Figure 1 ) est rapide et direct et permet l'isolement simultané de 4 populations de cellules germinales à partir de tissu testiculaire frais en moins de 2 h. Le temps de traitement réduit est essentiel pour maintenir l'intégrité cellulaire pour d'autres procédures en aval. En outre, sa performance réussie dans 5 espèces différentes suggère qu'il pourrait être largement appliqué dans le clade de mammifères, ce qui en fait la méthode idéale pour isoler les cellules germinales pour des études comparatives de mammifères masculins reproducteurs biolOgy.

Ce protocole est composé de trois sections majeures, en dehors des étapes préparatoires: (1) la dissociation mécanique du tissu testiculaire et (2) la coloration des cellules testiculaires avec Hoechst et PI, suivie par (3) le triage FACS de cellules spermatogènes pertinentes. Une fois recueillies, ces populations enrichies de différentes cellules germinales testiculaires de mammifères peuvent être utilisées pour une large gamme d'applications. Ce protocole décrit une méthode de dissociation «unique pour tous» pour purifier les cellules germinales mâles de différentes espèces de mammifères différentes. Selon le type d'étude que les utilisateurs souhaitent effectuer avec les cellules germinales isolées, d'autres supports ou tampons peuvent être utilisés. Les étapes suivantes du protocole consistent à générer des suspensions monocellulaires à partir d'un testicule murin entier.

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Protocole

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont respecté les règlements du comité des études animales de l'Université de Washington à St. Louis.

1. Préparations pour le protocole de dissociation mécanique

  1. Pré-mouiller une cartouche de désagrégation de tissu jetable de 50 μm pour la dissociation d'un testicule murin entier.
    REMARQUE: cette cartouche jetable de désagrégation de tissu contient des micro-lames conçues pour couper des tissus et un treillis métallique immobile avec environ 100 trous hexagonaux. Différentes tailles de maille pour cartouche de désagrégation tissulaire sont disponibles pour adapter ce protocole en fonction des espèces et des types de cellules souhaités. Des cartouches de 50 μm ont été utilisées pour toutes les espèces de mammifères mentionnées dans cet article.
    1. Chargez 1 mL de phénol glacé rouge sans 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sur la cartouche de désagrégation tissulaire jetable de 50 μm.
      REMARQUE: le rouge phénol peut interférer avec la détection de fluorescence rougePendant les FACS.
    2. Aspirer 1x DMEM de la cartouche de désagrégation tissulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue.
  2. Activez le système de désagrégation des tissus en appuyant sur le bouton "ON". Ce système ne nécessite pas un «échauffement».
  3. Préchauffez trois filtres jetables de 40 μm avec de la glace à l'abri du DMEM. Placez chaque filtre jetable de 40 μm sur un tube conique de 50 ml. Pipettez 1 mL de 1x DMEM et laissez passer le liquide.
  4. Préparer une boîte de Petri 100 mm x 15 mm pour la collecte de tissus testiculaires. Pipetter 500 μL de 1x DMEM sur la boîte de Petri.

2. Préparation du tissu testiculaire pour le protocole de dissociation mécanique

  1. Dissectez une souris mâle pour éliminer soigneusement les testicules entiers frais ou les fragments testiculaires (si vous rencontrez d'autres espèces de mammifères) avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces chirurgicales.
    REMARQUE: Assurez-vous que les tissus sont exempts de graisse et de nécrose. Fr Les tissus testiculaires génèrent une qualité de suspension supérieure à une cellule supérieure à celle des tissus congelés.
    1. Transférer des testicules / fragments recueillis dans la boîte de Petri 100 mm x 15 mm préparée contenant 500 μL de 1x DMEM.
    2. Rincer doucement le tissu dans 1x DMEM pour éliminer les globules rouges (si présent).
  2. Retirez délicatement la tunica albuginea. L'épaisseur de la tunica albuginea variera selon les différentes espèces.
    1. Prenez une extrémité du testicule avec une pince.
    2. Percez l'autre extrémité du testicule avec un scalpel tout en maintenant l'extrémité du testicule avec une pince de l'étape précédente.
    3. Rincez les tubules testiculaires à l'aide d'un scalpel tout en maintenant l'extrémité du testicule avec une pince à partir de l'étape 2.2.1.
  3. Couper les tubules testiculaires en morceaux de ~ 2-3 mm 3 en utilisant un scalpel.

3. Obtention des suspensions monocellulaires par dissociation mécanique des tissus testiculaires

"Les résultats des étapes de dissociation décrites ci-dessous sont pour un testicule de souris chez l'adulte. Les volumes de tissus testiculaires provenant de souris juvéniles ou non murines devraient être ajustés en conséquence. Les animaux juvéniles ne contiennent pas tous les stades des cellules germinales. La composition des tissus testiculaires change pendant les saisons de reproduction par rapport à la saison non associée.

  1. Transférer les petites pièces de tubules testiculaires dans la cartouche de désagrégation de tissu pré-mouillée de 50 μm en utilisant une pince et ajouter 1 mL de 1x DMEM.
  2. Chargez la cartouche de désagrégation des tissus dans le système de désagrégation des tissus et procédez pendant 5 minutes en tournant le bouton du mode "veille" au mode "courir".
  3. Retirez la cartouche de désagrégation tissulaire du système de désagrégation des tissus et éliminez la suspension cellulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue.
    1. Aspirez quelques fois pour éliminer tout liquide de la cartouche de désagrégation des tissus. ne pasTous les 1 ml peuvent être récupérés à partir de la cartouche de désagrégation tissulaire.
  4. Passer la suspension cellulaire aspirée à travers deux filtres pré-mouillés de 40 μm. Filtrer deux fois pour supprimer tous les agrégats cellulaires.
    1. Placez un filtre pré-mouillé de 40 μm dans un tube conique de 50 ml. Ajouter directement des cellules aspirées dans la seringue sur le filtre de 40 μm. Pipette la suspension à une seule cellule avec une pipette jetable.
    2. Retirez le filtre pré-mouillé usagé de 40 μm et placez un autre filtre pré-mouillé de 40 μm dans le tube conique de 50 ml. Pipettez la suspension monocellulaire collectée sur le filtre propre de 40 μm.
    3. Recueillir la suspension filtrée à une seule cellule avec une pipette jetable propre.
  5. Pipettez la suspension de cellule filtrée vers la cartouche de désagrégation de tissu de 50 μm et procédez pendant encore 5 minutes dans un système de désagrégation de tissu.
  6. Récupérer tout le liquide de la désagrégation tissulaireSur la cartouche.

4. Coloration avec Hoechst et Iodure de Propidium (PI)

  1. Transférer la suspension cellulaire récupérée de la cartouche de désagrégation tissulaire de 50 μm à un tube propre de 1,5 mL. On récupérera environ 1-1,5 ml de suspension monocellulaire.
  2. Diviser la suspension monocellulaire récupérée en quatre tubes de 1,5 mL ou 5 mL.
    1. Pour les trois premiers tubes, pipeter 150 μL de suspension monocellulaire et repose pipette de suspension monocellulaire dans le dernier des quatre tubes (environ 550 μL de suspension monocellulaire).
      REMARQUE: Le montant de la suspension à une seule cellule dans le dernier tube peut varier en fonction de l'efficacité de la récupération de la suspension cellulaire à l'étape 3.6.
  3. Réglez le premier tube des quatre tubes comme un contrôle non contrôlé pour la session FACS.
  4. Préparer des suspensions de cellules colorées à un seul colorant (PI ou Hoechst) comme témoins. Ajouter 2,5 μL de Hoechst ou 1 μL de PI à chaque tube (deuxième et thiRd).
  5. Préparez un tube double taché. Ceci sera utilisé pour collecter des sous-populations de cellules germinales. Ajouter 2,5 μL de Hoechst et 1 μL de PI au dernier tube.
    NOTE: Hoechst a une durée de conservation de 2-3 mois. L'utilisation de stocks de colorants plus anciens entraînera des modifications importantes lors de la session FACS.
  6. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. Placez les échantillons dans un tube rotatif ou inversez les tubes de 1,5 mL toutes les 5-10 minutes.
  7. Filtrer la suspension de cellules avec un filtre pré-mouillé de 40 μm et garder la solution filtrée sur de la glace et dans le noir jusqu'à la session FACS.
    REMARQUE: L'étape de filtration est nécessaire pour prévenir les touffes cellulaires pour FACS. En outre, le traitement avec la DNase (voir la figure 1 ) ou le sel dipotassique d'acide 2-Naphthol-6,8-disulfonique (NDA 20 ) peut être utilisé pour limiter l'agglutination cellulaire. Des périodes d'attente prolongées affecteront le signal fluorescent détecté pendant les FACS et peuvent entraîner une augmentation de la mort cellulaire.

5. Paramétrage de la cellule activée par fluorescence (FACS) et purification des cellules testiculaires

  1. Préparez les tubes collecteurs FACS.
    1. Enduire 5 ml de tubes à base ronde en polypropylène ou 1,5 mL avec 400 μL de FBS pour la collecte des cellules. Décanter l'excès de FBS après le revêtement.
    2. Ajouter le milieu de collecte FACS (1x DMEM + 10% de sérum bovin fœtal, FBS) aux tubes: 1 mL pour tubes de 5 mL ou 100 μL pour tubes de 1,5 mL.
  2. Configurez les conditions de tri appropriées dans le trieur et le logiciel.
    REMARQUE: D'autres machines de tri de cellules et logiciels d'analyse peuvent être utilisés avec les stratégies de configuration et de verrouillage similaires décrites ci-dessous. Les conditions décrites ici ont été adaptées de Gaysinskaya et Bortvin 2 , Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 , et Getun, et al. 4
    1. Chargez un laser ultraviolet avec 463/2Filtre passe-bande de 5 nm pour détecter le Hoechst blue et le filtre passe-bande LP de 680 nm pour détecter le rouge Hoechst et pour détecter le PI.
    2. Utilisez un miroir dichroïque 555DLP pour distinguer le bleu de la fluorescence rouge.
    3. Utiliser une buse de 70 μm et trier les cellules à une vitesse de 1000-2000 cellules / seconde.
      NOTE: L'efficacité de tri est directement influencée par le débit. Des débits élevés (> 3500 événements / s) augmentent la vitesse de tri mais entraînent une contamination des populations. Voir référence 12 pour plus d'informations.
  3. Réglez les portes en utilisant des échantillons de contrôle.
    1. Charger et exécuter l'échantillon non étagé.
    2. Exclure les débris cellulaires basés sur le modèle FSC vs SSC. Les débris cellulaires apparaîtront dans le quadrant inférieur gauche de l'intrigue. Réglez arbitrairement le seuil pour les débris cellulaires par l'utilisateur ou le technicien du trieur de cellule.
    3. Portez sur des cellules individuelles en ajustant le seuil pour FSC et la largeur d'impulsion. Les différents trieurs de cellules ont différentes façons de distinguerGuild singlets. Comme la largeur d'impulsion reflète les cellules de temps pour transiter le laser, les cellules individuelles ont des valeurs inférieures par rapport aux agrégats multicellulaires. Le seuil de réglage sur un tracé pour FSC vs largeur d'impulsion peut être utilisé pour sélectionner des singlets.
    4. Réglez des tensions optimales du tube photomultiplicateur (PMT).
    5. Utiliser des cellules colorées non colorées et colorées uniques pour établir le seuil du signal de fluorescence PI ou Hoechst.
      REMARQUE: Il est important d'optimiser les tensions PTM de base pour les cellules d'intérêt afin d'établir la plage de fluorescence appropriée pour chaque colorant. Ceci est essentiel pour une détection et une sensibilité optimales du signal. Les cellules témoins tachées et non colorées sont utilisées pour établir une gamme de cellules colorées négativement et positivement avec des colorants PI et / ou Hoechst et minimiser le bruit dans les signaux. Pour d'autres explications sur l'optimisation de la tension PMT à l'aide de cellules témoins, reportez-vous à Gaysinskaya et Bortvin 2
    6. Porte sur cellule en directS basé sur la coloration PI (PI négatif) et la trame FSC. Les cellules mortes seront positives pour la fluorescence PI.
    7. Définir la porte de contenu en ADN en traçant un histogramme des nombres de cellules basés sur la fluorescence bleue Hoechst. 3 pics avec des concentrations croissantes de fluorescence Hoechst bleu devraient apparaître, représentant des cellules haploïdes (1C), diploïdes (2C) et tétraploïdes (4C). Réglez 3 portes, une pour chaque pic.
    8. Observez au moins 500 000 événements sur le plan FSC vs SSC avant de procéder à un déclenchement sur les populations de cellules germinales.
  4. Portent différentes populations de cellules germinales.
    1. Mélanger l'échantillon taché Hoechst / PI.
    2. Définissez les trois premières portes parentales communes à toutes les populations.
      1. Exclure les débris cellulaires en fonction de la trame FSC vs SSC. Sélectionnez les caractères individuels en fonction de la trame FSC vs largeur d'impulsion. Sélectionnez les cellules vivantes en fermant les cellules PI négatives.
    3. Définir la porte de la spermatogonie.
    4. Plot PI cellules négatives basées sur la fluorescence bleue et rouge HoechstIntensités. La spermatogonie apparaît comme une population latérale (voir la figure 1 ).
    5. Définir des portails pour les populations de cellules germinales restantes. REMARQUE: Reportez-vous à la figure 1 et à la figure 2 supplémentaire pour les détails visuels.
    6. Plot PI cellules négatives dans la porte de contenu d'ADN.
      1. Pour les spermatides, utilisez le pic avec la plus faible fluorescence Hoechst (1C).
      2. Pour les spermatocytes II, garez le pic avec une fluorescence Hoechst intermédiaire (2C).
      3. Pour les spermatocytes I, garez le pic avec la plus grande fluorescence Hoechst (4C).
    7. Tracer l'intensité de fluorescence bleue et rouge de Hoechst pour affiner les populations de spermatocytes et de spermatozoïdes à partir des portes de contenu d'ADN.
  5. Collectez les portes de sous-population sélectionnées dans les tubes de collecte précédemment préparés. Chaque testicule prendra en moyenne 45 minutes à 1,5 h pour collecter environ 0,5 à 6,0 x 10 6 cellules pour chaque sous-population.
    NOTE: Exposition prolongée des cellules à Hoechst maDéplacement légèrement de l'emplacement des populations avec le temps. Rafraîchir les paramètres après 20-30 min de FACS. Le rendement maximal pour chaque sous-population dépendra de l'efficacité de l'étape de dissociation.

6. Evaluation microscopique des cellules purifiées

  1. Les cellules recueillies par centrifugation à 500-600 xg à 4 ° C pendant 10 min.
  2. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de solution tampon phosphate glaciaire 1x (PBS) ou 1x DMEM.
    REMARQUE: Le volume de ré-suspension peut être ajusté en fonction du nombre de cellules triées et de la concentration finale souhaitée.
  3. Pipettez 40 μL de cellules lavées sur une glissière de verre propre et placez une lamelle.
  4. Fixer les cellules restantes avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) et stocker des cellules fixes à 4 ° C dans l'obscurité pour référence ultérieure.
    1. Pipetter 100 μL 4% de PFA directement dans les tubes de collecte.
    2. En bref, tourbillonner les tubes ou la pipette quelques fois pour assurer un bon mélange de la suspension cellulaire.
  5. Visualisez les diapositives préparées dans un microscope équipé d'une lampe UV pour détecter la fluorescence Hoechst sous un objectif 63X. Reportez-vous à la section Résultats - Évaluation morphologique des populations de cellules germinales classées - pour plus de détails sur la façon d'identifier les types spécifiques de cellules germinales.

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Résultats

Suspensions cellulaires simples de la dissociation mécanique du tissu testiculaire

La figure 2 compare les suspensions de cellules individuelles obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire de souris dans différentes conditions. Les échantillons obtenus en traitant du tissu frais, non colorés ( Figure 2A ) ou colorés avec Hoechst ( Figur...

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Discussion

Compte tenu de la dynamique de la chromatine hautement conservée pendant la spermatogenèse chez les mammifères, l'objectif de ce travail était de développer un protocole pour isoler les cellules germinales masculines dans différents stades de différenciation de différents tissus testiculaires de mammifères ( figure 1 ). L'un des principaux obstacles à l'application d'un flux de travail unique à différents modèles animaux est la nécessité d'ajustements spécifiques aux esp...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel.

Remerciements

Les auteurs remercient l'hôpital Hillside Animal (St. Louis, MO) pour les testicules de chien; Jason Arand et le laboratoire du Dr Ted Cicero à l'Université de Washington à St. Louis (WashU) pour fournir des testicules de rat et Brianne Tabers pour aider à la collecte; Jared Hartsock et Dr. Salt's Lab à WashU pour les testicules de guinée; Et le Dr Michael Talcott à la Division de la médecine comparée chez WashU pour les testicules miniatures de porc. Les auteurs reconnaissent également le Alvin J. Siteman Cancer Center à la Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St. Louis, MO, pour l'utilisation de Siteman Flow Cytometry Core, qui a fourni un service de tri cellulaire. The Siteman Cancer Center est soutenu en partie par la subvention de soutien NCI Cancer Center # P30 CA91842.

Cette recherche a été financée par une bourse de doctorat de FCT [SFRH / BD / 51695/2011 à ACL], des subventions des National Institutes of Health des États-Unis [R01HD078641 et R01MH101810 à DFC] et un contrat de recherche FCT [IF / 01262/2014 à AML].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % paraformaldéhydeVWR#157104 % PFA, Pour la fixation des cellules triées
MedimachineBD Biosciences#340588 ;Système de dissociation testiculaire
1X Dulbecco modifié Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, pour la dissociation des testicules
MediconBD Biosciences#340591Cartouche de désagrégation pour la dissociation des testicules
Sérum fœtal bovinThermo Scientific#10082139FBS, pour la collection FACS
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, Pour la coloration FACS
40 et micro ; Filtre à cellules mGREINER BIO-ONE#89508-342Pour la dissociation des testicules
100x 15 mmboîte de Pétri Falcon#351029Pour la dissection des testicules
5 mL Tubes à fond rond en polypropylèneFalcon#352063Pour la collection FACS
1,5 mL Tubes EppendorfVWR#20170-650Pour la collection FACS
3 mL seringue inutileBD Biosciences#309657Pour la dissociation des testicules
50 mL tube coniqueMIDSCIPour la dissociation des testicules  ;
Iodure de propidiumInvitrogen#L7011PI, Pour la coloration FACS
Trieur de cellules MoFlo LegacyBeckman Coulter#ML99030Pour FACS
Summit Cell Sorting softwareBeckman Coulter#ML99030Pour FACS
Saline tamponnée au phosphateThermo Scientific#AM9625PBS, Pour la microscopie
Lame de verre microscopiqueFisher Scientific#12-544-4Pour la microscopie
Lamelle en verreFisher Scientific#12-548-87Pour la microscopie
Pipette de transfert jetable (3 mL)Samco Scientific#225Pour la dissociation des testicules
DNase IRoche#10104159001Pour la dissociation des testicules
Lame chirurgicale en acier au carboneMiltex#4-111Pour la dissection des testicules
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogen#C10227Pour le comptage automatique des cellules
Solution de bleu de trypan (0,4 %)Sigma#T8154Pour la coloration de la viabilité
#C50R

Références

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
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