Article de méthode

UNE

DOI :

10.3791/55939

⸱

26 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un dosage spécifique de Caenorhabditis elegans conçu pour évaluer les changements dans le comportement d'aversion au cuivre et la capacité de localiser une source alimentaire commune, à mesure que l'organisme progresse d'un état nutritionnel nourri à un affamé.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour assurer la survie, les organismes doivent être capables d'éviter des habitats défavorables tout en assurant une source alimentaire constante. Caenorhabditis elegans modifie ses caractéristiques locomotrices lors de la détection de divers stimuli environnementaux et peut moduler leur suite de réponses comportementales en réponse à des conditions de famine. Les nématodes présentent généralement une diminution de la réponse aversive lorsqu'ils sont éliminés d'une source alimentaire pendant plus de 30 minutes. L'observation des changements comportementaux en réponse à un état nutritionnel changeant peut donner un aperçu des mécanismes qui régulent la transition d'un état bien nourri à un état affamé.

Nous avons développé un dosage qui mesure la capacité d'un nématode à traverser une barrière aversive ( c.-à-d. Le cuivre) puis atteindre une source alimentaire pendant une période prolongée. Ce protocole s'appuie sur les travaux antérieurs en intégrant plusieurs variables d'une manière qui permet une collecte continue de données lorsque les organismes se déplacent vers unN condition de plus en plus affamé. En outre, ce dosage permet une augmentation de la taille de l'échantillon afin que les populations de nématodes plus grandes puissent être évaluées simultanément.

Les organismes défectueux pour détecter ou répondre au cuivre traversent immédiatement la barrière chimique, alors que les nématodes de type sauvage sont initialement repoussés. Comme les vers de type sauvage sont de plus en plus affamés, ils commencent à traverser la barrière et à atteindre la source de nourriture. Nous avons conçu ce dosage pour évaluer un mutant incapable de répondre à des indices environnementaux divers, y compris la sensation alimentaire ou la détection de produits chimiques aversifs. Lorsqu'ils ont été évalués via ce protocole, les organismes défectueux ont immédiatement traversé la barrière, mais ont également été incapables de détecter une source de nourriture. Par conséquent, ces mutants traversent à plusieurs reprises la barrière chimique malgré une entrée temporaire d'une source alimentaire. Ce test permet de tester directement les populations de vers afin d'évaluer les défauts potentiels liés à l'aversion et à la famine.

Introduction

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Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour l'étude de la neurobiologie pendant des décennies en raison de la facilité relative dans l'analyse des circuits d'un système nerveux composé de seulement 302 neurones 1 . Pourvu que l'organisme dépend de la réponse aux signaux environnementaux, une grande partie du système nerveux est dédié à la régulation de l'intégration des signaux environnementaux 2 . Malgré la simplicité de son système nerveux, C. elegans peut détecter et répondre à divers signaux environnementaux, y compris les répulsifs 3 , les attractifs 4 , la température 5 et même l'humidité 6 . Un échec à intégrer correctement les signaux environnementaux a été lié à un certain nombre de troubles du comportement et des états neurodégénératifs dans les systèmes modèles de mammifères 7 à 9 . Avec une gamme de modèles disponibles de maladies neurales 10 dans C. elegans et le développement des écrans pharmaceutiques de nématodes 11 , cet organisme s'est avéré être un système utile pour l'étude de la neurobiologie. Compte tenu de la disponibilité d'un connecteur 1 de nématode cartographique et de mutations de presque tous les gènes du génome 12 du nématode, notre compréhension du système nerveux des nématodes et, par extension, est partiellement limitée par la conception d'essais créatifs appropriés.

Un certain nombre de tests de chimiotaxis ont été développés au cours des 40 dernières années pour évaluer la réactivité des nématodes à divers stimuli aversifs 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . L'expérimentation initiale impliquait l'introduction d'une stimulation environnementale aiguë tandis qu'un seul ver gremed sur une plaque d'agar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Les modifications immédiates apportées aux réponses locomotrices ont été enregistrées. Par exemple, l'octanol odorant volatil peut être appliqué sur un cheveu et flanqué devant le nez d'un nématode pour stimuler l'initiation de la locomotion vers l'arrière dans les vers sauvages 17 . Des tests plus complexes ont également été développés pour incorporer de multiples variables comme moyen d'évaluer le choix du comportement 18 . Une variation de ce dosage implique l'utilisation d'une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive 4 . Un attirant, à savoir le diacétyle, a été placé d'un côté de la barrière chimique avec des vers transférés à l'écart de la source de diacétyle. Les vers défectueux pour les réponses aversives au cuivre ont immédiatement traversé la barrière pour atteindre le diacétyle, tandis que les vers de type sauvage ont d'abord été repoussés par la barrière. Les réponses ont été marquées lorsque les vers se sont approchés de la barrière de cuivreSans observations à long terme.

Lorsque les vers sont évalués après avoir subi des conditions de famine, leur sensibilité aux stimuli environnementaux diminue 19 . Lorsque l'octanol chimique aversif est flotté devant le nez des nématodes, les organismes de type sauvage stimulent le mouvement vers l'arrière en 3 à 5 s lorsqu'ils sont alimentés. Après que ces organismes ont été retirés des aliments pendant 10 min, ils présentent une réponse retardée de 8 à 10 s 20 . Ainsi, avec une famine accrue, les nématodes affichent une diminution de la réponse aversive aux signaux environnementaux nuisibles car la recherche d'aliments devient plus essentielle à la survie. À l'inverse, les nématodes qui exagèrent le récepteur neuropéptidique 9 ( npr-9) ne répondent pas à l'octanol sur ou hors de l'alimentation et présentent une incapacité à répondre à un certain nombre de stimulants aversifs 21 . Ces organismes npr-9 (GF) ne modulent pas non plus leur fréquence d'inversion en présence d'aliments, mais peuventInversée en réponse à des stimulations tactiles sévères indiquant qu'elles sont capables de se déplacer vers l'arrière 21 . Nous avons également évalué les mutants npr-9 (LF) étant donné qu'ils présentent une fréquence d'inversion anormalement diminuée des aliments, mais peuvent moduler leur comportement en présence de nourriture 21 . Le couplage de l'état nutritionnel du ver avec l'introduction de stimuli externes aiguë a aidé à élucider les mécanismes par lesquels une voie alimentaire peut moduler largement les voies de signalisation sensorielle 22 , 23 . La présence d'aliments dans l'environnement des nématodes a également été utilisée pour évaluer les réponses au retrait de l'éthanol 24 . Dans cette expérience, les vers ont été incubés à différentes concentrations d'éthanol, puis ont été placés sur une plaque d'agar avec un morceau de nourriture connu sous le nom de "test de race alimentaire". Le patch alimentaire a été placé sur un bord de la plaque alors que les nématodes wÉtaient séparés de la source de nourriture. Le retrait de l'éthanol a été évalué en mesurant la durée de temps nécessaire pour que les vers atteignent le morceau de nourriture.

Ce test d'aversion en cuivre à base de nutriments s'appuie sur l'analyse alimentaire pour intégrer d'autres variables environnementales, à savoir l'alimentation et le cuivre, tout en évaluant les changements de comportement dans le temps. Il s'agit d'une adaptation d'un protocole communément utilisé dans la communauté de C. elegans 4 . Ce protocole a été utilisé pour évaluer les réponses aversives et la détection des aliments sur une période de quatre heures 21 . Étant donné que les comportements de famine de l'exposition de ver après 30 minutes de privation de nourriture 25 , nous sommes également en mesure d'évaluer comment les changements d'état nutritionnel peuvent influencer les réponses environnementales. Les conditions de ce dosage mesurent la façon dont les organismes expérimentaux changent de réactivité aux stimuli aversifs au fil du temps, ce qui évalue les changements de comportement commeLes organismes progressent vers un état affamé (et des mesures continues de la famine prolongée). Étant donné que les animaux npr-9 (GF) ne modifient pas leur comportement en réponse à de la nourriture ou de nombreux indices aversifs, nous avons cherché à identifier si ces déficits comportementaux persisteraient dans le contexte de la famine. En fin de compte, cette conception de dosage a été formulée pour évaluer spécifiquement les mutants npr-9 (GF) mais peut être davantage adaptée pour caractériser également de nouvelles souches.

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Protocole

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1. Préparation des organismes expérimentaux

  1. Choisissez 10 nématodes en phase L4 par souche 24 h avant de commencer l'essai afin de s'assurer que les organismes sont de jeunes adultes lorsqu'ils sont testés. Pour chaque mutant ou nématode de contrôle testé, choisissez 10 L4 (10 pour le contrôle et 10 pour l'essai).
    1. Maintenir les organismes L4 en utilisant des méthodes standard 26 , 27 pendant 24 h sur des plaques de gélose standard ensemencées avec OP50 Escherichia coli . Si des organismes sont perdus pendant les étapes de lavage suivantes, compensez en augmentant la taille de l'échantillon de départ ( c.-à-d., Choisissez 20 vers plutôt que 10).
      Note: Le comportement est un phénotype indépendant. Effectuez la méthode en trois exemplaires pour chaque souche sur trois jours distincts. Inclure des souches de contrôle supplémentaires et des conditions pour de nouvelles souches, comme l'a souligné la section de discussion.
  2. Immédiatement avant l'analyse, transférer l'orga expérimentaleÀ une plaque de gélose sans bactéries et permet aux nématodes de se déplacer librement pendant 1 min pour éliminer les excès de bactéries.
    1. Si les organismes expérimentaux ont subi des conditions de contamination pendant les 24 heures précédant l'essai, les jeter.
  3. Pipetter 1 mL de M9 sur la plaque sans bactéries pour laver les vers dans un tube à microcentrifugeuse.
  4. Centrifuger à 3 000 xg pendant 1 min. Les vers doivent former une pastille au bas du tube. Aspirer la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 mL de M9 à la pastille de ver, inverser le tube pour mélanger les vers avec la solution.
  5. Répétez les étapes 1.4 trois fois de plus.
    1. Si l'excès de bactéries a été initialement transféré avec les vers, répétez pour un total de 5 fois. Aucune bactérie ne doit être transférée aux plaques de cuisson de cuivre. Si les aliments sont transférés à la plaque de dosage, cela entravera la collecte précise des données.
  6. Après le lavage final, aspirer le surnageant jusqu'à 10081; L de M9 et la boulette de ver est restée.
    Attention: les comportements liés à la famine deviennent évidents après 30 min. Par conséquent, les vers doivent être immédiatement transférés de la solution une fois que les étapes de lavage ont été achevées.

2. Préparation des plaques de dosage

  1. Préparer des plaques d'agar NGM standard deux jours avant l'essai.
    1. Si les plaques sont conservées dans un environnement humide, faire des plaques d'agar 3 jours avant le dosage. Sinon, retirez le couvercle de la plaque pendant 3 à 6 h pour assurer une sécheresse adéquate (si dans un environnement stérile).
  2. Avec un marqueur permanent épais, faites une ligne sur la face inférieure de la plaque le long du bord extérieur et une autre pour former une barrière intermédiaire ( Figure 1 ). La barrière de ligne médiane doit être équidistante de chaque bord de la plaque. Utilisez une règle pour assurer des mesures précises. Ces lignes serviront de guide lors du transfert de bactéries et de la solution de cuivre. À condition queE. coli est transféré avant la solution de cuivre, ces lignes serviront d'indicateurs.
  3. Plaque de semence avec 50 μL d'OP50 E. coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme ( Figure 2 ). La concentration bactérienne devrait rester constante dans les dosages; Cependant, une faible variabilité a été observée en réponse à des différences légères de concentration.
    1. Utilisez les lignes marquées sur la partie inférieure de la plaque pour s'assurer que les bactéries ne sont pas en contact avec la solution de cuivre. Pourvu que la solution de cuivre traverse le bord de la plaque et forme une barrière de ligne médiane, transférez les bactéries afin que la solution de cuivre ne soit pas en contact avec la source de nourriture.
  4. Marquez un deuxième ensemble de plaques et ne transférez pas de E. coli OP50 ( Figure 2 ). Ces plaques serviront à évaluer le contrôle négatif. Ces plaques devraient également avoir unMarquant sur une moitié de la plaque pour indiquer l'origine initiale du transfert.
  5. Permettre aux bactéries de sécher puis d'incuber les plaques à 37 ° C pendant une nuit. Assurez-vous que les taches bactériennes ne sont pas perturbées lors du transfert vers un incubateur ou une pièce de 37 ° C. Une perturbation excessive pourrait altérer l'emplacement ou la forme du patch alimentaire.

3. Test de chimiotaxie

  1. Préparer à nouveau une solution de sulfate de cuivre (II) 0,5 M avant l'heure de début du dosage. Pourvu que 125 μL de la solution soit utilisé par plaque, augmenter ce volume en fonction du nombre de plaques de dosage utilisées ( par exemple, 5 plaques de dosage, 625 μL).
  2. Pipetter 100 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) sur le bord de la gélose pour créer une barrière extérieure en cuivre. Le dessous marqué de la plaque devrait servir de guide.
  3. Pipettez 25 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) pour créer une barrière de ligne médiane.
    1. Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre (II) neEs pas entrer en contact avec le patch bactérien. Utilisez une technique tachetée, car les rayures peuvent affecter la locomotion en raison des indentations / rayures sur la gélose.
  4. Laisser sécher la solution de cuivre sur la plaque. La période peut varier en fonction des conditions de la plaque et du laboratoire. Vérifier visuellement la sécheresse toutes les 5 minutes après le transfert.
    Remarque: La solution de cuivre présente une teinte bleuâtre et est facilement identifiable. Utilisez un mouchoir de laboratoire pour mouiller légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner la sécheresse.
  5. Pipettez 20 μL de la pastille de ver du bas du tube sur la moitié libre de bactéries de la plaque de dosage.
    1. Assurez-vous que 10 vers sont transférés à la plaque de dosage. Si des vers supplémentaires ont été inclus accidentellement, retirez-les en choisissant avec de l'huile d'halocarbon pour s'assurer qu'aucune bactérie ne soit ajoutée à la plaque. Chaque dosage devrait avoir un nombre constant de nématodes pendant le dosage.
      REMARQUE: si trop peu de vers sont transfA commis une erreur lors des essais, l'augmentation de la taille initiale de l'échantillon permettra d'atténuer les pertes potentielles lors des lavages et des transferts.
  6. Retirer l'excès de M9 de la plaque avec un tissu de laboratoire. M9 ne devrait pas entrer en contact avec la solution de sulfate de cuivre (II).
    Attention: assurez-vous que les vers et la surface de la gélose ne sont pas affectés lors de cette étape. Si utilisé trop dur, le tissu de laboratoire peut créer des indentations sur la surface de gélose de la plaque et peut éliminer les vers. Les vers accidentellement éliminés via KimWipe doivent être éliminés.
  7. Une fois que la solution M9 a été retirée et que tous les vers ont commencé des modèles de locomoteurs non liquides, démarrez le chronomètre d'essai.
    1. Optimalement, retirer la solution M9 dans un min. Le paramètre essentiel est l'identification de la locomotion sinusoïdale. Les vers englobent différemment, p . Ex. Battant plutôt que sinusoïdal, lorsqu'ils sont liquides. Commencez le chronomètre d'essai une fois que chaque organe expérimentalL'iso ne cesse de se débattre.
  8. Vérifier les plaques d'essai toutes les 30 min.
    1. Pour les plaques de dosage avec des taches bactériennes, on obtient des grappes positives s'ils atteignent le patch alimentaire sur une période de 4 h. Pour les plaques de contrôle négatives, marquer positivement les organismes s'ils ont traversé la barrière.

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Résultats

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Nous avons utilisé une souche de surexpression de type sauvage (N2), npr-9 (tm1652) et npr-9 , c'est -à- dire npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), pour évaluer les réponses à la famine et à l'aversion au cuivre. Les organismes de type sauvage sont capables de détecter et de répondre à la barrière de cuivre aversive, tandis que les mutants npr-9 (GF) n'initialisent pas une répo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette conception de dosage modifie l'essai de course alimentaire 24 pour inclure une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive et autour du bord de la plaque pour empêcher une perte de nématodes. Les organismes sont testés pour leur capacité à traverser la barrière aversive et à atteindre un patch alimentaire sur une période de 4 h. Dans le contexte de npr-9 (GF) , nous avons utilisé ce dosage pour évaluer comment les conditions de famine pourraient affecte...

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Déclarations de divulgation

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Nous n'avons rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 à William G. Bendena.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O à 1 litre. Autoclaver pour stériliser avant utilisation.]Produit en laboratoire
Sulfate cupriqueSigmaC-1297Utiliser de l'eau pour suspendre de manière appropriée à une concentration de 0,5 M

Références

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Mots-clés

Analyse de l tat nutritionnelNeurosciences comportementalesLocomotion des n matodesD tection de la source alimentaireR ponse chimique aversiveTests en condition de je nevaluation du ph notype mutantP riode prolong e

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