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Article de méthode

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

7.6K vues

DOI :

10.3791/55942

15 décembre 2017

Dans cet article

Résumé

Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.

Résumé

Les modèles murins de la maladie sont indispensables à la recherche scientifique. Cependant, nombreux outils de diagnostic telles que l’endoscopie ou d’imagerie tomographique ne sont pas employés couramment dans des modèles animaux. Afficheurs expérimentales classiques reposent souvent sur des analyses post-mortem et ex vivo , qui empêchent les examens de suivi intra-individuelle et augmentent le nombre d’animaux d’étude nécessaires. Fluorescence induite par la tomographie permet l’évaluation non invasive, répétitive, quantitative tridimensionnelle des sondes fluorescentes. Il est très sensible et permet l’utilisation de fabricants de moléculaires, qui permet la détection spécifique et la caractérisation des cibles moléculaires distinctes. En particulier, les sondes ciblées représentent un outil innovant permettant d’analyser l’expression des gènes d’activation et de protéine dans l’inflammation, maladie auto-immune, infection, maladies vasculaires, la migration cellulaire, tumorigenèse, etc.. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées sur cette technologie d’imagerie sophistiquée de in vivo de détection et de caractérisation de l’inflammation (c.-à-d., infiltration de macrophages F4/80-positif) dans un modèle murin largement utilisé de inflammation intestinale. Cette technique peut également être utilisée dans d’autres domaines de recherche, comme suivi de cellule ou des cellules souches immunitaire.

Introduction

Modèles animaux sont largement utilisés dans la recherche scientifique, et de nombreuses méthodes non invasives existent pour moniteur activité de la maladie et de la vitalité, tels que la quantification des changements de poids corporel ou l’analyse de sang, urine et les fèces. Cependant, ce sont uniquement les paramètres de substitution indirecte qui sont également sujettes à la variabilité interindividuelle. Ils doivent souvent être complétées par des analyses post-mortem du spécimen de tissu, ce qui empêche la série observation aux périodes répétitives et dirigent observation de physiologique ou pathologique traite in vivo. Des techniques d’image....

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, selon la loi allemande de Protection animale (Tierschutzgesetz).

1. les matériaux et montage expérimental

  1. Soins aux animaux.
    1. Utilisez souris sexe - et appariés selon l’âge de n’importe quelle contrainte DSS-sensibles (p. ex., C57BL/6) à 20-25 g de poids corporel.
    2. Plan d’au moins cinq ou plusieurs souris par groupe expérimental et maison les souris selon les lignes directrices locales de soins aux animaux.
    3. Fournir un chow rongeur standa....

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Résultats

Évaluation de colite :

La colite induite par le DSS est un modèle murin induit chimiquement de l’inflammation intestinale qui ressemble à EIA humain et mène à la perte de poids, des saignements rectaux, ulcération superficielle et altération de la muqueuse dans des souris sensibles15. Il est particulièrement utile étudier la contribution du système immunitaire inné au développement de l’i.......

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Discussion

Bien que les techniques d’imagerie médicale ont rapidement évolué ces dernières années, nous sommes encore limités dans notre capacité à détecter des processus inflammatoires ou tumeurs, ainsi que d’autres maladies, dans leurs premiers stades de développement. Cependant, c’est crucial pour la croissance tumorale compréhension, invasion, ou développement de métastases et des processus cellulaires dans le développement de troubles inflammatoires et maladies dégénératives, cardiovasculaires et immunologiques. Alors que les .......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Mme Sonja Dufentester, Mme Elke Weber et Mme Klaudia Niepagenkämper pour son aide technique.

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Reagents
Allulfa-free-dietHarlan Laboritories, Madison, USA2014
Bepanthen eye pommentBayer, Leverkusen, Germany80469764
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneE 9884
Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, AllemagneB506
Haematoxylin  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneHHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek compound  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Sakura, Zoeterwonde, Pays-Bas4583fixateur pour analyses histologiques
Saline tamponnée au phosphate, PBSLonza, Verviers, Belgique4629
Chlorure de sodium 0,9 %Braun, Melsungen, Allemagne5/12211095/0411
Bicarbonate de sodium en poudreSigma Aldrich Deisenhofen, AllemagneS5761
Régime standardAltromin, Lage, Allemagne1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Pays-Bas4566
Hemoccult (test sur papier au gaïac)Beckmann Coulter, Allemagne3060
Biotine rat-anti-souris anti-F4/80anticorps Serotec, Oxford, Royaume-UniMCA497B
Biotine rat-anti-souris anti-GR-1  ;BD Pharmingen, Heidelberg Allemagne553125
Streptavidin-Alexa546, Darmstadt, AllemagneS-11225excitation/émission maximale :  ; 556/573nm
Anticorps anti-rat-anti-souris CD11b TCCalteg, Burlingame, États-UnisR2b06
Anticorps F4/80 anti-souris purifiéBioLegend, Londres, Royaume-Uni123102
DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneD9542
Anticorps anti-Ly6C anti-souris conjugué FITCBD Pharmingen, Heidelberg, Allemagne553104
tampon FACSBD Pharmingen, Heidelberg, Allemagne342003
Cy7 NHS EsterGE Healthcare  ; Europe, Fribourg, AllemagnePA17104
MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, AllemagneK 6631B
Cy5.5 labellisé anti-souris F4/80anticorps BioLegend, Londres, Royaume-Uni123127prêt à l’emploi Anticorps marqués (alternative)
Antigène F4/80 antigène anti-souris PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, États-Unis45-4801-80prêt à l’emploi étiqueté Anticorps (alternative)
DMSO (sulfoxyde de diméthyle)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne67-68-5
IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne792632
ÉthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne64-17-5
Albumines sériques bovines (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneA4612
Tris Solution saline tamponnée (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneSRE0032
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Equipment
FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Allemagne
FMT 2000 Système d’imagerie in vivoPerkinElmer Inc., Waltham, MA, États-UnisFMT2000
Logiciel d’analyse d’imagerie True Quant 3.1PerkinElmer Inc., Waltham, MA, États-Unisinclus dans FMT2000
Microscope fluorescent Leica DMLBLeica,  ; 35578 Wetzlar, Allemagne  ;DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, AllemagneHD 2070Absorbeur à ultrasons
Scalpel jetable No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneZ692395-10EA
Ciseaux Metzenbaum 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Allemagne22398330
seringue luer lock 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneZ248010
aiguilles à seringueSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AllemagneZ192368  ;
Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgique352070
Sondes moléculaires

Références

  1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J.

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Réimpressions et autorisations

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