L'isolement des myoblastes humains, l'évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l'entrée de calcium par magasin

Résumé

Ici, nous décrivons une méthodologie pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'un tissu musculaire adulte. Ces cellules sont utilisées pour étudier la différenciation in vitro des muscles squelettiques et, en particulier, pour étudier les protéines impliquées dans la signalisation du Ca ²⁺ .

Résumé

Les cellules satellites (SC) sont des cellules souches musculaires situées entre la membrane plasmique des fibres musculaires et la lame basale environnante. Ils sont essentiels pour la régénération musculaire. En cas de blessure, qui se produit fréquemment dans les muscles squelettiques, les SC sont activés. Ils prolifèrent comme myoblastes et se différencient pour réparer les lésions musculaires. Parmi les nombreux événements qui se déroulent lors de la différenciation musculaire, les signaux cytosoliques de Ca ²⁺ sont d'une grande importance. Ces signaux Ca ²⁺ proviennent de la libération ^de Ca de Ca ²⁺ magasins internes, ainsi que de Ca ²⁺ entrée de l'espace extracellulaire, en particulier l'entrée Ca ²⁺ magasin fonctionnant (SOCE). Cet article décrit une méthodologie utilisée pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires recueillis après la chirurgie orthopédique. Le tissu est digéré mécaniquement et enzymatiquement, et les cellules sont amplifiées puis triées par cytométrie en flux selon la présence de spécimensMarqueurs de membrane de fic. Une fois obtenu, les myoblastes humains sont élargis et s'engagent à se différencier en éliminant les facteurs de croissance du milieu de culture. Les niveaux d'expression des facteurs de transcription spécifiques et de l' immunofluorescence in vitro sont utilisés pour évaluer le processus de différenciation myogénique dans les conditions de contrôle et après le silence des protéines impliquées dans la signalisation du Ca ²⁺ . Enfin, nous détaillons l'utilisation de Fura-2 comme une sonde ratiométrique Ca ²⁺ qui fournit des mesures fiables et reproductibles de SOCE.

Introduction

Les muscles squelettiques humains sont composés de groupes de fibres musculaires contractiles et multinucléées résultant de la fusion des cellules précurseurs myogéniques. Les muscles squelettiques ont la capacité de se régénérer après une blessure grâce à la présence de SC, les cellules souches du muscle squelettique situées entre la membrane plasmatique des myofibres (sarcolemma) et la lame basale. Dans les muscles non blessés, les SC sont principalement présents dans un état de repos. En réponse au stress mécanique ou aux blessures, les SC sont activés (myoblastes), prolifèrent et subissent soit une différenciation pour former de nouvelles myofibres, soit un auto-renouvellement pour reconstituer le pool SC ^{1 , 2} . Au cours des années, plusieurs techniques ont été développées pour isoler les SC et leur descendance, les myoblastes, à partir des biopsies des muscles squelettiques. Avec une meilleure compréhension des marqueurs de surface cellulaire exprimés sur ces cellules et de la méthodologie du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ^{3, 4 , 5} , il est maintenant possible d'isoler des populations pures de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires.

La signalisation de calcium régule le développement du muscle squelettique, l'homéostasie et la régénération. En particulier, l'entrée Ca ²⁺ qui est activé suite à l' épuisement du magasin intracellulaire, appelé SOCE, est d' une grande importance pour ⁶ ces processus. Lors de la stimulation cellulaire, le niveau de Ca ²⁺ dans le réticulum endo / sarcoplasmique (ER / SR) diminue, ce qui active les canaux Ca ^{2+ de} la membrane plasmatique qui permettent l'entrée de Ca ²⁺ pour remplir le ER / SR ⁷ . Les deux principales protéines impliquées dans SOCE sont la protéine de l'interaction ERR / SR Ca ²⁺ -sensing stromal interaction molécule 1 (STIM1) et la chaîne plasma Ca ²⁺ canal Orai1. Le muscle squelettique exprime abondamment ces deux protéines, ainsi que d'autres protéines des mêmes familles (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} et plusieurs canaux perméables au Ca ²⁺ de la famille canonique canonique (TRPC) du récepteur transitoire ^{10 , 11 , 12 , 13} . L'entrée de Ca ^{2+ à} travers la voie SOCE revêt une grande importance pour la formation / régénération musculaire ¹⁴ . Les mutations des protéines STIM1 ou Orai1 ont des effets délétères sur la fonction musculaire, conduisant principalement à l'hypotonie musculaire ¹⁵ . Les modèles animaux avec déficience de SOCE présentent également une masse musculaire et une force réduites, ainsi qu'une fatigabilité accrue ^{6 , 16 , 17} . Comme mentionné, d'autres protéines STIM et Orai, ainsi que de nombreux canaux TRPC, sont exprimés dans le muscle squelettique, et leurs rôles respectifs n'ont pas encore été déterminés jusqu'à présent. En battant dPossèdent leur niveau d'expression, il est ainsi possible d'étudier leurs implications dans SOCE et leurs rôles lors de la différenciation des muscles squelettiques humains.

La mesure SOCE peut être effectuée en utilisant deux approches différentes: enregistrements électrophysiologiques actuels et mesures Ca ²⁺ . L'électrophysiologie est certainement une méthode plus directe, car elle mesure le courant d'intérêt et sa signature électrophysiologique associée. Cependant, cette technique est très difficile à appliquer aux cellules musculaires, principalement en raison de la grande taille des cellules musculaires et de la petite taille du courant endogène de la SOCE. L'imagerie cytosolique Ca ²⁺ est techniquement très accessible, mais la mesure est plus indirecte, car le niveau de Ca ²⁺ mesuré dans le cytosol reflète à la fois l'entrée de Ca ²⁺ et le refoulement de la cellule ou dans les magasins internes.

Une méthodologie qui comprend l'isolement des myoblastes à partir de petits morceaux de skel humainEtal après digestion enzymatique, amplification et FACS est expliqué dans cet article. Le processus de différenciation musculaire et le protocole d'immunofluorescence pour suivre l'expression de marqueurs de différenciation dans le temps sont décrits ¹⁸ . Enfin, la mesure de SOCE et le rôle de différents canaux ioniques dans la signalisation Ca ^{2 +} et la différenciation musculaire squelettique sont expliqués.

Protocole

Des échantillons musculaires humains (tissus obtenus à partir de muscles semi-finissants) ont été recueillis lors de la chirurgie orthopédique chez des patients en bonne santé en tant que déchets chirurgicaux. Toutes les méthodes relatives à l'étude humaine ont été réalisées conformément aux directives et règlements des Autorités suisses de réglementation de la santé et approuvées par la Commission Cantonale d'Ethique de Recherche des Autorités cantonales de Genève en Suisse (protocole CER n ° 12-259) . Des consentements éclairés et écrits ont été obtenus auprès de tous les sujets adultes impliqués dans l'étude.

1. Isolation des myoblastes du muscle squelettique humain

1. Pendant toutes les procédures, maintenir des conditions stériles en travaillant sous un capot de culture tissulaire de niveau II et en utilisant des tampons stériles et stériles.
   Note: Cette procédure peut être appliquée à de nombreux muscles squelettiques humains.

2. Protocole de dissociation

1. Transférer les échantillons musculaires (2 à 3 g) dans un stérile de 6 cmassiette.
2. Lavez les échantillons musculaires avec 5 à 10 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Répétez le lavage.
3. Enlever les tissus conjonctifs et adipeux à l'aide de ciseaux incurvés et d'une pince.
4. Peser l'échantillon musculaire (voir étape 2.13) et le transférer dans une nouvelle plaque stérile de 6 cm.
5. Ajouter 5 ml de trypsine-EDTA à 0,05%.
6. À l'aide de ciseaux, coupez et piquez le tissu musculaire en petits morceaux (moins de 2 mm).
7. À l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml, transférez le muscle haché à une bouteille de dissociation de 200 ml contenant une barre magnétique. Répétez cette étape jusqu'à ce que 90 ml de 0,05% de trypsine-EDTA aient été transférés avec tous les muscles hachés à la boîte de dissociation. Fermer la bouteille de dissociation et incuber à 37 ° C pendant 60 minutes sous agitation douce.
8. Enlever la bouteille de dissociation du bain de chauffage et arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de sérum de veau foetal (FCS, 10% de volume final) à la bouteille de dissociation. Homogénéiser le mélange avec une pipette.
9. PréparationSont deux tubes de 50 ml avec une crépine cellulaire de 70 μm sur chacun. Passer la moitié de la suspension de cellules à travers la crépine cellulaire sur chaque tube en pipetant vers le haut et vers le bas sur le filtre jusqu'à la fin de la suspension.
10. Centrifuger les tubes à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
11. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu de croissance (GM, tableau 1 ) et passer les cellules à travers une filtre de 40 μm placé sur un tube de 50 ml. Centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
12. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de GM et centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 minutes; Aspirer et jeter le surnageant.
13. Remettre en suspension les cellules avec 1 ml de GM et compter les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
    Note: Habituellement, un rendement de 3 x 10 ⁵ cellules par g de muscle devrait être récolté. Le rendement est calculé en divisant le nombre de cellules par le poids de la biopie musculaireSy (étape 2.4).
14. Mettre 2 x 10 ⁵ cellules dans une plaque stérile de 6 cm contenant 4 ml de GM et incuber à 37 ° C et 7% de CO ₂ . Préparez autant de plaques que nécessaire.
15. Changez le GM après 3 jours.
    Remarque: Les cellules fraîchement dissociées ont besoin de temps pour adhérer à la plaque de culture. En outre, le premier temps de doublement de cellules myogéniques est d'environ 50 à 60 h. Après la première division, le temps de doublement est d'environ 20 h.
16. Après 5 à 7 jours, lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence (environ 1,5 x 10 ⁶ cellules / par plaque de 6 cm), commencer la coloration des anticorps et le tri des cellules (étape 3).

3. Coloration des anticorps et tri des cellules

1. Après rinçage une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO ₂ pendant 3 min (ou incuber à 5% de CO ₂ ). Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), resUtiliser les cellules dans 1 ml de GM.
2. Comptez les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
3. Effectuez les procédures suivantes sur la glace.
   Remarque: La procédure de réglage de la compensation de fluorescence correcte sur le cytomètre est essentielle et devrait être similaire sur tout cytomètre. Les tubes 1 et 2 sont utilisés comme témoins négatifs. Les tubes 3 à 7 sont utilisés pour régler la compensation sur le cytomètre pendant la première expérience ( tableau 2 ). La concentration finale utilisée pour chaque anticorps et son isotype correspondant devrait être la même (environ 1 μg / 10 ⁶ cellules).
4. Déposer 1 x 10 ⁵ cellules par tube (tube de 5 ml) pour les tubes 1 à 7 ( tableau 2 ). Placez la suspension cellulaire restante dans le tube 8 pour le tri des cellules.
5. Lavez les cellules avec 1 ml de tampon FACS froid (PBS-5% FCS). Fermer et centrifuger les tubes à 200 xg et 4 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
6. Ajouter 200 μL de tampon FACS par tube. Ajouter des anticorps contre thE tube selon le tableau 2 . Incuber sur de la glace pendant 30 min.
7. Laver les cellules: ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Fermer et centrifuger les tubes à 200 xg et 4 ° C pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape une fois de plus.
8. Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de tampon FACS. Fermez les tubes et gardez-les sur glace jusqu'à ce que le tri des cellules. Préparez 4 tubes de 1,5 ml, contenant chacun 500 μL de GM, ce qui est nécessaire pour collecter les cellules lors du tri des cellules. Gardez-les sur la glace.
9. Trier les myoblastes humains par cytométrie en flux ( Figure 1 ). Après avoir exclu les cellules hématopoïétiques positives pour CD45, séparer les cellules CD45 négatives en fonction de l'expression de CD56. Ensuite, porte la population positive CD56 pour CD34, CD144 et CD146 (les myoblastes humains sont définis comme des cellules CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Réanalysez une petite fraction de la population de cellules triées pour vérifier la pureté.
10. Pousser les tubes contenant la myobla humaineM dans un tube de 15 ml et laver une fois en ajoutant 5 ml de GM. Centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
11. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de GM et déposer les cellules sur une plaque non revêtue de 6 cm contenant 4 mL de GM (2 x 10 ⁵ cellules par plaque). Incuber à 37 ° C et 7% de CO ₂ .

4. Maintenance cellulaire

1. Changer la moitié du milieu de culture tous les 2 jours. Enlevez 2 ml d'ancien GM du plat de culture et ajoutez 2 ml de GM.
   Note: Les myoblastes produisent des facteurs de croissance bénéfiques pour les conditions de culture.
2. Essaye les cellules lorsqu'elles atteignent 70 à 80% de confluence pour éviter la pré-différenciation. Après avoir rincé une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO ₂ pendant 3 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), ressusciterPendent les cellules dans 1 ml de GM.
3. Comptez les cellules et préparez des plaques de 6 cm avec 2 x 10 ⁵ cellules par plaque dans 4 mL de GM.
4. Gardez les myoblastes humains jusqu'à 6 passages ou congéluez-les dans du GM contenant 10% de DMSO, 1 x 10 ⁶ cellules par ml. Congeler les cellules dans une boîte de congélation progressive (1 ° C / min); Pour un stockage à long terme, placez les cellules dans de l'azote liquide.

5. Transfection de myoblastes humains avec siRNA

Note: Les myoblastes sont transfectés à l'aide d'un réactif de transfection commercial deux jours avant l'introduction de la différenciation. L'effet de siRNA spécifique contre un gène est toujours comparé à l'effet d'un siRNA de contrôle. Les ARNs sont des ARN à double brin qui doivent être conservés sur de la glace et manipulés avec des gants.

1. Obtenir une monocouche confluente de 70 à 80% de myoblastes humains dans une plaque de 6 cm (environ 1,5 x 10 ⁶ cellules).
   Note: 5 x 10 ⁵ cellules par transfection sont nécessaires pour obtenir un conMonocouche fluide de myoblastes transfectés après 2 jours dans GM.
2. Préparez des lamelles de verre (décrites pour l'imagerie au calcium à l'étape 7).
3. Warm GM, 0,05% de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C.
4. Effectuez toutes les étapes suivantes dans un capot de culture tissulaire de niveau II pour maintenir la stérilité.
5. Dans un tube de 1,5 ml, dépêcher 500 μL de milieu sérique réduit, 3 μL de réactif de transfection et 1 μl de siRNA à 20 μM. Mélanger doucement et garder à température ambiante (RT) pendant 15 à 20 min.
6. Pendant ce temps d'incubation, préparer les myoblastes pour la transfection. Après avoir rincé une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO ₂ pendant 3 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), remettre en suspension les cellules dans 1 ml de GM.
7. Comptez les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
8. Ressusciter 5 x 10 ⁵ cellulesDans 200 μL de GM pour chaque transfection ( c.-à-d. Pour 2 transfections, résister à 400 μL).
9. Ajouter 200 μL de suspension cellulaire à chaque 500 μl de mélange de siRNA-transfectant. Pipeter et baisser deux fois et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante.
10. Ajouter les 700 μL (cellules + siRNA-transfectant) dans un plat de culture de 3,5 cm contenant une lamelle de verre. Ajoutez GM pour obtenir un volume final de 2 ml.
11. Après 24 h à 37 ° C et 7% de CO ₂ , remplacer complètement le milieu par 2 ml de GM frais. Après 24 heures supplémentaires, une monocouche confluente de cellules transfectées est habituellement présente; Si tel est le cas, induire la différenciation de myoblastes en remplaçant le GM par 2 mL de milieu de différenciation (DM, tableau 1 ).
12. Effectuer des expériences d'imagerie au calcium 24 à 48 h après l'induction de la différenciation ou des myoblastes proliférants.
    Note: L'immunofluorescence est généralement effectuée 48 h après l'induction de la différenciation.

6. ImmUnofluorescence Coloration des marqueurs de différenciation

Note: La coloration par immunofluorescence est effectuée après 48 h dans la DM, mais elle peut également être effectuée à d'autres moments de différenciation. La myogenine et le MEF2 sont des protéines nucléaires seulement exprimées dans des cellules différenciées (avant fusion dans des myotubes) et leur coloration permet l'évaluation du processus de différenciation. La chaîne lourde de Myosine (MyHC) n'est exprimée que dans des myotubes et est utilisée pour estimer la taille de myotubes et l'indice de fusion (nombre de noyaux dans les myotubes / nombre total de noyaux).

1. Après 48 h dans le DM, laver la monocouche confluente de cellules différenciées deux fois avec 1 mL de PBS à la RT. Faites ceci avec soin pour éviter de détacher les myotubes.
2. Fixer les cellules avec 1 ml de paraformaldehyde à 4% (PFA) pendant 15 minutes à la température ambiante. Lavez les cellules avec du PBS deux fois, pendant 5 minutes chacune.
3. Perméabiliser les cellules avec 1 ml de PBS contenant 0,25% de Triton X-100 pendant 45 minutes et laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
4. Block unsSites de liaison pecific par incubation des cellules dans du PBS additionné de 0,2% de Tween-10 et de 2% de sérum de chèvre (solution de bloc) pendant 30 minutes à la RT.
5. Préparer les anticorps primaires dilués dans une solution de bloc (600 μL par plaque de 3,5 cm).
   Note: Les anticorps primaires suivants sont utilisés: anti-myogénine de souris (1: 600), anti-MEF2 de lapin (1: 300) et anticorps anti-MyHC de souris (MF20, 1: 1 000). Il est possible de mélanger la même solution de blocage, la chaîne lourde anti-myosine de souris ou l'anti-myogénine de souris, avec un anti-MEF2 de lapin.
6. Retirez la solution de bloc et ajoutez 600 μL de solutions d'anticorps primaires par plaque de 3,5 cm et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée.
7. Laver les cellules 3 fois avec 1 ml de PBS. Incuber pendant 1 h à la RT dans une chambre sombre avec 600 μL des anticorps secondaires préparés dans la solution de bloc, comme suit: Alexa 488 (1: 1 000) de chèvre anti-souris, Alexa 546 de chèvre (1: 1 000), Et DAPI (1:50, solution stock à 15 μM).
   CAUTION: DAPI est un composé toxique qui doit être manipulé avec des gants.
8. Aspirer et laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS.
9. Monter des lamelles en verre à l'aide d'un support de polyvinyl alcool avec une solution anti-adhésive. Gardez-les à 4 ° C et protégés de la lumière jusqu'à imagerie des cellules.

7. Imagerie au calcium

1. Culture antérieure, préparer des lamelles de verre de 25 mm de diamètre. Mettez les lamelles dans 70% d'éthanol pendant 48 h pour éliminer toute graisse et saleté de la surface, ce qui réduit l'adhérence cellulaire à la lamelle.
2. Après avoir rincé les couvre-plantres avec de l'eau, remettez-les dans l'eau et stérilisez-les (autoclavés).
3. Mettez un lamelleau par plaque de culture de 3,5 cm et laissez-les sécher. Rangez les boîtes de Petri pour d'autres expériences ou utilisez-les immédiatement.
4. Ajouter les myoblastes transfectés (5 - 6 x 10 ⁵ cellules) à la lamelle de verre.
   Note: Les expériences sont effectuées 24 à 48 h après l'introduction de la différentiationSur, ou sur des myoblastes proliférants.
5. Pour effectuer l'imagerie Ca ²⁺ , laver les cellules 2 fois avec du PBS ou directement avec le milieu utilisé pour les expériences (milieu contenant du calcium, tableau 3 ). Chargez les cellules avec 2 uM de Fura-2 / AM plus 1 μM d'acide pluronique pendant environ 30 minutes dans l'obscurité à la température ambiante.
   Note: L'acide pluronique aide à solubiliser le Fura-2. Fura-2 / AM et l'acide pluronique sont dissous dans le milieu contenant du calcium.
6. Lavez les cellules deux fois dans le même milieu mais sans Fura-2 / AM et l'acide pluronique et laissez-les dans l'obscurité pendant 10 à 15 minutes supplémentaires pour permettre la désestérification de Fura-2 / AM.
7. Si l'efficacité de chargement de Fura-2 est trop faible, ajoutez plus de Fura-2 ( par exemple, 4 μM) et / ou incupez les cellules pendant plus longtemps ( p. Ex. 40 min).
8. Retirez le lamelle de la plaque de culture et installez-la dans la chambre expérimentale. Ajouter ~ 1 ml de milieu contenant du calcium (selon le volume de l'expérienceChambre mentale). Installez-le sur le microscope et démarrez l'enregistrement.
   Note: La sonde sensible au Ca ^{2 +} fluorescente Fura-2 est excitée alternativement à 340 nm et 380 nm, et la lumière d'émission est recueillie à 510 nm. Comme les fluctuations de la concentration de Ca ²⁺ sont relativement lentes, acquérir 1 rapport toutes les 2 s.
9. Pour activer SOCE, on utilise le protocole de ré-addition classique thapsigargine / Ca ²⁺ : laissez les cellules pendant 2-3 min dans du milieu contenant du calcium. Remplacez le milieu par un milieu sans calcium pendant 1 à 2 minutes.
   1. Ajouter 1 μM de thapsigargine pour épuiser les magasins de calcium internes.
      Note: La thapsigargine est un bloqueur irréversible de l'activité de la pompe à l'ATPase Ca ²⁺ ATPase sarco-endoplasmique (SERCA). Après 8 à 10 minutes, remplacer rapidement le milieu par le milieu contenant du calcium. Ca ²⁺ entrera dans les cellules via les canaux SOCE. Attendez environ 5 min avant de terminer les expériences.
      ATTENTION: Thapsigargin est un composé toxique qui doit être manipulé avec des gants.

8. Analyse de mesure de Ca ²⁺

Remarque: Effectuez l'analyse avec le logiciel d'acquisition.

1. Ouvrez l'expérience. Dessinez la région 1 dans une zone où il n'y a pas de cellules (région d'arrière-plan) et dessinez les autres régions dans le cytoplasme des cellules à analyser (les régions peuvent être dessinées sur n'importe quelle image: 340 nm, 380 nm, Ou l'image ratio). Passez à "Exécuter des expériences"> "images de référence". Sous les canaux 340 et 380, sélectionnez "région 1", puis cliquez sur "Soustraire l'arrière-plan".
2. Exécutez toute l'expérience (F4: avant) pour vous assurer que rien n'interfère avec la région de fond, comme un point de poussière fluorescent qui se déplace dans la région d'arrière-plan et que les cellules ne bougent pas pendant le temps des expériences.
   Note: Les régions d'intérêt sélectionnéesNe devrait pas inclure les zones sombres; Sinon, la valeur du rapport apparaîtra bruyante, dans le cadre de l'analyse, seront inclus dans la mesure.
3. Cliquez sur «Log data» et rejouez l'expérience complète.
   Remarque: Cela ouvrira une feuille de calcul dans laquelle l'heure et le ratio sont enregistrés. Il est également possible de sauvegarder les longueurs d'onde individuelles de 340 nm et 380 nm.
4. Pour obtenir des informations sur SOCE, extrayez les deux paramètres importants de l'expérience: l'amplitude de la ré-addition de Ca ²⁺ et la pente de la phase d'entrée Ca ²⁺ ( Figure 3 ).
5. Obtenez l'amplitude en soustrayant la valeur du rapport juste avant la ré-addition de Ca ²⁺ de l'amplitude maximale de l'élévation du Ca ²⁺ . Obtenez la pente maximale en ajustant une régression linéaire des premières secondes après la ré-addition de Ca ²⁺ .
   Remarque: La zone sous la courbe de la réponse thapsigargine est également un paramètre informatif pour extracT, car il reflète la quantité de calcium libre stockée dans le SR.

Résultats

Après la dissociation enzymatique d'un échantillon de muscle humain, les cellules ont été amplifiées dans GM. Les myoblastes humains, définis comme CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, ont été obtenus après FACS. Les myoblastes représentaient plus de 60% de la population analysée ( figure 1 ). Les myoblastes humains primaires ont été reconstitués, cultivés en confluence et cultivés en DM pendant 48 h. Après immunocoloration pour l'expression du facteur de transcription MEF2 et de la c...

Discussion

L'isolement et la culture des myoblastes humains à partir du muscle squelettique adulte offrent un modèle in vitro pour étudier la différenciation musculaire et la régénération musculaire. Dans cet article, nous fournissons un protocole qui permet de purifier les rendements élevés de myoblastes humains d'une manière simple et limitée en termes de coûts. En outre, cette technique fournit des résultats fiables et reproductibles en termes de pourcentage de myoblastes isolés...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Jambon s F10	ThermoFisher Scientific	31550-023
FCS	ThermoFisher Scientific	10270-106	Lot 41G5532K
BSA	Sigma	O5482
fétuine	Sigma	F3385
EGF	Corning	354001
Dexamethansone	Sigma	D1756
Insuline	Sigma	I9278
Créatine	Sigma	27900
Pyruvate	Sigma	P4562
Uridine	Sigma	U3003
Gentamycine	ThermoFisher Scientific	15710-049
Trypsine-EDTA 0,05 %	ThermoFisher Scientific	25300-062
70 &mu ; crépine à cellules m	Falcon	352350
40 &mu ; crépine à cellules m	Falcon	352340
Falcon 50  ; mL tube	Falcon	352070
Falcon 15  ; mL tube	Falcon	352096
Falcon 5  ; Tube mL (FACS)	Falcon	352058
Milieu de culture : OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	31985-047
Réagnt transfectant : RNAiMax	ThermoFisher Scientific	1756064
PBS	ThermoFisher Scientific	14190-094
Milieu de montage	Fluka	10981
Anti-MyHC de souris *	DSHB	MF20  ;	concentrer
Souris anti-myogénine	BD Pharmigen	556358
Lapin anti-MEF2	Santa Cruz Biotech	C-21
Chèvre anti-souris Alexa488	ThermoFisher Scientific	A11029
Chèvre anti-lapin Alexa 546	ThermoFisher Scientific	A11035
Souris anti humaine CD56-Alexa488	BD Pharmingen	557699
Souris anti humaine CD146-PECy7	BD Pharmingen	562135
Souris anti humaine CD45-PE-CF594	BD Pharmingen	562279
Souris anti humaine CD34-APC	BD Pharmingen	345804
Souris anti humaine CD144-PE	BD Pharmingen	560410
Souris Alexa Fluor 488 IgG1k	BD Pharmingen	557702
souris PECy7 IgG1k	BD Pharmingen	557872
PE-CF594 souris IgG1k	BD Pharmingen	562292
souris APC IgG1k	BD Pharmingen	550854
souris PE IgG1k	BD Pharmingen	556650
DAPI	Sigma	D9542	ATTENTION :  ; composé toxique
Paraformaldéhyde	Fluka	762400
Fura-2 AM	ThermoFisher Scientific	F1201
Pluronic F-127	ThermoFisher Scientific	P3000MP
Thapsigargin	Sigma	T9033	ATTENTION  ;: composé toxique  ;
Logiciel d’acquisition d’imagerie par rapport : Metafluor 6.3	Molecular Device
* : MF 20 a été déposé sur le DSHB par Fischman, D.A.  ;